Summary
Den neonatale murine nethinden giver et godt karakteriseret fysiologisk model af angiogenese, der tillader undersøgelser af de roller, som forskellige gener eller narkotika, der modulerer angiogenese i en
Abstract
Angiogenese er den komplekse proces nye blodkar dannes defineret ved spiring af nye blodkar fra en allerede eksisterende fartøj netværk. Angiogenese spiller en vigtig rolle ikke kun i den normale udvikling af organer og væv, men også i mange sygdomme, hvori blodkar dannes er dysreguleret, såsom kræft, blindhed og iskæmiske sygdomme. I voksenlivet, er blodkar generelt hvilende så angiogenese er et vigtigt mål for nye lægemiddeludvikling at forsøge regulere nye fartøj dannelse specifikt sygdom. For bedre at forstå angiogenese og at udvikle passende strategier til at regulere det, er modeller, der kræves som nøjagtigt afspejler de forskellige biologiske trin, der er involveret. Musen neonatale retina giver en fremragende model af angiogenese fordi arterier, vener og kapillærer udvikler at danne en vaskulær plexus i den første uge efter fødslen. Denne model har også den fordel at have en to-dimensional (2D) struktur gør analyse ligetil sammenlignet med den komplekse 3D anatomi af andre vaskulære netværk. Ved at analysere den retinale vaskulære plexus på forskellige tidspunkter efter fødslen, er det muligt at observere de forskellige stadier af angiogenese under mikroskop. Denne artikel viser en enkel procedure til analyse vaskulaturen af en mus nethinden med fluorescerende farvning med isolectin og vaskulær specifikke antistoffer.
Introduction
Angiogenese er en kompleks udviklingsproces defineret ved dannelsen af nye blodkar fra en allerede eksisterende fartøj netværket og er reguleret af flere signalveje. Den mest fremtrædende af disse er VEGF vej. VEGF er udgivet af iskæmiske celler og fører til indledningen af angiogene spiring i tilstødende blodkar. Den førende endotelcelle fra en ny vaskulær spire er en "spids" celle, der producerer filopodia at nå ud mod kilden af VEGF, og efterfølges af prolifererende 'stilk' endotelceller. På denne måde migrere aktiverede endotelceller og formere mod en avaskulær region, hvor de danner nye vaskulære rør. For at stabilisere disse rør til støtte blodgennemstrømning, endotelceller interagerer med pericytes og glatte muskelceller, som omgiver de nye blodkar 1.. Angiogenese er afgørende for vaskularisering af embryonet og voksende væv. Men det bidrager også til mange pathological lidelser, såsom kræft, hvorimod defekter i angiogenese er forbundet med iskæmiske sygdomme. Udviklingen af effektive lægemiddelbehandlinger at regulere angiogenese som et middel til behandling af sygdom er derfor af stor interesse. For eksempel vil en effektiv antiangiogene faktorer reducere kræft vækst, mens pro-angiogene strategier kan anvendes til behandling af iskæmisk sygdom. Således modeller for angiogenese er afgørende for bedre at forstå reguleringen af nye fartøj dannelse og for at udvikle nye terapeutiske strategier for at forbedre eller mindske vaskulær vækst.
Et grundlæggende element i angiogenese forskning er valget af en passende vaskulær model. Mange in vitro-modeller er blevet designet til at gengive de grundlæggende trin af angiogenese, såsom endotelcellemigration, spredning og overlevelse 2,3. En hyppigt anvendt in vitro assay er dannelsen af et forgrenet netværk af endotelceller på en Matrigel matrix, selvom thans er ikke specifikke for endotelceller, heller ikke inkorporerer sædvanligvis støtte pericytes eller glatte muskelceller. Vurdering af ex vivo spiring angiogenese ved hjælp af musen orgelkultur såsom embryoid organ assay den aortaringen assayet og fostrets metatarsal assay tillader analyse af angiogenese af endotelceller i forbindelse med yderligere understøttende celler. Men de største begrænsninger af disse assays indbefatter manglende blodgennemstrømning og regression af fartøjer over tid, hvilket giver et begrænset vindue til analyse. Derfor, for at forstå reguleringen af angiogenese mere præcist, er in vivo modeller kræves, såsom dem, der er udviklet i mus ved hjælp subkutant implanterede svampe eller Matrigel stik samt bagbenet iskæmi model. Men disse modeller udfordrende at analysere på grund af den komplekse 3D arkitektur neovessels. I modsætning hertil har zebrafisk embryo vist en fremragende model til visualisering angiogenese i heleorganisme 4.. Men musen er evolutionært meget mere nært beslægtet med human end zebrafisk, gør musen en foretrukken model i mange tilfælde. Derfor angiogenese af postnatal muse nethinden repræsenterer et godt karakteriseret foretrukne metode til angiogenese forskning. Det er ikke alene et fysiologisk indstilling, men også en 2D vaskulær plexus, der let kan visualiseres ved hjælp af passende fluorescerende pletter. Arkitekturen af fartøjet netværket, endotel proliferation, spiring, perivaskulær celle rekruttering og skib remodeling kan alle blive undersøgt ved hjælp af denne teknik.
I den neonatale mus nethinden, opstår udvikling af retinale blodkar i den første uge af postnatal liv. Mus, i modsætning til mennesker, er født, er blind og nethinder bliver kun vaskulariseret efter fødslen. Nethindekar opstår fra midten af nethinden tæt på synsnerven på postnatal dag 0 (P0), og udvikles ved angiogenese at danne en meget organisered vaskulær plexus, der når nethinden periferien med ca P8 5.. Blodkar udvikle sig i en karakteristisk måde med kapillarrøret plexus gradvist voksende udad fra synsnervepapillen mod periferien til at generere en regelmæssig skiftende mønster af arterier og vener med en mellemliggende kapillær netværk. Den nethinden kar giver en ideel model for at studere angiogenese som skibene let kan identificeres som de vokser i, hvad det væsentlige er en 2D-plan, hvilket gør det relativt nemt at undersøge nethinden kar i flat-mount forberedelser 5. En fremgangsmåde til isolering af muse neonatal nethinden til analyse af endotheliale tip celle responser over flere timer ex vivo er blevet rapporteret 6.. Alternativt en mere detaljeret undersøgelse af hele nethinden kar og tilknyttede vaskulære markører kræver immunfarvning af faste nethinden prøver på forskellige stadier af udvikling.
Her giver vien detaljeret beskrivelse af en pålidelig og teknisk ligetil metode, som vi bruger til hele mount farvning af det murine nethinden vaskulære plexus, fra den indledende enucleation af postnatale øje (se også 7) gennem farvningsresultaterne protokoller til den endelige billeddannelse under mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1.. Enucleation og Fiksering af Fødselsdepression Eyes
- Placer aflives humant musen hvalp på sin side, fjern skindet dækker øjet med en saks.
- Brug en saks og pincet til at enucleate øjet.
- Sted saks under kerneløs øjet, skære synsnerven og det omgivende væv og løft øjet. Overførsel til en 24-brønds plade indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA), som består i 2x PBS ved stuetemperatur.
- Tillad hvert øje for at løse i 10 - 15 min, og derefter overføre til kolde 2x PBS på is i 5 - 10 min. Det er bedst at forskyde enucleations og efterfølgende fiksering for at sikre den grad af fiksering er ens for hvert øje.
2.. Dissektion af Fødselsdepression murine nethinder
- Overførsel øjne i en petriskål indeholdende 2x PBS ved hjælp af en plastik Pasteur pipette der er blevet skåret at udvide boringen og sted, under et thesecting mikroskop.
- Fjern eventuelle fedt omkring øjet ved hjælp af pincet og saks.
- Pierce kanten af hornhinden med skarpe saks og klippe omkring hornhinden og iris og kassér.
- Indsæt pincet mellem nethinden og sclera og fjern sclera pas på ikke at rive nethinden. Årehinden lag kan også fjernes, men hvis der er en risiko for beskadigelse af nethinden, der opstår under dette trin, kan årehinden lag efterlades på, som det ikke burde i væsentlig grad påvirke kvaliteten af immunfarvning.
- Tag linsen og glaslegemet ved hjælp af pincet.
- Fjern hyaloids fartøjer ved at samle dem sammen i midten af øjet med fine pincet derefter hurtigt trække væk fra midten af nethinden (alternativt klip på bunden af hyaloid fartøjer med fine saks).
- Skyl skålformede nethinden med PBS i en ren petriskål.
- Gør 4 til 5 radiale indsnit nå cirka 2/3 af radius af nethinden med fjeder scissors til at skabe et "kronblad 'facon.
- Tegn off PBS ved hjælp af en Pasteur-pipette til at flade nethinden, og derefter fjerne overskydende PBS med et lille stykke sugende papir.
- Langsomt pipette kold (-20 ° C) methanol dråbevis på overfladen af nethinden indtil helt dækket og derefter skylles med yderligere methanol. Dette vil bidrage til at løse de nethinder, og vil lette permeabilisering. Nethinder vil blive hvid.
- Overførsel til et 2 ml rør med en plastik Pasteur pipette der er blevet skåret at udvide boringen.
- Efterlad nethinden i kold methanol i mindst 20 minutter før der fortsættes med immunfarvning. Af antistofferne anvendes her, kan kun VE-cadherin ikke anvendes med succes på methanol faste nethinder. I dette tilfælde nethinder nødt til at gå direkte til immunfarvning efter trin 9..
- Hvis det er påkrævet, kan nethinder opbevares i methanol ved -20 ° C i op til flere måneder før farvning.
3.. Immuno / isolectin Farvning af Retinal Vasculature
- Fjern forsigtigt / hæld methanol og forsigtigt skylle nethinder kort i PBS (på dette tidspunkt nethinden er stadig i den samme 2 ml rør fra trin 11 ovenfor).
- Fjern PBS og dække nethinder med 100 ul Perm / Block (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% af passende serum (se tabel 1) og rystes forsigtigt i 1 time.
- Fjern Perm / Bloker og inkuberes nethinder med forsigtig omrystning natten over ved 4 ° C med 100 gl af udvalgte primære antistoffer (se tabel 1) og / eller IsolectinB4, alle fremstillet ved fortynding i Perm / Block.
- Fjern antistof / isolectin og vask nethinder 4 x 10 minutter i PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
- I nogle tilfælde, f.eks efter farvning med IsolectinB4-Alexa488 eller en direkte konjugeret primært antistof er et sekundært antistof ikke påkrævet, og nethinder kan monteres direkte (trin 7). Når en ukonjugeret primært antistof er blevet anvendt i trin 3, og derefter 100 pi af den passende fluoratorescent sekundært antistof (fortyndet 1/200 i PBSTX) tilsættes og efterladt til inkubering natten over ved 4 ° C eller i 4 timer ved stuetemperatur.
- Fjern sekundært antistof og vask nethinder 4 x 15 min i 2 ml PBSTX.
- Overfør nethinder på dias ved hjælp af en bred boring plastik Pasteur pipette og fjerne overskydende PBSTX med absorberende væv. Mount nethinder ved tilsætning af 50 pi Forlæng mountant på et dækglas og forsigtigt position over nethinden.
- Transfer slides til køleskab natten over ved 4 ° C, der sikrer, at de er flade og beskyttet mod lys, for at gøre det muligt for Forlæng effekt til indstilles.
- Billede nethinden ved hjælp af en konfokal mikroskop eller et epifluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter dissektion nethinden skal ligne en flad blomst (Figur 1). Ved anvendelse af protokollen, som anført ovenfor, kan endotelceller ses ved hjælp isolectin B4-Alexa488 farvning og støtte vaskulære muskelceller visualiseret under anvendelse af anti-alfa glat muskel-actin (figur 2). Den lave effekt visning ved hjælp en 5X mål i figur 2 giver en oversigt over den vaskulære organisering af nethinden. Også ved hjælp af en anden kombination af antistoffer anført i protokollen ovenfor, kan endotelceller ses under anvendelse af anti-CD31 immunfarvning og understøttende pericytes ses under anvendelse af antistoffer mod NG2 (figur 3) eller desmin (figur 4). Anti-desmin farvningen er nyttig til at visualisere finger som processer i pericytes og bestemme, om de er tæt forbundet med den endotelceller. I modsætning hertil beskriver anti-NG2 farvning kerner af hver pericyt, hvilket er nyttigt, nårkvantificerer antallet af pericyt celler på vaskulaturen. Dette vil ske ved at tælle antallet af celler pr synsfelt ved hjælp af en høj effekt (f.eks 60X) mål. Hvis nødvendigt, kan alternative kombinationer af antistoffer også anvendes (se tabel 1), for eksempel, er anti-collagen IV nyttigt til visualisering af vaskulære basalmembran. Nethinder, der er blevet farvet for endothelceller kan analyseres for vigtige funktioner i angiogenese, såsom progression af karrene fra midten og ud mod kanten af nethinden, den vaskulære tæthed og skib forgrenet frekvens.
Figur 1. Visning af en neonatal nethinden umiddelbart efter dissektion og tilsætning af methanol. Dette billede er taget ved hjælp af et Zeiss STEMI SV6 og Axiocam HR c kamera.
Figur 2. Immunofarvning af hele mount nethinder (alder P7) med Isolectin B4-Alexa488 (grøn) (A), der er anti-alfa glat muskulatur actin-Cy3 (rød) (B) eller fusionerede (C). Disse billeder taget med et Zeiss axioimager og Axiocam HRM kameraet ved hjælp af en 5X målsætning. Bemærk skiftende mønster af arterier og vener. Arterier er anerkendt af kapillære frizone, der straks omgiver dem, og er belagt med glatte muskelceller, der farves positive (rød) til alpha glatte muskulatur actin. Klik her for at se større figur .
load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Figur 3 Dobbelt immunfarvning af hele mount nethinder (alder P6) med anti-CD31 primære antistof (påvist med anti-rotte IgG konjugeret til Alexa488, grøn, A). Og anti-NG2 primære antistof, påvist med anti-kanin IgG konjugeret til Alexa 594 (rød, B). Disse konfokal billeder blev taget med et 60X mål kombinerer laser scanning billeder fra 13 z skiver, hver på 0,47 um tykkelse. Et overlay billeder i C viser CD31-positive endotelceller (grøn) og NG2-positive pericytter (rød). Klik her for at se større figur .
Figur 4 Dobbelt immunfarvning af hele mount nethinder (alder P6) med anti-CD31 primære antistof (påvist med anti-rotte IgG konjugeret til Alexa488, grøn, A). Og anti-desmin primære antistof, påvist med anti-kanin IgG konjugeret til Alexa 594 (rød, B). Disse konfokal billeder blev taget med et 60X mål kombinerer laser scanning billeder fra 21 z skiver, hver på 0,24 um tykkelse. Et overlay billeder i C viser CD31-positive endotelceller (grøn) og desmin-positive pericytter (rød). Klik her for at se større figur .
| Primært antistof | Arbejde fortynding | Blokerende opløsning (Serum + Perm / Block) | Sekundært antistof |
| Anti-NG2 (Chondroitin sulfat Proteoglycan) 1:250 | 5% gedeserum | Ged-anti-kanin Alexa 594 | |
| Anti-GFAP | 1:500 | 5% gedeserum | Ged anti mus Alexa 488 |
| Anti-Desmin | 1:500 | 5% gedeserum | Ged-anti-kanin Alexa 594 |
| Anti-Collagen IV | 1:200 | 5% gedeserum | Ged-anti-kanin Alexa 594 |
| Anti-endoglin | 1:100 | 5% gedeserum | Gede-anti rotte Alexa 594 |
| Anti-CD31 | 1:500 | 5% gedeserum | Gede-anti rotte Alexa 488 |
| Anti-VE-Cadherin | 01:10 | 5% gedeserum | Gede-anti rotte Alexa 594 |
| Anti-Alk1 | 01:25 | 5% æsel serum | Æsel anti ged Alexa 594 |
| Anti-ASMA-Cy5 | 1:100 | <td> Perm Block kunN / A |
Tabel 1. Eksempler på primære antistoffer til immunfluorescensfarvning af hele mount nethinder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden præsenteres her giver en enkel og effektiv måde at få billeder af farvede hele mount præparater af neonatale mus nethinder, hvilket gør det en let kvantificerbare og fysiologisk relevant model af angiogenese. I første omgang, kan musen øjet være ganske vanskeligt at dissekere på grund af sin lille størrelse og kloden form, så nogle praksis og gode dissektion værktøjer er nødvendige for pålidelige resultater. Dissektion af øjne fremstillet i 2x koncentration af PBS er vigtigt, fordi det forårsager en lille mængde vandtab fra øjet og reducerer intra-orbital tryk, hvilket letter dissektion. God forberedelse af nethinden er vigtig af flere grunde. Først det opretholder integriteten af karrene. For det andet, hvis hyaloid vaskulatur ikke er godt fjernet det reducerer effektiviteten af antistoffet farvning, hvilket fører til høje niveauer af baggrund og faldt opløsning. Dette problem kan også opstå, hvis PFA fiksering tid af nethinden er for lang. Imidlertidfør farvning, langtidsopbevaring op til flere måneder i methanol i -20 ° C fryser er egnet inden isolectin farvning og for de fleste af antistofferne i tabel 1. Selvom isolectin farvningen er sjældent problematisk, det gør pletten makrofager i tillæg til endotelceller. For god immunfarvning af hele mount nethinder, er valget af antistoffer kritisk og farvningsprotokol bør tilpasses til antistof specificitet og koncentration, som kan variere mellem batches når polyklonale antistoffer anvendes. Høj baggrund kan sædvanligvis reduceres ved at sænke antistofkoncentration, stigende vasketid eller tilføje mere vaskemiddel til vasketrinene. Antistoffer der afmåles ved ankomsten og opbevares som anført af fabrikanten. For dem, der er opbevaret ved -20 ° C, en arbejder portion opbevares i køleskab for at undgå gentagne cyklusser af fryse tø. Hvis lyse fluorescerende pletter på farvede prøve, især hvis det er også til stedei området omkring vævet, tyder det udfældede aggregater af antistof er til stede som skal fjernes i alle efterfølgende eksperimenter ved centrifugering af antistof til 10.000 rpm i 5 minutter før brug. Nogle af antistofferne i øjeblikket anvendes af vore laboratorier er i materialet listen med en passende fortynding (tabel 1). Vælge en kompatibel kombination af antistoffer er meget vigtigt at undgå uønsket krydsreaktion mellem primære og sekundære antistoffer. Celleproliferation kan overvåges ved at injicere mus med en opløsning af BrdU cirka to timer før høst af væv. Denne thymin analog er inkorporeret i prolifererende DNA og kan detekteres ved hjælp af en specifik anti-BrdU-antistof, som tidligere beskrevet 8..
Hver nethinden er meget skrøbelig, men kan farves til forskellige vaskulære markører ved behandling af vævet forsigtigt, mens de arbejder gennem protokollen. En række kontroller indgår ihvert eksperiment for at vise specificitet farvning. Ubehandlede nethinder vil afsløre graden af autofluorescens i vævet, der bør være minimal. Et nej primære antistof kontrol vil tillade bestemmelse af ikke-specifik binding af det sekundære antistof til vævet. Nethinder, der utilsigtet er blevet revet under dissektion kan give nyttig væv til kontrol. Efter montering er fluorescensfarvede bevares i flere dage, så længe objektglassene opbevares ved 4 ° C i mørke. Billeddannelse af epifluorescerende mikroskopi forbedres ved anvendelse af en apotome, som fjerner ude af fokus lys. Alternativt, konfokal mikroskopi giver nøjagtig cellespecifik imaging (figur 3 og 4).
Denne metode har mange mulige anvendelser. Det kan anvendes til mus, hvor vigtige gener, der regulerer angiogenese udtømte, herunder værk der inducerbar Cre-loxP genetik 8-10. Alternativt retinal angiogenese kan væreafhørte følgende lægemiddelbehandlinger leveret enten systemisk eller intra-okulært at undersøge deres pro-eller anti-angiogenetisk virkninger 11.. Det er også muligt at drage fordel af de transgene værktøjer til rådighed og bruge GFP eller RFP transgene mus til at visualisere centrale elementer i den retinale kar 11,12. (Bemærk, at fiksering under anvendelse af 4% PFA i PBS i 1 time ved stuetemperatur anvendes i stedet for methanol i trin 2.12 i protokollen før billeddannelse endogent GFP eller RFP i nethinder fra transgene mus.) Endvidere, for at studere molekylær signalering mekanismer, er det nyttigt at visualisere mRNA-ekspression af specifikke gener i nethinden plexus bruger i situ hybridisering 13..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust og British Heart Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
