Summary
新生小鼠视网膜提供了一个很好的特点生理血管生成模型，它允许不同的基因或药物，在调节血管生成的角色的调查
Abstract
血管生成是定义新的血管形成新血管从预先存在的血管网发芽的复杂过程。血管生成中起着关键作用不仅在器官和组织的正常发育，而且在许多疾病中，血管的形成是失调，如癌症，失明和局部缺血性疾病。在成年生活中，血管通常是静态的，因此血管生成是尝试和调节新血管的形成，特别是在疾病新型药物开发的重要目标。为了更好地了解血管新生，并制定相应的战略来调节，模型，准确地反映了不同的生物所涉及的步骤。小鼠视网膜新生血管生成提供了一个很好的模型，因为动脉，静脉和毛细血管的发展在出生后的第一周，形成血管丛。该模型还具有的优点是具有双 - 二mensional（2D）结构简单的决策分析较复杂的三维解剖其他血管网络。通过分析视网膜血管丛出生后在不同的时间，它是在显微镜下可以观察到的血管生成的各个阶段。本文演示了一个简单的流程分析荧光染色法，凝集素和血管特异性抗体的小鼠视网膜血管。
Introduction
血管生成是一种复杂的发育过程中，定义通过从预先存在的血管网形成新的血管，并通过多条信号通路的调节。其中最突出的是VEGF通路。血管内皮生长因子释放由缺血性细胞，导致血管生成的启动，在相邻的血管发芽。领先的内皮细胞从一个新的血管芽是'冰山'细胞，产生对VEGF的来源，伸出伪足，其次是'茎'内皮细胞增殖。在这种方式中，活化的内皮细胞迁移和增殖实现的无血管区域，在那里形成新血管管。为了稳定，以支持这些管子的血流量，血管内皮细胞与周皮细胞和平滑肌细胞，围绕新的血管1。胚胎的血管形成及组织生长的血管生成是必不可少的。然而，它也有助于许多pathologi卡尔疾病，如癌症，而在血管生成中的缺陷与缺血性疾病。因此，开发有效的药物治疗作为治疗疾病的一种手段，是调节血管生成的极大兴趣。例如，有效的抗血管生成因子将减少癌的生长，而促血管生成的策略可以用于治疗缺血性疾病。因此，必须更好地了解新血管的形成和开发新的治疗策略，以提高或降低血管生长调节血管生成模型。
血管新生研究的基本要素是选择一个合适的血管模型。许多体外模型的目的是为了再现血管生成的基本步骤，如血管内皮细胞的迁移，增殖和存活2,3。 在体外试验中经常使用的一种是有支链的网络上的基底膜基质的血管内皮细胞的形成，虽然吨他的是不特定的内皮细胞，也不会通常包含周细胞或平滑肌细胞的支持。评估体外芽生式血管生成，如胚体的测定，主动脉环测定和胎 儿跖骨检测小鼠器官培养允许的上下文中的额外的支持细胞，血管内皮细胞的血管生成的分析。然而，这些检测方法的主要限制包括血流量不足，并随着时间的推移回归的船只，给一个有限的窗口进行分析。因此，更准确地了解血管生成的调控， 在体内模型中是必需的，如那些在小鼠皮下植入的海绵或基底膜插头开发，以及后肢缺血模型。然而，这些模型是具有挑战性的分析，由于复杂的三维结构的新生血管。与此相反，已证明斑马鱼胚胎的一个很好的模型可视化的血管生成在整个生物体4。然而，进化更密切相关的人类比斑马鱼鼠标，让鼠标在许多情况下，一款首选机型。因此，出生后小鼠视网膜血管生成是一个很好的特点的血管生成研究的首选方法。它不仅提供了生理的设置，但也是一个二维的血管丛，可以很容易地可视化使用适当的荧光染料。血管网，血管内皮细胞增殖，发芽，血管周围细胞的招募和血管重塑的建筑都可以使用这种技术研究。
在新生小鼠视网膜，视网膜血管的发展发生在出生后的第一周。小鼠与人类不同的是，是天生的盲人和视网膜血管的出生后。视网膜血管产生的视网膜的中心靠近视神经在出生后的第0天（P0），血管生成和发展，形成高度组织ð血管丛到达视网膜周边约P8 5。在其特有的方式与毛细管丛逐渐成长从视盘向外朝向的外周，以产生一个有规律的交替模式具有介于其间的毛细血管网的动脉和静脉血管的发展。视网膜血管提供了一个理想模型来研究血管新生的血管可以很容易地确定，因为他们成长在什么本质上是一个二维平面，从而使得它比较容易检查视网膜血管台安装准备5。已报道的方法，在数小时内体外内皮小费细胞反应进行分析隔离小鼠新生儿的视网膜6。另外，需要更详细的调查整个视网膜血管和相关的血管标记免疫组的视网膜固定的标本在不同的发展阶段。
在这里，我们提供详细描述了一个可靠的和技术上直线前进的方法，我们使用整装染色小鼠视网膜血管丛，从最初的眼球摘除产后眼（7）通过染色协议到最终成像显微镜下。
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Protocol
所有步骤都在室温下进行，除非另有说明。
1。产后的眼睛剜除术和固定
- 将人道扑杀鼠标小狗在其一侧，清除皮肤覆盖在眼睛上，用剪刀。
- 使用剪刀和镊子，enucleate眼睛。
- 将剪刀低于去核的眼睛，切开视神经及周围组织，并取出眼球。转移至24孔板中，含有4％多聚甲醛（PFA），在室温下在2×PBS。
- 允许每只眼睛定为10 - 15分钟，然后转移到寒冷的2倍PBS在冰5 - 10分钟。这是最好错开切除，和随后的固定，以确保固定的程度等于为每只眼睛。
2。产后小鼠视网膜解剖
- 传输到培养皿中含有2倍PBS眼中已削减到扩大缸径和下DISSE的地方用塑料巴斯德吸管cting显微镜。
- 眼部周围使用镊子和剪刀移除任何脂肪。
- 皮尔斯在角膜边缘锋利的剪刀，切断周围的角膜和虹膜和丢弃。
- 插入视网膜和巩膜之间的镊子，小心不要撕裂视网膜删除巩膜。脉络膜层也可以被除去，但是，如果有一个在此步骤中发生的视网膜损害的风险，可以留在脉络膜层，因为它不应该显着影响的免疫染色的质量。
- 取下镜头并使用镊子玻璃体。
- 删除的hyaloids血管中心的眼睛聚集在一起，用细镊子，然后迅速拉离视网膜中心（或者玻璃体血管细剪刀剪断基地）。
- 冲洗视网膜PBS在一个干净的培养皿杯形。
- 进行4〜5个放射状切口，达到约2/3半径的视网膜使用弹簧剪刀RS创建一个“花瓣”的形状。
- 绘制PBS使用巴斯德吸管展平视网膜，然后用一小块吸水纸去除任何多余的PBS。
- 吸管慢慢地冷（-20℃）甲醇一滴一滴到视网膜表面，直至完全覆盖，然后提供额外的甲醇洪水。这将有助于修复视网膜，并将促进通透性。视网膜会变成白色。
- 转移到2毫升，已被切割拓宽孔用塑料巴斯德吸管管。
- 在寒冷的甲醇离开视网膜至少20分钟，然后再继续进行染色。这里所用的抗体中，只有VE-钙粘蛋白不能被成功地使用甲醇固定的视网膜。在这种情况下，视网膜需要进行免疫染色步骤9之后的直路。
- 如果需要的话，视网膜可以被存储在甲醇中在-20℃下染色前的数月。
3。免疫/凝集素染色的视网膜仍有合适的lature
- 小心取出/倒出甲醇和轻轻冲洗视网膜短暂PBS（在这个阶段，视网膜仍处于相同的2毫升管从上面的步骤11）。
- 删除PBS和盖视网膜100微升彼尔姆/块解决方案（PBS + 0.3％的Triton + 0.2％BSA）+适当的血清5％（ 见表1），轻轻摇晃1小时。
- 删除权限/座和孵化视网膜轻轻摇动过夜，4℃，100微升（ 见表1）选定的主抗体和/或IsolectinB4，所有准备在彼尔姆/座稀释。
- 取出抗体/凝集素和洗视网膜4×10分钟，PBS + 0.3％TRITON（PBSTX）的。
- 在某些情况下， 例如，下面的染色IsolectinB4的ALEXA488或一个直接结合的一次抗体，第二抗体是不必需的，可以直接安装在视网膜（步骤7）。当未结合的初级抗体被用来在步骤3中，然后加入100μl适当的氟管三基色的第二抗体（稀释1/200 PBSTX）加入时间在4℃下，或在室温下搅拌4小时孵育过夜。
- 拆下二次抗体和视网膜4×15分钟洗在2毫升PBSTX中。
- 视网膜上的幻灯片，使用大口径塑料巴斯德吸管转移和删除多余的PBSTX与吸收剂组织。通过加入50μl的装载视网膜延长封固到盖玻片，轻轻地在视网膜上的位置。
- 转移滑动，在4℃冰箱过夜，以确保它们是平坦的，避光，允许延长封固设置。
- 图片视网膜使用共聚焦显微镜或落射荧光显微镜。
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Representative Results
解剖后的视网膜应该看起来像平坦的花（ 图1）。通过使用上文所述的协议，使用凝集素B4 ALEXA488染色和支持血管平滑肌细胞，用抗α-平滑肌肌动蛋白（ 图2），可以看出，内皮细胞。低功耗的图，使用图2中的5倍的目标允许的视网膜血管组织的概述。此外，通过使用不同的以上的协议在给定的抗体相结合，内皮细胞，用抗CD31免疫染色使用抗NG2（ 图3），结蛋白（desmin）（ 图4）和支持周细胞能够被看见。抗结蛋白染色有用的可视化的手指状突起的周细胞，并确定它们是否与内皮细胞密切相关。与此相反，抗NG2染色概述每个周细胞的细胞核，这是有用的，当量化数周细胞的细胞上的血管。通过每个视场，使用高功率（ 例如，60X）的目标细胞数计数，就可以这样做。如果需要，也可以使用替代的组合的抗体（ 见表1），例如，抗IV型胶原是有用的可视化的血管基底膜。已染色的血管内皮细胞的视网膜血管生成的关键特性，如从中心向边缘的视网膜，血管密度和血管分支频率的脉管系统的进展，可以分析。
图1。外观的新生儿视网膜解剖后立即加甲醇此图片是采取使用蔡司STEMI SV6和Axiocam的人力资源的 C相机。
图2。整个安装视网膜（年龄P7）与小胶质的B4-ALEXA488（绿色）（A）的免疫染色，抗-α平滑肌肌动蛋白的Cy3（红色）（B）或合并（C）。这些图像拍摄蔡司axioimager和HRM Axiocam相机使用5X的目标。 注意动脉及静脉交替格局。动脉确认，立即围绕着他们的毛细管区，都涂有染色阳性（红色），α-平滑肌肌动蛋白的平滑肌细胞。 点击这里查看大图 。
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图3。整装视网膜（年龄P6）与主抗CD31抗体（抗大鼠IgG缀合ALEXA488，绿色，A）;初级抗体和抗NG2检测，检测到与抗兔IgG共轭的双重免疫染色Alexa的594（红，B）。使用60X的目标结合13 Z切片，每张厚度为0.47微米的激光扫描图像，这些图像聚焦。 在 C图像的叠加显示CD31阳性的血管内皮细胞（绿色）和NG2阳性周细胞（红色）， 点击这里查看大图 。
图4。整装视网膜（年龄P6）与主抗CD31抗体（抗大鼠IgG缀合ALEXA488，绿色，A）;初级抗体和抗结蛋白检测，检测到与抗兔IgG共轭的双重免疫染色Alexa的594（红，B）。使用60X的目标结合21Ž切片，每张厚度为0.24微米的激光扫描图像，这些图像聚焦。 在 C图像的叠加显示CD31阳性的血管内皮细胞（绿色）和结蛋白阳性周细胞（红色）。 点击这里查看大图 。
| 主要抗体 | 工作稀释 | 封闭液（精华+彼尔姆/块） | 二次抗体 |
| 反NG2（硫酸软骨素蛋白多糖） 1:250 | 5％山羊血清 | 山羊抗兔Alexa的594 | |
| 抗GFAP | 1:500 | 5％山羊血清 | 羊抗鼠Alexa的488 |
| 抗结蛋白 | 1:500 | 5％山羊血清 | 山羊抗兔Alexa的594 |
| 抗胶原IV | 1:200 | 5％山羊血清 | 山羊抗兔Alexa的594 |
| 抗Endoglin的 | 1:100 | 5％山羊血清 | 羊抗鼠Alexa的594 |
| 抗CD31 | 1:500 | 5％山羊血清 | 羊抗鼠Alexa的488 |
| 抗-VE-cadherin的 | 1:10 | 5％山羊血清 | 羊抗鼠Alexa的594 |
| 反ALK1 | 1:25 | 5％驴血清 | 驴抗山羊Alexa的594 |
| 反ASMA-CY5 | 1:100 | <TD>彼尔姆座N / A |
表1中。初级抗体免疫荧光染色整装视网膜的例子。
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Discussion
这里介绍的方法提供了一个简单而有效的方式来获取图像新生小鼠视网膜染色整装准备，使得它容易量化和生理相关的血管生成模型。最初，老鼠的眼睛是相当困难的，由于其体积小，球形，解剖，所以一些做法和良好的清扫工具都需要可靠的结果。夹层2倍浓度的PBS中制备的眼睛是很重要的，因为这会导致少量的水从眼睛损失，并降低的轨道内的压力，这有利于夹层。良好的准备是非常重要的视网膜有几个原因。首先，维持血管的完整性。第二，如果不能很好地去除玻璃体血管的抗体染色的效率降低，导致高水平的背景，分辨率降低。这个问题也可能发生的视网膜PFA固定时间太长。然而，染色前，长期存储到几个月的时间，在甲醇中在-20℃冷冻箱中是合适的凝集素染色之前和在表1中的抗体的大部分。凝集素染色虽然很少是有问题的，但它确实染色的巨噬细胞，内皮细胞。整装视网膜为了获得良好的免疫染色抗体的选择是至关重要的，必须适应的抗体的特异性和浓度，当使用多克隆抗体时，可能会有所不同批次之间的染色协议。高背景，通常可以减少通过降低抗体的浓度，增加洗涤时间或者添加更多的洗涤剂的洗涤步骤。抗体分装在抵达和存储制造商表示。对于那些存储在-20℃下，一个工作等分试样保存在冰箱中，以避免反复冻融。如果出现明亮的荧光斑点染色标本，尤其是如果这也是目前在该区域周围的组织，这表明本抗体为10,000 rpm下离心5分钟，在使用前应在所有随后的实验中除去沉淀的聚集体的抗体。目前由我们的实验室使用的抗体的材料清单中，用适当的稀释液（ 表1）。选择一个兼容相结合的抗体是非常重要的，以避免不必要的小学和中学的抗体之间的交叉反应。可以监测细胞的增殖，通过给小鼠注射BrdU的大约两个小时的溶液之前收获组织。此胸腺嘧啶类似物结合到增殖的DNA，可以使用特定的抗BrdU抗体检测，如前面所述8。
每个视网膜是很脆弱的，但可以不同血管标记染色处理组织，同时通过协议轻轻。许多控件都包含在每个实验中显示特异性染色。未经治疗的视网膜就会发现组织的自体荧光的程度，这应该是最小的。不初级抗体的控制将允许二次抗体的组织的非特异性结合的测定。在清扫过程中，已小心弄破的，可以提供有用的视网膜组织的控制。安装后，荧光染色法，只要保留数天幻灯片在黑暗中在4℃下储存。通过落射荧光显微镜成像提高了使用的apotome，这消除了聚焦光。另外，激光共聚焦显微镜，提供了准确的小区固有成像（ 图3和4）。
此方法有许多可能的应用。它可以应用到小鼠中，调节血管生成的关键基因被耗尽，包括使用可诱导的Cre-loxP位遗传学8-10。 ，或者视网膜血管可以审问下列药物治疗提供全身或直观内探讨其亲或抗血管生成的影响11。另外，也可以利用现有的转基因工具和使用GFP或RFP转基因小鼠的视网膜血管11,12可视化的关键要素。 （ 需要注意的是1小时，在室温下用4％PFA固定的固定是用在这里的协议的步骤2.12甲醇成像GFP或RFP转基因小鼠在视网膜内源性前。）此外，为了研究分子信号机制，它是有用的，以可视化的mRNA表达的原位杂交13使用特定的基因在视网膜神经。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由威康信托基金和英国心脏基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
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