Summary
We beschrijven een werkwijze voor het passiveren van een glasoppervlak met polyethyleenglycol (PEG). Dit protocol heeft betrekking op oppervlaktereiniging, oppervlakte functionalisering, en PEG-coating. We introduceren een nieuwe strategie voor de behandeling van het oppervlak met PEG-moleculen in twee rondes, die een superieure kwaliteit van passivering oplevert vergeleken met bestaande methoden.
Abstract
Single-molecule fluorescentie spectroscopie bewezen instrumenteel begrijpen diverse biologische fenomenen op nanoschaal zijn. Belangrijke voorbeelden van deze techniek kan opleveren biologische wetenschappen de mechanistische inzichten van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties. Wanneer interacties van eiwitten gepeild bij de enkele-molecuul, worden de eiwitten of hun substraten vaak geïmmobiliseerd op een glasoppervlak, waardoor een langdurige observatie. Deze immobilisatie regeling kan ongewenste oppervlak artefacten te introduceren. Daarom is het essentieel om het glas te passiveren om het inert maken. Coating met behulp van polyethyleenglycol (PEG) onderscheidt zich door zijn hoge prestaties bij het voorkomen van eiwitten van niet-specifiek interactie met een glasoppervlak. De polymeerbekleding procedure is moeilijk vanwege de complicatie van een reeks oppervlaktebehandelingen en de strenge eis dat een oppervlak moetvrij van elke fluorescerende moleculen aan het einde van de procedure. Hier bieden we een robuust protocol met stap-voor-stap instructies. Het omvat oppervlaktereiniging waaronder piranha etsen, oppervlakte functionalisering met amine groepen, en uiteindelijk PEG coating. Een hoge dichtheid van een PEG-laag te verkrijgen, introduceren we een nieuwe strategie voor het behandelen van het oppervlak met PEG-moleculen in twee rondes, die opmerkelijk verbetert de kwaliteit van passivering. Wij bieden representatieve resultaten alsmede praktisch advies voor elke kritische stap, zodat iedereen de hoge kwaliteit oppervlaktepassivering kan bereiken.
Introduction
Bij het uitvoeren van een enkel molecuul eiwit studie is het essentieel om een hoge oppervlaktepassivering bereiken zodat het experiment vrij is van oppervlak-geïnduceerde proteïne storing of denaturatie 1,2. Terwijl een glazen oppervlak behandeld met surfactanten, zoals runderserumalbumine, wordt vaak gebruikt voor individuele molecuul nucleïnezuur studies 3, de graad van passivering is niet hoog genoeg voor eiwitstudies. Een glazen oppervlak gecoat met polymeer (polyethyleenglycol, PEG) is superieur in de passivering prestatie 4-6. Daarbij heeft het universeel gebruikt voor single-molecule eiwit studies sinds het werd ingevoerd om een enkel-molecuul fluorescentie studie 7-10 geworden. Het polymeer coating procedure vereist meerdere oppervlaktebehandelingen 7,11,12. Daarom is het moeilijk om de hele procedure volgen zonder gedetailleerde instructies. Vaak is de mate van passivatie sterk afhankelijk van protocol is gevolgd. Hier presenteren we een robuust protocol met stap-voor-stap instructies, die een van de grote knelpunten van single-molecule eiwit studies zal verwijderen. Zie Figuur 1 voor overzicht.
Protocol
1. Schuif het bereiden en schoonmaken
Een microfluïdische kamer bestaat uit een kwarts glijbaan en een dekglaasje. In prisma-achtige totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, is het oppervlak van het kwarts dia afgebeeld. Daarom is het belangrijk om een kwarts dia grondig met H2O, aceton, KOH en piranha oplossingen reinigen. Th is multi-step reiniging elimineert fluorescerende organische moleculen op een oppervlak die interfereren met 'single molecule fluorescentie metingen. Bovendien Piranha etsen maakt het kwartsoppervlak hydrofiele door het genereren van hydroxylgroepen. De vrije hydroxylgroepen zijn essentieel voor de amino-silaneren reactie in stap 3.
- Boren kwarts dia's. Boor een paar gaten in een kwarts dia met een 3/4 mm diamant boor (Figuur 2a). Als er meerdere kanalen zijn gewenst, boren meer pairs gaten (Figuur 2b). Deze gaten worden gebruikt voor het injecteren van oplossingen in een microfluïdische kamer in stap 7.
- Houd de boor beetje nat in H 2 O tijdens het boren. H2O presteert als een smeermiddel, waarbij de levensduur van de boor toeneemt.
- Af en toe af te vegen de punt van de boor helpt het boren van gaten.
- Na het boren gaten markeren een zijde van de schuif voor gemakkelijke identificatie tijdens het PEGylatie proces. De markers kunnen worden gebruikt als referentie om verwarring te vermijden later. Voor het markeren, kan een diamant boor worden gebruikt. Gebruik geen pen niet, omdat de inkt zou kunnen krijgen op het oppervlak.
- Reinigen met H 2 O. Plaats de dia's in een glazen pot kleuring. Typisch 5 tot 15 slides in een pot geplaatst. De dia's spoelen met MilliQ H 2 O. Herhaal dit 3 keer en ultrasone trillingen de dia's met MilliQ H 2 O 5 minuten om vuil te verwijderen. Gooi het water en spoel de glaasjes weer 3 keer metMilliQ H 2 O. Merk op dat 130 W is de ultrasoonapparaat macht gebruikt voor dit protocol. Hogere macht sonificeren zou de levensduur van de kwarts dia's te verlagen.
- Reinigen met aceton. Vervang de MilliQ H 2 O met aceton. Ultrasone trillingen de dia met aceton gedurende 20 minuten of langer.
- Spoelen met H2O Gooi de aceton en spoel de glaasjes met MilliQ H 2 O. Herhaal dit 3 keer om eventuele aceton te verwijderen.
- Reinigen met KOH. Vervang het water met 1 M KOH en ultrasone trillingen de dia's voor 20 minuten of langer. Overmatige etsen (bijvoorbeeld 's nachts KOH behandeling) de kwaliteit van het oppervlak verbeteren, maar zal krassen, storende fluorescentie beeldvorming voeren.
- Spoelen met H2O Spoel de glaasjes met MilliQ H 2 O voor 3 keer om sporen van KOH verwijderen.
- Piranha etsen.
- Breng de dia's naar een dia houder Duran of een op maat gemaakte teflon houder en place ze in een bekerglas (1 L) die zich in een chemische kap.
- Vul het bekerglas met 450 ml H 2 SO 4.
- Voeg 150 ml H 2 O 2 voor 03:01 verhouding H 2 SO 4 en H 2 O 2. Zodra de oplossing begint spontaan koken, de temperatuur stijgt boven 90 ° C. Controleer of de H2O 2 oplossing bij kamertemperatuur voordat de reactie. Anders kan de temperatuur van de kokende oplossing lager dan 90 ° C.
- Roer de oplossing voor een goede menging en laat de beker ongestoord gedurende 20 minuten.
- Neem de dia's uit de piranha-oplossing samen met de diahouder, en leg ze in een dia houder met MilliQ H 2 O. Ondertussen gooi de piranha oplossing in een aangewezen afvalfles zodra het op kamertemperatuur.
- Spoel de schuiven 3 maal met MilliQ H2O Extra zorg moet worden genomen bij de verdere steps om eventuele besmetting van dia's te voorkomen. Ga door naar stap 3. Het is aangeraden om direct door te gaan met de volgende stappen.
* Let op: De piranha oplossing is uiterst reactief. Bij het hanteren van deze oplossing extra voorzichtigheid in acht moet worden genomen. Bovendien, wanneer per ongeluk gemengd met organische oplosmiddelen zoals aceton, kan een explosie veroorzaken.
2. Coverslip Cleaning
Een microfluïdische kamer bestaat uit een kwarts glijbaan en cover s rand. Wanneer een prisma-achtige TIRF microscoop wordt gebruikt, wordt het oppervlak van een dekglaasje niet afgebeeld. Daarom is het voldoende om een dekglaasje alleen schoon met H2O en KOH. In het geval moet een dekglaasje af te beelden (bijv. via de doelstelling type TIRF microscopie), is het raadzaam om de dekglaasjes behandelen met piranha-oplossing (stap 1.7). Merk op dat als PEGylering van het dekglaasje oppervlak is niet van hoge kwaliteit, kan het fungeren als een gootsteen voor eiwitten eend leiden tot variaties in de eiwitconcentratie.
- Spoelen met H2O Plaats dekglaasjes (24 x 30, 24 x 40 of 24 x 50 mm 2) in een glazen pot kleuring. Typisch 5 tot 15 dekglaasjes in een enkele pot geplaatst. Spoel de dekglaasjes 3 keer met de MilliQ H 2 O.
- Reinigen met KOH. Vervang het water met 1 M KOH en ultrasone trillingen de dekglaasjes 20 minuten of langer.
- Spoelen met H2O Spoel de dekglaasjes 3 maal met MilliQ H2O om sporen KOH verwijderen. Ga door naar stap 3.
3. Amino-silanisatie van Dia's en Coverslips
Functionaliseren het oppervlak van het kwarts dia en dekglaasjes met aminegroep via de amino-silanisatie chemie. Methanol wordt gebruikt als oplosmiddel en azijnzuur als katalysator voor de amino-silanisatie reactie.
- Spoelen met methanol. Vervang de MilliQ H 2 O in de kleuring gerechten (van STEP 1 en 2) met methanol. Houd de dia's en de dekglaasjes in methanol tot stap 3.3. Laat de dia's en de dekglaasjes in methanol niet te slaan voor een onnodig lange periode (bijvoorbeeld enkele uren) sinds onzuiverheden in methanol zal adsorberen aan het oppervlak.
- Voorbereiden van amino-silanisatie oplossing.
- Spoel een Pyrex kolf meerdere malen met methanol. Ultrasone trillingen de kolf met methanol gedurende 5 minuten of langer. Het is aangeraden om een speciale fles die schoon wordt gehandhaafd hebben.
- Giet 100 ml methanol in de kolf.
- Voeg 5 ml azijnzuur.
- Voeg 3 ml APTES (3-aminopropyltrimethoxysilaan) en meng door schudden.
- Amino-silanisering. Vervang de methanol in de kleuring gerechten die de dia's en de dekglaasjes met de aminosilanization reactiemengsel bevatten.
- Incubeer gedurende 20-30 minuten. Tijdens incubatie ultrasone trillingen eens 1 minuut.
- Spoelen met methanol. Vervang de eenminosilanization reactie met methanol. Gooi de methanol en voeg een verse methanol oplossing. Herhaal deze procedure drie keer.
4. Oppervlaktepassivering behulp Polymer (de eerste ronde)
Passiveren het amine beklede oppervlak van kwarts dia's en dekglaasjes door conjugeren NHS-ester polyethyleenglycol (PEG). Deze reactie wordt uitgevoerd met de verzadigingsconcentratie van PEG-oplossing bij pH 8,5 gedurende de nacht.
- Drogen dia's en dekglaasjes. Droog de objectglaasjes en dekglaasjes met N2-gas en plaats ze in schone pipet vakken zodanig dat de zijde die moet worden gePEGyleerd naar boven. De pipet box is gedeeltelijk gevuld met MilliQ H2O Deze vochtige omgeving voorkomt PEGylation oplossing uitdrogen tijdens de nachtelijke incubatie.
- Het voorbereiden reactie buffer. Bereid 0,1 M vers natriumbicarbonaat buffer (pH 8,5) door het oplossen van 84 mg van natriumbicarbonaat in 10 mlMilliQ H2O Het is niet nodig de pH. Deze oplossing kan bevroren worden opgeslagen voor het volgende gebruik (bijv. stap 6.1).
- Het voorbereiden PEGylering oplossing.
- Bereid een PEG mengsel van 0,2 mg gebiotinyleerd NHS-ester PEG (5000 Da) 13 en 8 mg NHS-ester mPEG (5000 Da) in een 1,5 ml buis. Bij de voorbereiding van N aantal dia's, bereiden N keer grotere hoeveelheid van de PEG mengsel in een enkele buis.
- Voeg 64 ul (of N tijden 64 ul voor N aantal dia's) van de vers bereide buffer (Stap 4.2). Pipet op en neer om ze volledig op te lossen.
- Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 1 minuut om luchtbellen te verwijderen. Niet achteraf pipet. Anders zal luchtbellen die interfereren met PEGylation bij stap 4.4.
- PEGylering.
- Drop 70 pl van de PEGylatie mengsel tot een droge kwarts dia uit stap 4.1. Gebruik 90 ul bij 24 x 50 mm 2 coverslip.
- Plaats voorzichtig een gedroogde dekglaasje van Stap 4.1 over de oplossing.
- Om een uniforme en hoge kwaliteit van PEGylation hebben, zorgen voor luchtbellen in te voeren. Door oppervlaktespanning, de meeste van de luchtbellen spontaan het reactievolume verlaat binnen vijf minuten door oppervlaktespanning.
- Incubeer de glaasjes in een donkere en vochtige omgeving. De halfwaardetijd van NHS-ester PEG die we bij pH 8 is ongeveer een uur. Minstens, incubeer ze gedurende 2 uur. Overnacht incubatie leidt tot hogere kwaliteit van PEGylatie (gegevens niet getoond).
5. Lange-termijn opslag
De gepegyleerde dia's en dekglaasjes in N 2 Magazijn bij -20 º C.
- Drogen dia's en dekglaasjes. Demonteer voorzichtig de glijbaan en het dekglaasje door te schuiven het dekglaasje naar een kant, spoel ze af met MilliQ H 2 O, en droog ze af met N2.
- Opslaan glijbanen en dekglaasjes. For onmiddellijk gebruik, volgt u de procedure voor de tweede ronde van PEGylering (stap 6). Om voor een langere periode van tijd, volg dan de volgende stappen.
- Plaats een paar van de glijbaan en het dekglaasje in een 50 ml buisje, zodanig dat de gePEGyleerde oppervlakken afgekeerd van elkaar.
- Gedeeltelijk sluit de buis, vacuüm de buis, en vul het vervolgens met N2. Deze stappen helpen behouden gePEGyleerde oppervlakte voor een lange tijd. Schroef de slang stevig vast en bewaar bij -20 ° C. De kwaliteit van de dia's blijft goed voor maximaal 3 maanden (figuur 3a, rechts).
6. Oppervlaktepassivering behulp Polymer (de tweede ronde)
Extra ronde van PEGylering aan de PEG-laag dichter te maken en ook om eventueel achtergebleven amine groepen op het oppervlak te lessen. Het gebruik van korte NHS-ester PEG-moleculen (333 Da) effectief kan zijn bij het doordringen in een bestaande PEG laag. Het is recaan te raden een tweede ronde van PEGylering doen vlak voor het gebruik van een glijbaan.
- Het voorbereiden reactie buffer. Bereid 0,1 M vers natriumbicarbonaat buffer (pH 8,5). De bevroren oplossing van stap 4.2 kan worden gebruikt.
- Het voorbereiden PEGylering oplossing. Los 7 pi 250 mM MS4-PEG in 63 pl natrium bicarbonaat buffer.
- PEGylering. Volg dezelfde procedure als in stap 4.4. Incubeer gedurende 30 minuten tot 's nachts.
- Drogen dia's en dekglaasjes. Demonteer het paar van de glijbaan en het dekglaasje, spoel ze met MilliQ H 2 O, droog ze met N2, en bewaar ze in een schone pipet doos. Doorgaan voor het samenstellen van een microfluïdische kamer in stap 7.
7. Samenstellen Microfluidic Kamer
Het samenstellen van een microfluïdische kamer met behulp van een paar van een gepegyleerde kwarts glijbaan en een dekglaasje. Dubbelzijdig plakband wordt gebruikt als een spacer. De kamer wordt afgesloten met Epoxy lijm en, zolossingen worden ingebracht door de gaten in de kwarts dia.
- Plaats een kwarts dia op een vlakke ondergrond met de gepegyleerde zijde naar boven.
- Maak een kanaal (breedte 5-7 mm) diagonaal op de gepegyleerde oppervlak door er dubbelzijdige kleverige tapes over de glijbaan. Zorg ervoor dat de gaten zich in het midden van het kanaal. Verzorgen de PEGylated oppervlak niet te verwennen tijdens het proces van het maken van een kamer. Het is mogelijk om een multi-channel slide te maken door het plaatsen van en het steken van de dubbelzijdige kleverige tapes anders (zie figuur 2).
- Plaats voorzichtig een PEGylated dekglaasje op de top om de kamer te voltooien. De gepegyleerde zijde moet naar beneden.
- Sluit de ruimte af door op de dekglaasje over het gebied waar de dubbelzijdige tapes worden geplaatst. Doe het grondig, maar voorzichtig, zodat de kamer wordt water-goed afgesloten.
- Sluit de randen van de kamer met epoxylijm.
- Immobiliseren Streptavidin of neutravidine op degebiotinyleerd PEG laag door toevoeging van 50 pi 0,1 mg / ml streptavidine of neutravidine oplossing T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl buffer) met een p200 pipet. Na 1 min incubatie, spoelen met 100 ul buffer T50.
- Voeg gebiotinyleerde biologische moleculen voor uw single-molecule beeldvorming.
8. Schuif Recycling
Recycling kwarts dia's. Gebruikte dia's worden gerecycled door te nemen uit de dekglaasjes en de dubbelzijdige kleverige tapes.
- Na gebruik, bewaar de kamers in leidingwater. Langdurige incubatie in het water vergemakkelijkt demontage van de kamers.
- Kook de kamers in leidingwater met behulp van een magnetron. Gebruik een Pyrex beker. Kook gedurende 10 minuten of langer.
- Haal de dekglaasjes en de dubbelzijdige kleverige tapes met behulp van een scheermesje. Druk niet op een quartz dia loodrecht op zijn vlak. Anders, het breekt. Houd het scheermesje uit de buurt van het kanaal. Otherwise, introduceert krassen op het kanaal.
- Spoel de glaasjes met een allesreiniger door wrijven ze met de vingers.
- Plaats de dia's in een glazen pot kleuring. Typisch 5 tot 15 slides in een pot geplaatst. Voeg 10% afwasmiddel en ultrasone trillingen de dia's voor 20 minuten of langer. De dia's spoelen met een grote hoeveelheid kraanwater.
- Ga naar stap 1.2.
Representative Results
Na de microfluïdische kamer assemblage (Step 7,1-7,6) en voor het uitvoeren van Stap 7.7, is het aangeraden de kwaliteitscontrole van de gepegyleerde oppervlak uit te voeren.
Als het oppervlak passivering succesvol is gedaan, zijn er minder dan 10 niet-specifiek geadsorbeerde eiwitten per opnamegebied (25 mm x 25 mm) waargenomen bij 1-10 nM fluorescerend gemerkt eiwit wordt toegevoegd in de kamer (figuur 3a, links).
Wanneer een van de reiniging of reactie stappen is niet correct zijn uitgevoerd, het aantal niet-specifiek geadsorbeerd eiwitten aanzienlijk verhoogt, en de CCD-scherm kan worden verzadigd door fluorescentie signalen. Als bijvoorbeeld Piranha etsen overgeslagen er 100 keer grotere hoeveelheid niet-specifieke adsorptie waargenomen (figuur 3a, vergelijk links midden). Wanneer de tweede PEGylation stap wordt overgeslagen, was er ongeveer 3 keersa grotere hoeveelheid niet-specifieke adsorptie waargenomen (Figuur 3b). Een lage graad van PEGylatie wordt waargenomen wanneer verlopen chemicaliën (bijv. APTES bewaard bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden) worden gebruikt (gegevens niet getoond). De kwaliteit van het oppervlak komt ook omlaag wanneer een aanzienlijke hoeveelheid tijd is voorbij want het was PEGylated (figuur 3a; vergelijken links met rechts).
Naar ons beste weten, het is de eerste keer dat de twee rondes van PEGylering worden ingevoerd voor single-molecule studies. De twee rondes van PEGylering garanderen de hoogste kwaliteit van PEG laag vorming (figuur 3b). De superieure aard van de dubbele PEGylation wordt prominent getoond in de films (Vergelijk Film 1a met Movie 1b). In deze filmpjes worden de achtergrond signalen van fluorescerende moleculen in oplossing waargenomen dat veel zwakker wanneer de dubbele PEGylering was zijn gebruikt, wat aangeeft dat eiwitten efficiënter worden afgestoten door de dubbel gePEGyleerd laag. Hoewel dit proces in twee stappen sterk wordt geadviseerd, kan de tweede PEGylation stap overslaan als uw experiment is aanvaardbaar voor niet-optimale passiveren.
Figuur 1. Schema van de oppervlaktebehandeling (a) een microscoopglaasje wordt gereinigd met aceton, KOH en piranha oplossingen. Het is gefunctionaliseerd met APTES en gePEGyleerd met NHS-ester PEG. (B) een dekglaasje wordt gereinigd met KOH, en met Piranha oplossing indien nodig. Het is gefunctionaliseerd met APTES en gePEGyleerd met NHS-ester PEG.
fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2:. Microfluidic kamer (a) Een single-channel kamer. De microscoop dia heeft twee gaten geboord. Het is gemonteerd met een dekglaasje met behulp van twee plakken van een dubbelzijdig plakband. (B) Een drie-kanaal kamer. De microscoop slide heeft zes gaten geboord. Het is gemonteerd met een dekglaasje met vier segmenten van een dubbelzijdig plakband.
Figuur 3: CCD beelden die met kleurstof gemerkte eiwitten in oplossing. (A) CCD beelden werden genomen door prisma-achtige totale interne reflectie fluorescentie microscopie met behulp van een 60X objectief met 10 nM Cy3-labeld Rep in oplossing. (Links) een oppervlak werd bereid volgens het protocol in dit artikel. (Midden) Een oppervlakte was voorbereidingrood volgens het protocol in dit artikel, maar piranha etsen werd overgeslagen. (Rechts) Een oppervlak werd bereid volgens het protocol in dit artikel en opgeslagen voor 3 maanden bij -20 º C onder stikstof. (B) CCD beelden die met 10 nM Cy3-labeld Rep in oplossing. (Links) een oppervlak werd bereid volgens het protocol in dit artikel. (Rechts) Een oppervlak werd bereid volgens het protocol in dit artikel, maar de tweede ronde van PEGylering werd overgeslagen. Schaal bar = 5 micrometer.
Film 1: CCD films die met kleurstof gemerkte eiwitten in oplossing. CCD films werden genomen door prisma-achtige totale interne reflectie fluorescentie microscopie met behulp van een 60X objectief met 10 nM Cy3-labeld Rep in oplossing. De tijd resolutie is 100 msec. (A) Een oppervlak werd bereid volgens het protocol in dit artikel. (B) Een oppervlak werd bereid volgens het protocol in dit artikel, maar de tweede ronde van PEGylatie werd overgeslagen. Klik hier om Movie 1a bekijken en klik hier om Movie 1b bekijken.
Discussion
Kritische stappen binnen dit protocol
Het is essentieel om het oppervlak hydrofiel te maken voor de amino-silanisatie reactie. Dit werd bereikt door Piranha etsen die de vrije hydroxylgroepen op glas / kwarts oppervlak genereert. Het wordt afgeraden Piranha geëtste oppervlak blootgesteld aan H2O of lucht voor een lange tijd omdat de hydrofiliciteit van het oppervlak te houden daalt geleidelijk.
De NHS-ester PEG-moleculen reactief. Het is aangeraden om monsters te maken en op te slaan onder stikstof bij -20 º C. De houdbaarheid van de APTES chemische stof in de kamertemperatuur is kort. Het is aangeraden om het te vervangen door een nieuwe elke maand.
Wijzigingen van dit protocol
Wanneer u de piranha etsen om welke praktische reden niet kunt gebruiken, kunt u etsen met behulp van KOH voor een lange periode (bijvoorbeeld overnight), die zal ook hydroxylgroepen blootgesteld. De valkuil van deze alternatieve benadering is dat de schuif onbruikbaar na enige hercirculeringsstromen gevolg van ernstige krassen.
Het wordt vaak beoefend om een glas / kwarts oppervlak branden met propaan fakkel, die effectief in het elimineren fluorescerende organische materialen 7 is. Deze procedure is niet opgenomen in dit protocol omdat het overbodig Piranha etsen. Merk op dat deze procedure zal mogelijk leiden tot oxidatie van de hydroxylgroepen. Daarom moet deze procedure niet worden uitgevoerd zodra een oppervlak werd geëtst met behulp van KOH of piranha oplossing.
Wanneer een buffer met een pH lager dan 7 wordt gebruikt voor single-molecule beeldvorming, de conformatie van PEG verandert van "paddestoel" naar "borstel", die de mate van passivering vermindert. Daarom, als de pH lager dan 7,0 wordt gebruikt, wordt aanbevolen verder passiveren het oppervlak met disuccinimidyl tartraat <sup> 7.
Perspectieven
Dit werk heeft een robuust protocol voorzien voor het bereiken van een hoge kwaliteit van het oppervlak passiveren. Dit protocol zal nuttig zijn voor enkel-molecuul fluorescentie studies die betrokken zijn met eiwitten 14 en eiwitcomplexen in cel extracten en immunoprecipitaten 15 zijn. Het zal wijd voor andere enkel-molecuul technieken zoals kracht spectroscopie en koppel spectroscopie 16. Het zal ook nuttig zijn voor het voorkomen van cellen adsorberen aan een oppervlak 17 zijn.
Het protocol als bedoeld in dit werk is veeleisend voor zijn multi-step procedures. Oppervlaktepassivering behulp van lipide-PEG 8 en poly-lysine PEG 9 zijn beschikbaar als een alternatieve benadering. Aangezien ze geen chemische reacties is eenvoudig te implementeren vereisen. De mate van passivering is niet zo hoog als die verkregen door chemische modificatie van een oppervlak.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
SDC, ACH, en CJ werden gesteund door Starting Grants (ERC-StG-2012-309509) door de European Research Council. J.-MN werd gesteund door de National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) van Korea; en de Pioneer Research Center Program (2012-009586) via de NRF Korea gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap, ICT, en Toekomst Planning (MSIP). Dit werk werd ondersteund door Centrum voor BioNano Gezondheid-Guard gefinancierd door MSIP van Korea zoals het Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL en J.-HH werden gesteund door de Seoul Science Fellowship Program van Seoul, Korea. De gelabelde Rep eiwit was een gulle gift van Dr Sua Myong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J. Surface that resist biodegradation. Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
