Summary
Мы опишем метод для пассивации поверхности стекла с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ). Этот протокол охватывает очистки поверхности, поверхности функционализации и PEG покрытие. Введем новую стратегию для обработки поверхности с молекулами ПЭГ в течение двух раундов, что дает высокое качество пассивации по сравнению с существующими методами.
Abstract
Одиночных молекул флуоресцентная спектроскопия оказалась важную роль в понимании широкий спектр биологических явлений на наноуровне. Важные примеры того, что эта техника может уступать биологических наук являются механистические идеи о белок-белковых и взаимодействий белок-нуклеиновых кислот. Когда взаимодействия белков исследовали на уровне в одиночных молекул, белки или их субстраты часто иммобилизованных на поверхности стекла, что позволяет для долгосрочного наблюдения. Эта схема иммобилизации может ввести нежелательных артефактов поверхности. Таким образом, очень важно для пассивации поверхности стекла, чтобы сделать его инертным. Покрытие поверхности с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) выделяется своей высокой производительности в предотвращении белки от неспецифически взаимодействовать с поверхности стекла. Однако процедура полимерное покрытие трудно, в связи с осложнением, вытекающие из серии поверхностных обработок и строгих требований, что поверхность должнабыть свободным от любых флуоресцентных молекул в конце процедуры. Здесь мы предоставляем надежный протокол с шаг за шагом инструкции. Она охватывает очистку поверхности, включая пираньи травления, функционализации поверхности с аминогруппами и, наконец, ПЭГ покрытия. Для получения высокой плотности слоя PEG, введем новую стратегию обработки поверхности с молекулами ПЭГ в течение двух раундах, а это заметно повышает качество пассивации. Мы предоставляем репрезентативные результаты, а также практические советы для всех критических этапах, так что любой может достичь качества пассивации поверхности высокую.
Introduction
При выполнении исследование белка одиночных молекул важно для достижения высокого качества пассивации поверхности так, что эксперимент свободен от любой неисправности поверхностного белка, вызванной денатурации или 1,2. В то время как стеклянная поверхность обрабатывают поверхностно-активных веществ, таких как бычий сывороточный альбумин, обычно используется для одной молекулы нуклеиновых кислот исследований 3, степень его пассивации недостаточно высока для белковых исследований. Стеклянная поверхность с полимерным покрытием (полиэтиленгликоля, ПЭГ) превосходит в производительности пассивация 4-6. Таким образом, она стала повсеместно используется для белковых одной молекулы исследований с тех пор она была введена в одиночных молекул флуоресцентного исследования 7-10. Процедура полимерное покрытие требует нескольких обработки поверхности 7,11,12. Таким образом, это трудно следовать всю процедуру без подробных инструкций. Часто степень пассивации поверхности изменяется в зависимости от того, какой протокол яс последующим. Здесь мы представляем надежную протокол с шаг за шагом инструкции, что позволит удалить один из основных узких мест исследований белковых одиночных молекул. См. рисунок 1 для обзора.
Protocol
1. Вставьте подготовка и очистка
Микрофлюидных камера состоит из кварцевого горкой и покровного стекла. В призма типа полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия, поверхность кварцевой слайд изображается. Таким образом, важно, чтобы очистить кварцевый слайд тщательно с использованием H 2 O, ацетон, KOH, и Piranha решений. Че это многоэтапный очистки исключает флуоресцентные органические молекулы на поверхности, которая мешать измерений одной молекулы флуоресценции. Кроме того, пиранья травление делает поверхность гидрофильной кварц путем генерации гидроксильных групп. Свободные гидроксильные группы необходимы для реакции амино-силанизации в шаге 3.
- Бурение кварцевые горки. Дрель пару отверстий в кварцевую слайда с 3/4 мм алмаз бурового долота (рис. 2а). Если несколько каналов желании развернуть больше годовыхIRS отверстий (рис. 2б). Эти отверстия используются для инъекционных растворов в микрожидком камеры на шаге 7.
- Держите сверло мокрые в H 2 O при бурении. H 2 O выполняет роль смазки, что увеличивает срок службы бурового долота.
- Иногда вытирая кончик бурового долота помогает сверления отверстий.
- После сверления отверстий, отметьте одну сторону горкой для легкой идентификации в процессе ПЭГилирования. Маркеры могут быть использованы в качестве ссылки, чтобы избежать путаницы в дальнейшем. Для маркировки, алмаз сверло можно использовать. Не используйте ручку с чернилами может получить на поверхности.
- Очистка с H 2 O. Поместите слайды в окрашивания стеклянной банке. Обычно от 5 до 15 скользит могут быть размещены в одном банке. Промыть слайды с MilliQ H 2 O. Повторите это 3 раза и разрушать ультразвуком слайды с MilliQ H 2 O в течение 5 мин, чтобы удалить грязь. Утилизировать воду и промыть слайды снова 3 разаMilliQ H 2 O. Отметим, что 130 Вт сила ультразвуком используется для этого протокола. Повышенная мощность ультразвуком может уменьшить срок службы кварцевых предметных стеклах.
- Очистка с помощью ацетона. Замените MilliQ H 2 O с ацетоном. Разрушать ультразвуком слайды с ацетоном в течение 20 мин или дольше.
- Промывка H 2 O. Откажитесь от ацетон и промыть слайды с MilliQ H 2 O. Повторить 3 раза, чтобы удалить любые остатки ацетон.
- Очистка с помощью КОН. Замените воду с 1 М КОН и разрушать ультразвуком слайды для 20 мин или дольше. Чрезмерное травления (например, лечение КОН на ночь) повысит качество поверхности, но введет царапины, которые могут помешать флуоресцентных изображений.
- Промывка H 2 O. Промыть слайды с MilliQ Н 2 О на 3 раза, чтобы удалить следы КОН.
- Пиранья травления.
- Перенесите слайды в держатель слайдов Duran или заказ держателя тефлоновой и пласе их в химическом стакане (1 л), который находится в химическом капотом.
- Заполните стакан с 450 мл H 2 SO 4.
- Добавить 150 мл H 2 O 2 для 3:01 соотношения H 2 SO 4 и H 2 O 2. Как только раствор закипит спонтанно, повышением температуры более 90 ° С. Убедитесь в том, что решение Н 2 О 2 является при комнатной температуре перед началом реакции. В противном случае, температура кипения раствора может быть ниже 90 ° С.
- Раствор перемешивают в течение правильного смешивания и пусть стакан спокойно в течение 20 мин.
- Возьмите слайды из пираний растворе вместе с держателя слайдов, и поместить их в держатель слайдов, содержащего MilliQ H 2 O. Между тем, отказаться от пираньи решение в назначенный бутылки отходов как только он достигнет комнатной температуры.
- Промыть слайды 3 раза MilliQ H 2 O. Особую осторожность должны быть приняты в дальнейшем степс, чтобы избежать любого возможного загрязнения слайдов. Перейдите к шагу 3. Рекомендуется незамедлительно приступить к следующим шагам.
* Внимание: Решение пираньи чрезвычайно реактивным. При работе с этим решение дополнительная следует проявлять осторожность. Кроме того, когда по ошибке, смешанного с органических растворителей, таких как ацетон, это может привести к взрыву.
2. Покровные очистки
Микрофлюидных камера состоит из кварцевого горкой и губы крышку с. При использовании призмы типа TIRF микроскоп, поверхность покровным не отображены. Таким образом, это достаточно, чтобы очистить покровное только с Н 2 О и КОН. В случае, если покровное должна быть отображены (например, через цель типа TIRF микроскопии), рекомендуется для лечения покровные с пираньи решения (этап 1.7). Заметим, что если ПЭГилирование поверхности покровного не высокого качества, оно может действовать в качестве поглотителя белковг порождают различия в концентрации белка.
- Промывка H 2 O. Место покровные (24 х 30, 24 х 40 или 24 х 50 мм 2) в окрашивания стеклянной банке. Обычно от 5 до 15 покровные могут быть размещены в одном банке. Промыть покровные 3 раза с MilliQ H 2 O.
- Очистка с помощью КОН. Замените воду 1М КОН и разрушать ультразвуком покровные в течение 20 мин или дольше.
- Промывка H 2 O. Промыть покровные 3 раза MilliQ H 2 O для удаления следов КОН. Перейдите к шагу 3.
3. Амино-силанизация слайдов и покровные
Функционализации поверхности кварцевых предметных стеклах и покровные с аминогруппой с помощью химии амино-силанизация. Метанол используется в качестве растворителя и уксусной кислоты в качестве катализатора для реакции амино-силанизация.
- Промывка метанолом. Замените MilliQ H 2 O в окрашивания блюд (от SТЭЦ 1 и 2) метанолом. Хранить слайды и покровные в метаноле до шаге 3.3. Не хранить горки и покровные в метаноле в течение неоправданно длительного периода времени (например, несколько часов) с примесей в метаноле будет адсорбироваться на поверхности.
- Подготовка амино-силанизации решение.
- Промыть пайрексовой колбе несколько раз метанолом. Обрабатывают ультразвуком колбу с метанолом в течение 5 мин или дольше. Он сообщил, иметь специальный сосуд, который поддерживается в чистоте.
- Налейте 100 мл метанола в колбу.
- Добавляют 5 мл уксусной кислоты.
- Добавьте 3 мл APTES (3-аминопропилтриметоксисилан) и аккуратно перемешать, встряхивая его.
- Амино-силанизация. Замените метанола в окрашивания блюд, которые содержат слайды и покровные с реакционной aminosilanization смеси.
- Инкубировать в течение 20-30 мин. Во время инкубации, разрушать ультразвуком раз в течение 1 мин.
- Промывка метанолом. Замените AРеакция minosilanization метанолом. Отменить метанола и добавить свежий раствор метанола. Повторите эту процедуру три раза.
4. Пассивации поверхности Использование полимера (первый раунд)
Пассивации амина покрытием поверхности кварцевых предметных стеклах и покровные путем конъюгации NHS-эфира полиэтиленгликоля (ПЭГ). Эта реакция осуществляется с насыщающей концентрацией ПЭГ растворе при рН 8,5 в течение ночи.
- Сушка горки и покровные. Высушите горки и покровные, используя N 2 газ и разместить их в чистых пипеток коробки таким образом, чтобы сторона, которая должна быть ПЭГилированный вверх. Пипетка коробка частично заполнен MilliQ H 2 O. Это влажная среда предотвращает ПЭГилирование решение от высыхания во время инкубации в течение ночи.
- Подготовка буфера реакции. Подготовка 0,1 М бикарбоната натрия свежего буфера (рН 8,5) путем растворения 84 мг бикарбоната натрия в 10 млMilliQ H 2 O. Там нет необходимости корректировки рН. Этот раствор можно хранить в замороженном виде следующего использования (например, на стадии 6.1).
- Подготовка ПЭГилирование решение.
- Приготовить смесь ПЭГ 0,2 мг биотинилированных NHS-эфир ПЭГ (5000 Да) 13 и 8 мг NHS-эфира MPEG (5000 Да) в 1,5 мл трубки. При подготовке N количество слайдов, готовить N раз большее количество смеси ПЭГ в одной пробирке.
- Добавить 64 мкл (или N раз 64 мкл для N количество слайдов) свежеприготовленного буфера (Шаг 4.2). Внесите его вверх и вниз, чтобы растворить их полностью.
- Центрифуга с 16100 мкг в течение 1 мин для удаления пузырьков воздуха. Не пипетки впоследствии. В противном случае, пузырьки воздуха сформируют которые препятствуют ПЭГилирования на шаге 4.4.
- ПЭГилирование.
- Оставьте 70 мкл ПЭГилирования смеси высушенной кварцевого слайда с шага 4.1. Используйте 90 мкл в случае 24 х 50 мм 2 соуerslip.
- Аккуратно поместите высушенный покровное с шага 4.1 над раствором.
- Чтобы иметь форму и высокое качество ПЭГилирования, заботиться, чтобы не вводить пузырьков воздуха. В связи с поверхностным натяжением, большинство воздушных пузырьков может спонтанно оставить объем реакционной смеси в течение пяти минут благодаря поверхностному натяжению.
- Инкубируйте слайды в темном и влажной среде. Период полураспада NHS-эфира PEG, которые мы используем при рН 8 составляет около одного часа. Как минимум, инкубировать их в течение 2 часов. Инкубации в течение ночи приводит к более высокому качеству ПЭГилированием (данные не показаны).
5. Долговременное хранение
Хранение слайды Пегилированный и покровные в N 2 при температуре -20 ° С.
- Сушка горки и покровные. Тщательно разобрать горка и покровное, сдвинув покровное боку, промойте их MilliQ H 2 O, и высушите их с N 2.
- Хранение горки и покровные. Фог немедленного использования, выполните процедуру для второго тура ПЭГилирования (шаг 6). Для того чтобы хранить в течение более длительного периода времени, выполните следующие шаги.
- Поместите пару ползуна и покровное в 50 мл пробирку так, чтобы поверхности ПЭГилированные сталкиваются друг от друга.
- Частично закрыть трубу, вакуумные трубки, а затем заполнить его с N 2. Эти шаги помогают сохранению поверхность пегилированного в течение длительного периода времени. Винт трубку плотно и хранить его при температуре -20 ° С. Качество слайдов остается хорошим на срок до 3 месяцев (рис. 3, справа).
6. Пассивации поверхности Использование полимера (второй тур)
Дополнительная раунд ПЭГилирования чтобы сделать слой плотнее PEG, а также, чтобы утолить все оставшиеся аминогруппы на поверхности. Использование коротких молекул NHS-эфир ПЭГ (333 Да) может быть эффективным в проникновении в существующую ПЭГ слоя. Это рекомендациядуется, чтобы сделать эту второй раунд ПЭГилирования прямо перед использованием слайд.
- Подготовка буфера реакции. Подготовка 0,1 М бикарбоната натрия свежего буфера (рН 8,5). Замороженный раствор, полученный на стадии 4.2, также могут быть использованы.
- Подготовка ПЭГилирование решение. Растворить 7 мкл 250 мМ MS4-PEG в 63 мкл буфера бикарбоната натрия.
- ПЭГилирование. Выполните ту же процедуру, как в шаге 4.4. Инкубировать 30 мин до в течение ночи.
- Сушка горки и покровные. Разберите пару слайде и покровное, промойте их MilliQ H 2 O, высушить их с N 2, и держать их в чистом поле пипетки. Перейдите по сборке микрофлюидных камеру в шаге 7.
7. Сборка микрофлюидном палату
Сборка микрофлюидных камеру, используя пару кварцевой слайд ПЭГилированного и покровное. Двусторонняя липкая лента используется в качестве прокладки. Герметизации камеры эпоксидным клеем и, таким образом,lutions вводятся через отверстия в кварцевой слайда.
- Наведите кварцевый слайд на плоской поверхности, чтобы сторона ПЭГилированный вверх.
- Сделать канал (ширина от 5 до 7 мм) по диагонали на поверхности ПЭГилированного, поставив двусторонние липкие ленты на слайде. Убедитесь, что отверстия расположены в центре канала. Позаботьтесь, чтобы не испортить поверхность Пегилированный в процессе принятия камеру. Это можно сделать многоканальный слайд с путем размещения и приклеить двухсторонний липкие ленты-разному (см. рисунок 2).
- Аккуратно поместите покровное Пегилированный на вершине, чтобы завершить камеру. Боковая ПЭГилированный должна быть обращена вниз.
- Закройте камеру, нажав покровное над районом, где двусторонние ленты размещены. Сделайте это осторожно, но тщательно, так что камера становится водой плотно закрытыми.
- Закройте края камеры эпоксидным клеем.
- Остановите Стрептавидин или Neutravidin набиотинилированный PEG слой добавлением 50 мкл 0,1 мг / мл стрептавидина или Neutravidin раствора в Т50 (10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 50 мМ буфера NaCl) с использованием P200 пипетки. Через 1 мин инкубации на одном уровне с 100 мкл буфера T50.
- Добавить биотинилированных биологических молекул для работы с изображениями вашего одиночных молекул.
8. Вставьте Переработка
Переработка кварцевые слайды. Подержанные горки перерабатываются, сняв покровные и двухсторонние липкие ленты.
- После использования хранить камеры в водопроводной воде. Долгосрочный инкубации в воде облегчает разборку камер.
- Отварить камеры в водопроводной воде с использованием микроволновой печью. Используйте стакан Pyrex. Варить в течение 10 мин или дольше.
- Взлетел покровные и двухсторонние липкие ленты, используя лезвие бритвы. Не нажимайте кварцевый слайд перпендикулярно ее плоскости. В противном случае, он ломает. Держите лезвие от канала. Ветхий Заветherwise, он вводит царапин на канале.
- Промыть слайды, используя бытовое моющее средство, потерев их пальцами.
- Поместите слайды в окрашивания стеклянной банке. Обычно от 5 до 15 скользит могут быть размещены в одном банке. Добавить 10% бытовое моющее средство и разрушать ультразвуком слайды для 20 мин или дольше. Промыть слайды с большим количеством вкладок воды.
- Переходите к этапу 1.2.
Representative Results
После микрофлюидных сборки камеры (Шаг 7.1 - 7.6) и перед проведением Шаг 7,7, рекомендуется проводить контроль качества поверхности ПЭГилированного.
Если поверхность покрытие было сделано успешно, есть менее 10 неспецифически адсорбируются белки на область изображения (25 мм х 25 мм) наблюдается при 1-10 нМ флуоресцентно меченных белков добавляется в камеру (рис. 3а, слева).
Когда любой из очищающих или реакции шагов не была должным образом проведена, количество неспецифически адсорбируются белки значительно увеличивает, и экран ПЗС может быть насыщенным по сигналов флуоресценции. Например, если пиранья травление пропускается, что в 100 раз большее количество неспецифической адсорбции наблюдаемого (3а, сравните остается посередине). Когда второй шаг ПЭГилирование пропускается, было около 3 разса большее количество неспецифической адсорбции наблюдается (рис. 3б). Низкая степень ПЭГилированием наблюдается, когда истек химические вещества (например, APTES хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев) используются (данные не показаны). Качество поверхности также падает, когда значительное количество времени прошло с тех пор, это было ПЭГилированный (рис. 3а; сравнить остается справа).
Насколько нам известно, это первый случай, когда два раунда ПЭГилирования вводятся для одиночных молекул исследований. Два раунда ПЭГилирования гарантировать высочайшее качество ПЭГ формирования слоя (рис. 3б). Высшая природа двойного ПЭГилирования очень наглядна показано в кино (Сравните Movie 1а с Movie 1b). В этих фильмах, фоновые сигналы от флуоресцентных молекул в растворе наблюдаются значительно слабее, когда двойное ПЭГилирование было использован, который указывает, что белки отталкиваются более эффективно двукратно пегилированного слоя. Хотя это двухэтапный процесс настоятельно рекомендуется, второй шаг ПЭГилирование может быть пропущен, если ваш эксперимент терпимо к неоптимальной пассивации.
Рисунок 1:. Схема поверхностных обработок (а) стекло микроскопа очищают с помощью ацетона, KOH, и пираньи растворов. Это функционализированных APTES и обработанного полиэтиленгликолем с NHS-эфира ПЭГ. (Б) покровное очищают с помощью КОН, а также с пираньи раствора, если необходимо. Это функционализированных APTES и обработанного полиэтиленгликолем с NHS-эфира ПЭГ.
fig2highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 2:. Микрофлюидных камера (а) камера одноканальный. Микроскопа имеет два отверстия, просверленные. Он собран с покровным используя два куска двухсторонней липкой лентой. (Б) камера трехканальный. Микроскопа имеет шесть отверстия, просверленные. Он собран с покровным с помощью четырех ломтиков двухсторонней липкой лентой.
Рисунок 3: CCD снимки, сделанные с белками красителем помечены в растворе. (А) CCD снимки были сделаны с использованием 60X объектив с 10 нМ Су3 labeld Rep в растворе призма типа общей флуоресценции внутреннего отражения микроскопии. (Левый) поверхность получают в соответствии с протоколом в этой статье. (Ближний) поверхность была подгокрасный, следуя протоколу, в этой статье, но пираньи травления была пропущена. (Правый) поверхность получают в соответствии с протоколом в этой статье, и хранится в течение 3 месяцев при температуре -20 ° С в атмосфере азота. (Б) CCD снимки, сделанные с 10 нМ Су3 labeld Rep в растворе. (Левый) поверхность получают в соответствии с протоколом в этой статье. (Правый) поверхность получают в соответствии с протоколом в этой статье, но второй раунд ПЭГилирования была пропущена. Шкала бар = 5 мкм.
Фильм 1: CCD фильмы, сделанные с белками красителем помечены в растворе. CCD фильмы были приняты с использованием 60X объектив с 10 нМ Су3 labeld Rep в растворе призма типа общей флуоресценции внутреннего отражения микроскопии. Временное разрешение составляет 100 мс. (А) поверхность получают в соответствии с протоколом в этой статье. (Б) поверхность получают в соответствии с протоколом в этой статье, но второй раунд PEGylAtion была пропущена. Нажмите здесь , чтобы посмотреть фильм 1а и нажмите здесь , чтобы посмотреть фильм 1b.
Discussion
Критические шаги в рамках этого протокола
Очень важно, чтобы сделать поверхность гидрофильной перед реакцией амино-силанизации. Это было достигнуто за счет пираньи травления, который генерирует свободные гидроксильные группы на стекло / поверхности кварца. Рекомендуется не держать пираньи протравленной поверхности подвергаются либо H 2 O или воздуха в течение длительного периода времени с момента гидрофильности поверхности постепенно понижается.
Молекулы NHS-эфир ПЭГ являются реактивными. Это рекомендуется сделать аликвоты и хранить их в атмосфере азота в -20 º С. Срок хранения химической APTES при комнатной температуре коротка. Рекомендуется заменить его на новый каждый месяц.
Модификации этого протокола
Если вы не можете использовать пираньи травление для любого практического разума, вы можете травления с использованием КОН в течение длительного периода времени (например, оvernight), который также сделает подвергается гидроксильные группы. Ловушка этого альтернативного подхода является то, что слайд становится непригодным для использования после нескольких рециклов из-за тяжелых царапин.
Это часто практикуется сжечь стекло / кварцевый поверхность с помощью пропановой горелки, которая является эффективной в устранении люминесцентные органических материалов 7. Эта процедура не была включена в этот протокол, потому что он является излишним в пираньи травления. Следует отметить, что эта процедура будет потенциально может привести к окислению гидроксильными группами. Таким образом, эта процедура не должна осуществляться один раз в поверхность травили с использованием КОН или пираньи решение.
Когда буфер с рН менее 7 используется для формирования изображения одиночных молекул, конформация ПЭГ изменяется от "гриба" до "кистью", который уменьшает степень пассивации. Таким образом, при рН ниже, чем 7,0 используется, рекомендуется для дальнейшего пассивации поверхности с помощью дисукцинимидил тартрат <SUP> 7.
Перспективы
Эта работа обеспечила надежную протокол для достижения высокого качества поверхности пассивации. Этот протокол будет полезен для одиночных молекул исследований флуоресценции, которые связаны с белками 14, а также белковых комплексов в пределах клеточных экстрактов и иммунопреципитаты 15. Это будет широко использоваться для других методов одиночных молекул, таких как силовой спектроскопии и крутящего момента спектроскопии 16. Это будет также полезно для предотвращения клетки от адсорбции к поверхности 17.
Протокол предоставляется в этой работе требует для своих многоступенчатых процедур. Пассивации поверхности с помощью липидного-ПЭГ 8 и поли-лизин ПЭГ 9 доступны в качестве альтернативного подхода. Так, они не требуют никаких химических реакций это легко осуществить. Тем не менее, степень пассивации не выше, чем достигается путем химического MODIFication поверхности.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
SDC, ACH, и CJ были поддержаны Начиная грантов (ERC-STG-2012-309509) через Европейский исследовательский совет. Ж.-MN при поддержке Национального исследовательского фонда (ПЗФ) (2011-0018198) Корея; и Программа научно-исследовательский центр Pioneer (2012-009586) через NRF Корея финансируется Министерством науки, ИКТ, и будущее планирования (MSIP). Эта работа была поддержана Центром BioNano здравоохранения-гвардии финансируемого MSIP Корея в качестве глобального проекта Frontier (Н-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL и Ж.-HH были поддержаны Сеул научное общество Программы Сеула, Корея. Меченый белок Rep был щедрый подарок от доктора Суа Мен.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J. Surface that resist biodegradation. Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
