Summary
Diferencial esperma capacidade competitiva entre
Abstract
A competição entre os machos conspecíficas para fertilizar os óvulos é um dos mecanismos de selecção sexual, isto é, selecção que opera sobre a maximização do número de eventos de acasalamento bem-sucedido em vez de maximizar a sobrevivência e viabilidade 1. Competição do esperma representa a competição entre os machos depois da cópula com a mesma fêmea 2, no qual o esperma são coincidentes no tempo e no espaço. Este fenómeno tem sido relatada em diversas espécies de animais e plantas 3. Por exemplo, selvagens capturados D. fêmeas melanogaster geralmente contêm esperma 2-3 4 machos. Os espermatozóides são armazenados em órgãos especializados, com capacidade de armazenamento limitada, o que pode levar à concorrência directa do esperma de diferentes homens 2,5.
Comparando esperma capacidade competitiva de machos diferentes de interesse (tipos masculinos experimentais) foi realizada por meio de experimentação controlada double-acasalamentots no laboratório 6,7. Resumidamente, uma única fêmea está exposto a dois machos diferentes consecutivamente, um macho experimental e uma referência masculina cross-acasalamento. O mesmo esquema de cruzamento é seguida usando outros tipos masculinos experimentais, facilitando assim a comparação indireta da capacidade competitiva de seu esperma através de uma referência comum. A fração de indivíduos filhas de os experimentais e de referência do sexo masculino é identificado por meio de marcadores, o que permite estimar a capacidade competitiva de espermatozóides usando expressões matemáticas simples 7,8. Além disso, a capacidade competitiva do esperma pode ser estimado em dois cenários diferentes dependendo se o macho experimental é o segundo ou primeiro a mate (ataque e defesa ensaio, respectivamente) 9, que se supõe ser o reflexo de diferentes atributos de competência.
Aqui, descrevemos uma abordagem que ajuda a interrogar o papel dos diferentes fatores genéticos que supostamente sustentam tele fenômeno da capacidade competitiva do esperma em D. melanogaster.
Introduction
Desde Geoff Parker observou a prevalência de competição do esperma nos insetos e suas implicações evolucionárias 2, uma onda de estudos em Drosophila e outras espécies têm tentado lançar alguma luz sobre este fenômeno em muitos níveis diferentes. Alguns exemplos de áreas de interesse foram o levantamento de sua variação em populações naturais 9,10, sua arquitetura genética e relevância de fatores genéticos subjacentes 11-14, e seu papel na condução de co-evolução entre os sexos 15,16. Em D. melanogaster fêmeas, a capacidade limitada dos órgãos de armazenamento de esperma especializados, um par de espermateca e receptáculo seminal 6,17, contribui para a competição do esperma de diferentes homens. Aproximadamente 1.500 esperma são transferidos durante o acasalamento à fêmea, mas apenas ~ 500 podem ser acomodados nos órgãos referidos 18,19. No laboratório, controlada acasalamento dupla experimentos envolvendo um homem de referência e um ou mais machos de juros têm sido amplamente utilizados para avaliar a capacidade competitiva do esperma 7,8.
A capacidade competitiva de esperma é estimada como a percentagem de crias desejado pelo macho experimental nas experiências de acasalamento-duplo ao longo da descendência total, ou seja, que tanto do sexo masculino de referência e experimental. A capacidade competitiva de esperma compreende dois componentes, cada um deles avaliada num ensaio separado. No ensaio de ataque, a capacidade do esperma do homem experimental para deslocar o esperma do primeiro macho, ou seja, o macho de referência, é avaliada. Por outro lado, no ensaio de defesa, a capacidade do esperma do homem experimental para resistir deslocamento ou para reduzir o sucesso da fertilização do espermatozóide referência é avaliada. Dependendo do tipo de ensaio, a defesa ou ofensa, capacidade competitiva de esperma é estimado através dos pontos P 1 ou P 2, respectivamente. P1 e P 2 só pode assumir valores entre 0 e 1. Os valores intermediários são geralmente interpretados como evidência indireta de esperma de mistura, o que sugere um cenário fisiológico que envolve a competição do esperma direto. Seguindo o mesmo raciocínio, valores extremos pode ser interpretado como evidência de forte diferencial esperma capacidade competitiva. Estudos anteriores mostraram que a P 2 em D. melanogaster é acima de 0,8, como o aumento do tempo decorrido entre os dois cruzamentos prolonga 7. Este mesmo modelo experimental foi usado em outras espécies de Drosophila, P 2 ser a estatística utilizada em estudos para avaliar a capacidade competitiva de esperma 20. Para a maioria das espécies, os valores das duas estirpes testadas P é superior a 0,6 21. No entanto, vários outros mecanismos não relacionados à concorrência directa entre espermatozóides de diferentes machos podem produzir notas idênticas (ver discussão).
Dprogenitura istinguishing desejado pelos primeiros ou segundos machos é possível através do uso de marcadores facilmente identificáveis. Em estudos iniciais, um dos machos foi irradiada com doses subletais de, por exemplo, raios X, que praticamente todos os óvulos fertilizados por esperma irradiado não eclodiram 7. Posteriormente, as mutações que alteram a pigmentação dos olhos ou forma de asa foram os marcadores mais usados. Os exemplos do anterior são as mutações pv (castanho) 9, CN (cinábrio) e 22 W (branco) 23, enquanto que a mutação CY (encaracolado) 24 corresponde ao segundo tipo de fenótipos, alguns destas mutações foram combinadas no mesmo indivíduo, por exemplo, cn bw. Em menor medida, isoenzimas 25 e 26,27 microssatélites com padrões de herança conhecidos também têm sido utilizados.
O delineamento experimental para testar as diferenças decapacidade competitiva esperma descrito aqui segue essencialmente o de Clark et al. 9. Os resultados obtidos a partir desses experimentos dar informações apenas sobre a paternidade diferencial dos tipos masculinos experimentais sob escrutínio. Ensaios que também fazem provisão para diferenças pós-fertilização na aptidão 14,28 e técnicas de visualização de esperma 24 permitir diferenças de P 1 (ou P 2) marca a ser interpretado como diferenças na competência do esperma.
A Figura 1 descreve a lógica tanto da ofensa e os ensaios de defesa. Para ilustrar a logística do processo, uma ofensa experimento realizado em D. melanogaster 14, será explicada em detalhe. Este ensaio ofensa particular foi usado para testar um efeito mensurável do multigene família cadeia intermediária dynein específico Sperm (Sdic) sobre a capacidade competitiva do esperma. Todos os Estados-s desta família multigene residem em conjunto no cromossomo X. Homens Knockout foram geradas, suprimindo o cluster Sdic. Porque o segmento excluído também incluiu o essencial curto asa gene (sw) eo objetivo do estudo foi avaliar a relevância de Sdic, os homens portadores da deleção Sdic-sw foram resgatados por uma cópia transgênica do sw (simbolizado como P {sw} , que também realizado um mini-gene repórter de branco) no cromossoma 2. Cor dos olhos foi usado como um marcador visível para identificação de paternidade. Todas as moscas estavam num fundo branco mutante com a excepção daqueles a partir da estirpe de Oregon-R, que foram usadas como referência para os machos.
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Protocol
Experimentos em pequena escala deve ser realizada para se familiarizar com todo o processo.
1. Coleta de fêmeas e machos virgens Naïve
A versão mais simples do experimento descrito é composto por quatro tipos de cruzamentos iniciais, que envolvem a seguinte combinação de adultos: a) w 1.118 indivíduos, a fim de coletar fêmeas virgens, b) Oregon-R indivíduos, a fim de recolher os machos de referência ingênuos, c ) P {sw} machos homozigotos e fêmeas virgens de uma linha de controle que leva a organização do tipo selvagem de Sdic a fim de recolher os machos experimentais ingênuos (Tipo I), ed) P {sw} machos homozigotos e Sdic-sw-exclusão de transporte de fêmeas virgens a fim de recolher os machos experimentais ingênuos que levam a deficiência Sdic-sw (Tipo II).
- Configurar vários frascos contendo 8-10 fêmeas e 5 machos cada. Permitir que as mulheres para colocarovos e transferir os adultos a novos frascos a cada 3-5 dias. Use garrafas em vez de frascos, se necessário e use sempre alimentos frescos. O número de ampolas requeridas dependerão do número de tipos de machos experimentais em estudo e o número de indivíduos considerados necessários para detectar diferenças (Tabela 1). Mais de 10 fêmeas por frasco pode resultar em excesso de população durante o crescimento das larvas, o que pode provocar variações na fertilidade da progenitura. Guardar os frascos a 25 ° C numa câmara de temperatura controlada.
- Iniciar a coleta de fêmeas e machos virgens ingênuas nos dias 11 º e 12 º depois de configurar as cruzes iniciais. O período de espera varia em função da temperatura; menores temperaturas resultam em maior tempo de retardamento do desenvolvimento do conjunto de indivíduos. Outro fator que afeta o momento de eclosão é o tipo de meio. Alimentos nutritivos, como meio de fubá, o fermento 29, garante o bom desenvolvimento do adultosistema reprodutivo, o que facilita o acasalamento. Colete unmated voa cada 4-6 horas. Ao coletar, anestesiar moscas através da introdução de CO 2 para dentro do frasco, toque as moscas para baixo, e sexo-los sob microscópio estereoscópico (Figura 2). Coloque as moscas desejados em diferentes frascos por sexo e fenótipo e rotular os frascos adequadamente.
Nota 1. Rotina de coleta começa pela manhã, descartando os adultos que surgiram durante a noite anterior. Recolhe fêmeas e machos virgens naive uma ou duas vezes durante o dia. Tipicamente, D. melanogaster os machos tornam-se sexualmente maduros 8 horas após a eclosão a 25 ° C 30. Se as moscas são mantidas sob 12:12 h de luz / escuridão ciclos, espera-se dois picos de eclosão: durante o primeiro 1-2 horas após a luz é acesa, e durante a 2 horas antes que a luz é desligada. Eclosão ocorre dentro de 24 horas após o escurece pupa.
Nota 2. Não mais do que 10 fêmeas should ser colocado no mesmo frasco para evitar a superlotação. Isso também limita a perda de fêmeas no caso de terem de ser descartadas por pelo menos um deles não é virgem.
Nota 3. A fim de recolher o número apropriado de fêmeas e machos virgens ingênuas em um curto período de tempo, as seguintes medidas podem ser adotadas. Configure 15-20 frascos de w 1118 para experimentos envolvendo dois tipos de homens experimentais (Tabela 1). Polvilhe levemente a superfície da mídia e adicionar algumas pelotas de fermento biológico seco para facilitar a oviposição. Transfira os pais, pelo menos quatro vezes em dias consecutivos. Para aumentar a superfície disponível para a fase de pupa em cada frasco, inserir papel multi-dobrada (7 x 5 cm) durante o 4 º ou 5 º dia após os pais são transferidos para um outro frasco (Figura 3). Se o número de adultos emergidos a partir do cruzamento inicial não é suficiente, espere mais alguns dias e recolher indivíduosals de frascos criado em datas diferentes. Plano para realizar os experimentos ao longo de vários dias consecutivos para igualar a carga de trabalho.
2. Experimentos Double-acasalamento
A Figura 4 mostra os principais passos envolvidos nas experiências de dupla acoplamento realizadas em 14.
- Na manhã do dia 1, criou o primeiro acasalamento. Os machos Oregon-R são os primeiros a acasalar no ensaio ofensa.
- Usando o aspirador, configurar frascos contendo outubro 4-05 dias de idade, de olhos brancos w fêmeas virgens 1118 e 10 de olhos vermelhos Oregon-R machos virgens de cada um. Duas a três frascos são criados por dia durante 5 dias consecutivos. O número de frascos a ser configurado pode variar, dependendo do número de indivíduos disponíveis. Permitir que as moscas se acasalar por 2 horas.
- Descartar Oregon-R machos e fêmeas em cada lugar um novo frasco utilizando um aspirador (Figura 5). Identificação de sexo pode ser conseguida por meio de inspecção visual de algunsdiferenças morfológicas (Figura 2). Rotular cada frasco adequadamente e deixar a mulher no frasco por 2 dias (doravante "v1").
- No dia 3, configure o segundo acasalamento. Selecção dos machos e transversais definidos, deve ser realizado de forma aleatória, de modo a minimizar qualquer tendência potencial para qualquer um dos tipos de machos experimentais.
- Duas horas antes da luz é desligada, transferir novamente a fêmea em um novo frasco com um aspirador. Rotular o novo frasco adequadamente (a seguir "v2").
- Introduzir três machos experimentais 5-6 dia de idade do mesmo genótipo em V2.
- Repita 2.2.1 e 2.2.2 para cada fêmea.
- No dia 4, duas horas antes direito a luz é ligado (ou seja, não mais do que 12 horas após a 2.2.1), descarte homens usando o aspirador.
- No dia 6, transferir cada fêmea novamente em um novo frasco. Rotular os novos frascos de forma adequada (a seguir "v3").
- No dia 10, descartar a 1118 w
- Examine as progênies em v2 e v3. A primeira inspecção é realizada após 13-15 dias após a fêmea é introduzida V2 (ou V3), por exemplo, no dia 17 após a primeira ovipositar começou fêmea em V2. A segunda inspeção é realizada exatamente após 17 dias. Este período de tempo representa um limite temporal, superior de segurança, que garante não de segunda geração no mesmo frasco. Duas inspecções evitar a superlotação, facilitando a contagem de progênie.
- No Dia 17, v1 inspecionar e garantir que não são descendentes de olhos vermelhos presente, se não marcar o frasco adequadamente. Presença de progenitura de olhos em branco indicam que a mulher não era virgem no momento do acoplamento inicial, enquanto nenhuma progénie indica que o acasalamento com o de referência ou os machos experimentais não ocorrem.
- No dia 17, realizar a primeira inspeção de v2. Anesthetize surgiu progênie em v2 com CO 2 e classificá-los por cor dos olhos e sexo. Números recordes de progênie filhas de primeiro e segundoond homens. Figura 6 mostra os fenótipos esperados na progênie de cada esquema de acasalamento. Nesta experiência em particular 14, apenas a descendência feminina pode ser atribuído inequivocamente como desejado pela referência ou os machos experimentais e, portanto, apenas a informação de filhas podem ser usados para calcular P 2. Se com outros marcadores a paternidade de descendência masculina pode ser atribuído inequivocamente, progenitura contagens de ambos os sexos, pode ser usado nos cálculos a jusante. Descarte a descendência, mas manter v2 para segunda inspecção.
- No dia 20, proceder como no 2.5.2 com a prole recém-surgido em v2 e, em seguida, descartar o frasco.
- No dia 20, inspecionar a descendência surgiu em v3 pela primeira vez e siga o passo 2.5.2.
- No dia 23, proceder como no 2.5.3 com a prole recém-surgido em v3.
Nota 1: Devido ao efeito de inflar potencial na pontuação P que a poligamia pode ter (2.2.2 e 2.2.3), o acasalamentopode ser limitado a um determinado período de tempo. O período de tempo dependerá da frequência remating relacionado com o genótipo do sexo feminino e masculino usados. A probabilidade de acoplamento múltiplo é especialmente reduzido durante o período nocturno 11.
Nota 2: Não adicione pelotas leveduras vivas, porque isso pode causar problemas devido ao potencial de crescimento excessivo da levedura quando o número de moscas adultas é baixo.
3. Análise de Dados
- Contagem de progênie gravadas devem ser organizados de forma adequada para a inspeção visual e fácil análise eficiente, com um pacote estatístico adequado (por exemplo, JMP da SAS Institute) ou ferramentas baseadas em web livre (eg http://vassarstats.net/ ).
- Capacidade competitiva do esperma. Adicionar contagens de v2 e v3. Moscas fêmeas que deram origem a nenhum ou muito limitada progênie (por exemplo, <10), morreu durante o procedimento, ou estavam apenas com êxito inseminaçãoted por um dos dois machos são considerados como não informativo e são excluídos de qualquer análise estatística jusante (2.5.1 e na Tabela 2). Calcular a pontuação P 2 para cada fêmea informativo.
- Testar se existem diferenças estatisticamente significativas nos valores de P 2 entre os machos experimentais comparados. Isso pode ser feito usando paramétrico (HSD de Tukey, por exemplo) ou testes não paramétricos (por exemplo, aço-Dwass) dependendo de vários fatores, incluindo a assimetria da distribuição dos valores de P 2 ea dependência entre a variância ea média. A transformação angular é normalmente aplicado em proporções, tal como P 2, antes da utilização de testes paramétricos 31.
- As diferenças de acasalamento (opcional). Para cada tipo macho experimental, calcular o número de fêmeas acasaladas duplamente e aqueles que só acoplado com o primeiro macho (o macho de referência no ensaio de ataque e o macho experimental no defense ensaio). Usando um teste exato bicaudal de Fisher (disponível em http://www.langsrud.com/fisher.htm ), determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre os dois tipos de homens experimentais.
- Distribuição por sexo (opcional). Para cada homem experimental, utilize o teste do qui-quadrado para determinar se a proporção entre os sexos na progênie de cada um se desvia do sexo feminino a partir da proporção 1:1 esperada.
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Representative Results
A Tabela 2 resume algumas características marcantes de dois experimentos de ofensa (Ensaios 1 e 2), em que D. melanogaster machos experimentais com e sem (tipo I e II, respectivamente), um cluster Sdic funcional são comparados 14. Depois de levar em conta as diferentes incidências encontradas com algumas repetições 58-83% das mulheres foram encontrados para ser informativo e, portanto, as contagens de paternidade de seus descendentes poderiam ser usados para o cálculo de P 2. Os resultados dos testes não-paramétricos foram consistentes com um espermatozóide menor capacidade competitiva nos machos sem o cluster Sdic (Tipo II), em comparação com homens com o cluster intacto (Tipo I) 14. Este padrão foi reproduzido através dos ensaios de contra-ordenação realizadas. Uma tendência semelhante, mas não estatisticamente significativa foi encontrada nos ensaios de defesa executadas em paralelo (não representados). É importante ressaltar que a ausência de diferenças de acasalamento (passo 3.4) descartou a possibilidade de queo genótipo masculina pode afetar o comportamento feminino remating 14.
| Ensaio ofensa | Ensaio Defesa | |||||
| Experimental ♂ Tipo | w 1118 ♀ | OR-R ♂ | Experimental ♂ | w 1118 ♀ | Experimental ♂ | OR-R ♂ |
| Eu | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tabela 1. Número de indivíduos necessários em experimentos de acoplamento duplo para comparar dois tipos masculinos experimentais. OR-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Experimental ♂ Tipo | Contagem inicial | Nenhuma fertilização bem sucedida com referência ♂ | Sem sucesso com a fertilização experimental ♂ | Problemático 1 | Informativo (%) | P 2 2 |
| Ensaio 1 | ||||||
| B +(Tipo I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1,000 (1,000-0,987) |
| A-(Tipo II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Ensaio 2 | ||||||
| I + (Tipo I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1,000 (1,000-0,979) |
| E-(Tipo II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1.000-0.927) |
Tabela 2. Sumário do impacto de diferentes eventos no número de fêmeas utilizadas em ensaios de ataque realizado para testar as diferenças entre os tipos de machos experimentais. Uma Morreu, escaped durante o ensaio ou que dá origem a um número de descendentes abaixo de um valor limiar. dois mediana (gama interquartil).
Figura 1. O delineamento experimental para o ataque e ensaios de defesa. O código de cores usadas para cada genótipo denota a cor dos olhos da mosca adulta. Oregon-R machos são usadas como referência para comparação indirectamente a capacidade competitiva de esperma de dois machos experimentais: um transportando a forma de tipo selvagem do factor genético em estudo (Tipo I) e no qual a funcionalidade do componente genético tem sido perturbado (Tipo II). O aglomerado Sdic, o factor genético neste caso, situa-se no cromossoma X, enquanto que o interruptor do transgene está localizado no cromossoma 2. Os experimentos descritos são parte daqueles realizados em
Figura 2. Identificação do sexo em D. melanogaster. (A) dorsal, (B) lateral, e (C) vista ventral de uma hora fêmeas velhas (esquerda) e do sexo masculino (à direita) anestesiados com CO2 sob o microscópio estereoscópico. A genitália masculina é substancialmente mais pigmentada que a placa vaginal dando origem a uma mancha escura aparente, que é o personagem mais confiável para usar para sexagem. Além disso, o tarso das pernas anteriores dos machos possuem uma franja de cerdas escuras (sex pente) ausente nofeminino. (D) identificação de moscas mais velhas por olho nu sexo confiável e rápida é altamente recomendado durante a transferência de indivíduos em frascos com aspiradores. Em idosos, abdómen dorsal macho é muito mais escuro do que a do sexo feminino. As fêmeas são geralmente maiores e ter um abdômen mais pálida do que os machos. O ovipositor faz com que o abdômen feminino apontou.
Figura 3. Papel multi-dobrado utilizado para aumentar a superfície disponível para vaguear larvas.
Figura 4. Esboço do experimento às diferenças de ensaio na capacidade competitiva esperma em D. melanogaster. acasalamento Missa para 2 horas usando vir gin w fêmeas 1118 e Oregon-R machos são iniciados todos os dias durante 5 dias. Em cada cruzamento de massa, uma vez terminada, 12-14 fêmeas devem ser aspirados separadamente em frascos individuais (v1). Dois dias mais tarde, cada fêmea é transferida para um novo frasco (v2), juntamente com três machos experimentais do mesmo genótipo. Estes indivíduos estão autorizados a acasalar durante a noite. Os machos são descartados depois de ~ 12 h enquanto que as fêmeas estão autorizados a oviposição, durante 2 dias. Posteriormente, as fêmeas são transferidas para novos frascos (v3), deixada oviposit novamente, e finalmente eliminado após 3 dias. Treze a quinze e 17 dias após as fêmeas começou a oviposição em ambos v2 e v3, gerou progenitura pela experimental e machos de referência são identificados por meio de marcadores apropriados e registada. Após as progênies em v2 e v3 são inspecionados duas vezes, os frascos são descartados. Seta para baixo, os indivíduos descartados; símbolo do olho, inspeção de frasco. Adaptado a partir de 9.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 5. Aspirador flexível. Montado a partir de âmbar tubo de látex, um 1 ml graduada ponta para receber moscas e outro funcionando como mouthpart descartável. Para evitar que as moscas ser sugado para dentro do tubo, de tecido de malha fina é usado para proteger a ponta de recepção de voe na junção de tubo.
Figura 6. Fenótipos esperadas na progênie do ensaio ofensa. Esquerda e direita, cruza para avaliar a capacidade competitiva do esperma de controle e knock-out do sexo masculino, respectivamente. Genótipo e cor dos olhos para parentais e descendentes de ambos fathers são mostrados. Por causa dos marcadores genéticos particulares utilizados neste ensaio, só a descendência feminina pode ser utilizada para o cálculo P 1 (ou P 2) marca (ver texto para detalhes); parte da descendência masculina desejada pelo macho experimental é branco e de olhos ., portanto, fenotipicamente indistinguíveis da descendência masculina do homem de referência Df, deficiência;} P {sw, transgene;. w 1118 alelo mutante do gene branco Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Nós descrevemos o projeto experimental para avaliar as diferenças na contribuição relativa de organismos geneticamente distinto D. melanogaster machos à progênie em experimentos controlados duplo-acasalamento 7,8. Isto foi realizado no contexto de um factor genético hipótese de influenciar a capacidade competitiva do esperma e que tenha sido ilustrada no ensaio de ataque, embora um procedimento semelhante aplica-se ao ensaio de defesa (Figura 1). Esta concepção experimental pode ser modificado para testar outros aspectos da paternidade sucesso tais como a influência do genótipo 32 do sexo feminino. Um exemplo das modificações que podem ser incorporadas é a monitorização directa da cópula entre o sexo feminino e o segundo macho. Além disso, é também importante notar que o desempenho relativo dos tipos de machos experimentais é dependente do genótipo do dispositivo de teste do sexo masculino e feminino utilizado e, portanto, não podem ser extrapolados para outros cenáriosenvolvendo diferentes machos e fêmeas testador 10,32,33.
Uma vez que a coleta dos indivíduos necessários (fêmeas e machos virgens ingênuas) e pontuação da progênie são trabalho intensivo, o número de tipos masculinos experimentais distintos a serem avaliados devem ser ajustadas de acordo com o número de funcionários bem treinados disponíveis. Os experimentos descritos aqui podem ser facilmente manipulados por uma pessoa ao longo de seis semanas. De facto, até cinco tipos de machos experimentais puderam ser avaliados em paralelo. A única medida adicional a ser adoptada é a de prolongar o número de dias de criação de acasalamentos de massas iniciais e recolhendo os indivíduos requeridos para elas.
Na nossa experiência, o número de fêmeas de partida utilizados (60-70) é suficiente para acomodar a redução no tamanho da amostra, sem comprometer a poder estatístico para detectar diferenças entre os tipos de machos experimentais (Tabela 2). A diminuição do número de ifêmeas nformative pode resultar de diversos factores, como por exemplo falta de evidência de dupla acasalamento ou morte prematura. No entanto, o número de fêmeas necessário para cada tipo macho experimental, a fim de atingir um poder estatístico adequado vai variar dependendo da magnitude do efeito do factor genético em estudo. A experiência piloto é altamente aconselhável a fim de estimar o nível adequado de replicação.
Diferenças estatísticas (P 1 ou P 2) contagens indicam variação na fertilização masculino eficiência apesar de não informar sobre os mecanismos subjacentes que contribuem para essas diferenças. Isto é devido a múltiplas variáveis que poderiam afetar a capacidade competitiva do esperma (extensivamente revisado em 20 e 34). Atributos de esperma, como tamanho, número e motilidade podem ter impacto sobre a competição do esperma diretamente 35. Além disso, outros mecanismos não relacionados com a competição directa de esperma cAn também contribuir para as diferenças em valores de P 1 ou P 2. Por exemplo, o primeiro macho de esperma pode ser preferencialmente removido, reposicionado, ou lavado antes ou durante o acoplamento com o segundo macho 19,20. Isto pode ocorrer por estimulação mecânica, por exemplo, durante a cópula e através das moléculas presentes no fluido seminal do segundo macho, o que vai afectar negativamente o primeiro espermatozóide 19,36. Portanto, os ensaios complementares que avaliam o impacto desses mecanismos indiretos adicionais devem ser realizados, de preferência antes do experimento duplo-acasalamento descrito aqui. Exemplo destes ensaios são aqueles testes de diferenças na viabilidade do zigoto (por exemplo, sobrevivência larval) e eclodibilidade dos ovos (um proxy para o sucesso da fertilização do óvulo) 28,37, o que acaba por resultar em diferenças no número de descendentes.
Técnicas de imagem de esperma também pode ser altamente informativa 19,24,28. Essencialmente, um of os machos é modificado geneticamente de tal forma que o esperma é marcado com uma proteína de fusão fluorescentes (por exemplo, que o macho de referência com uma proteína fluorescente verde), ajudando a dinâmica de esperma de monitorização no tracto reprodutivo feminino. Esta abordagem combinada com a maior coloração utilizando 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) foi utilizada para identificar directamente a contagem de esperma a partir dos primeiro e segundo recipientes machos em dissecados de D. seminais melanogaster fêmeas 24,28. Em um estudo de 24, as diferenças na contagem de espermatozóides estavam de acordo com as diferenças nos valores de P 2 suportam a noção de que essas diferenças de paternidade masculino eram reflexo de verdadeiras diferenças no esperma capacidade competitiva e não de mecanismos indiretos.
Refinamentos subsequentes foram alcançados através da geração de estirpes transgénicas que expressavam marcadores fluorescentes verdes e vermelhas fundidos com proteínas específicas do esperma 19. Estes improvemtes têm permitido aos pesquisadores monitorar o esperma dos dois competindo diretamente espermatozóide masculino com um grau sem precedentes de resolução. Em conclusão, a execução de experimentos de acasalamento duplo e ensaios adicionais, como as sugeridas ajudar a diminuir a natureza de quaisquer diferenças entre P 1 e P 2 escores encontrados entre os tipos masculinos experimentais, o que abre a possibilidade de dissecar a base genética da variação que ocorre naturalmente na capacidade competitiva do esperma.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem a NSF (MCB-1157876) para o financiamento. Agradecemos também a Alberto Civetta, John Roote e dois revisores anônimos por seus comentários.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
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