Summary
نحن تصف طريقة لتخميل سطح الزجاج باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG). هذا البروتوكول يشمل تنظيف السطح، functionalization السطح، وPEG الطلاء. ونحن نقدم استراتيجية جديدة لعلاج السطح مع الجزيئات PEG على جولتين، والتي ينتج نوعية متفوقة من التخميل بالمقارنة مع الطرق القائمة.
Abstract
وقد ثبت جزيء واحد مضان الطيفي ليكون مفيدا في فهم مجموعة واسعة من الظواهر البيولوجية في النانومترية الحجم. أمثلة هامة لما يمكن أن تسفر هذه التقنية إلى العلوم البيولوجية هي رؤى الآلية على البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. عندما يتم بحثها تفاعلات البروتينات في مستوى واحد جزيء، كثيرا ما يجمد البروتينات أو ركائز على سطح الزجاج، والذي يسمح لمراقبة طويلة الأجل. هذا المخطط الشلل قد يعرض القطع الأثرية السطح غير المرغوب فيها. وبالتالي، فمن الضروري إيقاف فاعلية سطح الزجاج لجعلها خاملة. طلاء السطح باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) تبرز لأداء عالية في منع البروتينات من التفاعل غير تحديدا مع سطح الزجاج. ومع ذلك، فإن الإجراء طلاء البوليمر أمر صعب، بسبب المضاعفات الناجمة عن سلسلة من المعالجات السطحية والمتطلبات الصارمة التي تحتاج الى السطح لأن تكون خالية من أي جزيئات الفلورسنت في نهاية الإجراء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول قوية مع خطوة بخطوة التعليمات. وهو يغطي تنظيف السطح بما في ذلك النقش سمكة البيرانا، functionalization السطح مع مجموعات أمين، وأخيرا PEG الطلاء. للحصول على كثافة عالية من طبقة PEG، ونحن نقدم استراتيجية جديدة لعلاج السطح مع الجزيئات PEG على جولتين، مما يحسن بشكل ملحوظ نوعية التخميل. نحن نقدم نتائج ممثل وكذلك نصائح عملية لكل خطوة حاسمة بحيث يمكن لأي شخص تحقيق جودة عالية التخميل السطح.
Introduction
عند إجراء دراسة واحدة جزيء البروتين الضروري لتحقيق نوعية عالية من التخميل السطح بحيث التجربة خالية من أي الناجم عن سطح البروتين عطل أو تمسخ 1،2. في حين أن سطح الزجاج تعامل مع السطحي، مثل ألبومين المصل البقري، ويستخدم عادة لواحدة جزيء الحمض النووي الدراسات 3، ودرجة التخميل ليست عالية بما فيه الكفاية لدراسات البروتين. سطح الزجاج المطلي مع البوليمر (غليكول البولي إثيلين، PEG) متفوقة في الأداء التخميل 4-6. وبالتالي، فقد أصبح يستخدم عالميا لدراسات البروتين جزيء واحد من أي وقت مضى منذ أن تم عرضه لدراسة مضان واحدة جزيء 7-10. يتطلب إجراء طلاء البوليمر المعالجات السطحية متعددة 7،11،12. وبالتالي، فمن الصعب اتباع الإجراء بأكمله دون تعليمات مفصلة. في كثير من الأحيان درجة التخميل السطح يختلف اعتمادا على البروتوكول الأوليتبع ق. هنا نقدم بروتوكول قوية مع خطوة بخطوة التعليمات، التي من شأنها إزالة واحدة من العقبات الرئيسية لدراسات البروتين جزيء واحد. انظر الشكل 1 لمحة عامة.
Protocol
1. الشرائح إعداد وتنظيف
يتكون غرفة ميكروفلويديك من شريحة الكوارتز وساترة. في نوع المنشور مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري، يتم تصوير سطح الشريحة الكوارتز. وبالتالي، فمن المهم لتنظيف شريحة الكوارتز بدقة باستخدام H 2 O، والأسيتون، كوه، والحلول سمكة البيرانا. ال هو متعددة الخطوات تنظيف يزيل الجزيئات العضوية الفلورسنت على سطح والتي تتداخل مع القياسات مضان جزيء واحد. بالإضافة إلى ذلك، فإن النقش سمكة البيرانا يجعل سطح ماء الكوارتز عن طريق توليد مجموعات الهيدروكسيل. مجموعات الهيدروكسيل الحرة ضرورية للتفاعل الأمينية silanization في الخطوة 3.
- الشرائح الحفر الكوارتز. حفر زوج من الثقوب في شريحة الكوارتز مع قليلا 3/4 مم الحفر الماس (الشكل 2A). إذا كنت تريد قنوات متعددة، حفر المزيد من السلطة الفلسطينيةمصلحة الضرائب من الثقوب (الشكل 2B). وتستخدم هذه الثقوب لحقن الحلول في غرفة ميكروفلويديك في الخطوة 7.
- الحفاظ على قمة الحفر الرطب في H 2 O أثناء الحفر. H 2 O ينفذ ومواد التشحيم، مما يزيد من العمر الافتراضي للمثقاب.
- أحيانا يمسح غيض من مثقاب يساعد حفر ثقوب.
- بعد حفر ثقوب، بمناسبة جانب واحد من شريحة لسهولة تحديد أثناء عملية من مضاد. علامات يمكن استخدامها كمرجع لتفادي الخلط في وقت لاحق. لوسم، يمكن استخدام مثقاب الماس. لا تستخدم أي ركلة جزاء منذ الحبر قد تحصل على السطح.
- تنظيف مع H 2 O. وضع الشرائح في وعاء زجاجي تلطيخ. يمكن وضعها عادة 5-15 الشرائح في وعاء واحد. شطف الشرائح مع MilliQ H 2 O. كرر ذلك 3 مرات ويصوتن الشرائح مع MilliQ H 2 O لمدة 5 دقائق لإزالة الأوساخ. التخلص من الماء وشطف الشرائح مرة أخرى 3 مرات معMilliQ H 2 O. لاحظ أن 130 W هي قوة صوتنة المستخدمة لهذا البروتوكول. ارتفاع السلطة صوتنة قد يقلل من عمر الشرائح الكوارتز.
- تنظيف مع الأسيتون. استبدال MilliQ H 2 O مع الأسيتون. يصوتن الشرائح مع الأسيتون لمدة 20 دقيقة أو أكثر.
- الشطف مع H 2 O. تجاهل الأسيتون وشطف الشرائح مع MilliQ H 2 O. تكرار ذلك لمدة 3 مرات من أجل إزالة أي بقايا الأسيتون.
- تنظيف مع KOH. استبدال الماء مع 1 M KOH ويصوتن الشرائح لمدة 20 دقيقة أو أكثر. سوف الحفر المفرطة (على سبيل المثال بين عشية وضحاها العلاج KOH) تحسين نوعية السطح، ولكن سوف أعرض الخدوش التي قد تتداخل مع التصوير مضان.
- الشطف مع H 2 O. شطف الشرائح مع MilliQ H 2 O لمدة 3 مرات لإزالة آثار كوه.
- سمكة البيرانا النقش.
- نقل الشرائح إلى الشريحة دوران حامل أو حامل تفلون حسب الطلب وررالآس لهم في كوب (1 لتر) الموجود في غطاء الكيميائية.
- ملء كوب مع 450 مل من H 2 SO 4.
- إضافة 150 مل من H 2 O 2 ل3:01 النسبة بين H 2 SO 4 و H 2 O 2. مرة واحدة الحل يبدأ في الغليان من تلقاء أنفسهم، ودرجة الحرارة يزيد على 90 درجة مئوية. تأكد من أن H 2 O 2 الحل هو في درجة حرارة الغرفة قبل بدء التفاعل. خلاف ذلك، فإن درجة حرارة الغليان الحل قد يكون أقل من 90 درجة مئوية.
- تحريك حل لخلط السليم والسماح دون عائق الدورق لمدة 20 دقيقة.
- تأخذ الشرائح من الحل البيرانا جنبا إلى جنب مع حامل الشرائح، ووضعها في حامل الشريحة التي تحتوي على MilliQ H 2 O. وفي الوقت نفسه، تجاهل الحل البيرانا في زجاجة النفايات المعينة بمجرد أن تصل درجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائح 3 مرات مع MilliQ H 2 O. وينبغي اتخاذ مزيد من الحذر في مزيد من الظريفملاحظة لتجنب أي تلوث ممكن من الشرائح. الاستمرار في الخطوة 3. ينصح الشروع فورا في الخطوات التالية.
* تنبيه: الحل البيرانا هو رد الفعل للغاية. عند التعامل مع هذا الحل ينبغي أن تؤخذ بحذر شديد. بالإضافة إلى ذلك، عن طريق الخطأ عندما مختلطة مع المذيبات العضوية مثل الأسيتون، فإنه قد يسبب انفجار.
2 تنظيف ساترة
يتكون غرفة ميكروفلويديك من شريحة الكوارتز والشفة غطاء ق. عندما يستخدم المنشور من نوع المجهر TIRF، لا يتم تصوير سطح ساترة. لذلك، وهو ما يكفي لتنظيف ساترة فقط مع H 2 O وKOH. في حالة يحتاج ساترة ليمكن تصوير (على سبيل المثال عن طريق الهدف من نوع TIRF المجهري)، فمن المستحسن لعلاج لل coverslips مع حل سمكة البيرانا (الخطوة 1.7). ملاحظة أنه إذا كان من مضاد لسطح ساترة ليست ذات جودة عالية، فإنه قد يكون بمثابة بالوعة للبروتينات ود تؤدي إلى تغيرات في تركيز البروتين.
- الشطف مع H 2 O. مكان coverslips (24 × 30، 24 × 40، أو 24 × 50 مم 2) في وعاء زجاجي تلطيخ. يمكن وضعها عادة 5-15 coverslips في جرة واحدة. شطف لل coverslips 3 مرات مع MilliQ H 2 O.
- تنظيف مع KOH. استبدال المياه مع 1M KOH ويصوتن لل coverslips لمدة 20 دقيقة أو أكثر.
- الشطف مع H 2 O. شطف لل coverslips 3 مرات مع MilliQ H 2 O لإزالة آثار كوه. الاستمرار في الخطوة 3.
3. أمينية silanization من الشرائح وCoverslips
Functionalizing سطح الشرائح الكوارتز ولل coverslips مع مجموعة أمين عبر الكيمياء الأمينية silanization. ويستخدم الميثانول كمذيب وحمض الخليك كمحفز للتفاعل الأمينية silanization.
- الشطف مع الميثانول. استبدال MilliQ H 2 O في الأطباق تلطيخ (من Steps 1 و 2) مع الميثانول. الحفاظ على الشرائح ولل coverslips في الميثانول حتى الخطوة 3.3. لا تقم بتخزين الشرائح ولل coverslips في الميثانول لفترة طويلة من الوقت دون داع (على سبيل المثال عدة ساعات) منذ الشوائب في الميثانول وكثف إلى السطح.
- إعداد الحل الأمينية silanization.
- شطف قارورة بيركس عدة مرات مع الميثانول. يصوتن القارورة مع الميثانول لمدة 5 دقائق أو أكثر. وينصح أن يكون لديها قارورة مخصصة التي يتم الاحتفاظ نظيفة.
- صب 100 مل من الميثانول في قارورة.
- إضافة 5 مل من حمض الخليك.
- إضافة 3 مل من APTES (3 أمينو trimethoxysilane) والمزيج بلطف عن طريق هز ذلك.
- الأمينية silanization. استبدال الميثانول في تلطيخ الأطباق التي تحتوي على الشرائح ولل coverslips مع خليط التفاعل aminosilanization.
- احتضان لمدة 20-30 دقيقة. أثناء الحضانة، ويصوتن مرة واحدة لمدة 1 دقيقة.
- الشطف مع الميثانول. استبدال لرد فعل minosilanization مع الميثانول. تجاهل الميثانول وإضافة إلى حل الميثانول النقي. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
4. التخميل السطحية باستخدام البوليمر (الجولة الأولى)
تخميل السطح المطلي أمين الشرائح الكوارتز وcoverslips عن طريق التصريف NHS استر البولي ايثيلين جلايكول (PEG). ويتم هذا التفاعل بها مع تركيز تشبع من محلول PEG في درجة الحموضة 8.5 ليلة وضحاها.
- تجفيف الشرائح وcoverslips. تجفيف الشرائح ولل coverslips باستخدام N 2 الغاز ووضعها في صناديق ماصة نظيفة في مثل هذه الطريقة أن الجانب الذي يجب أن يكون يواجه مضاد للفيروسات يصل. يتم تعبئة مربع ماصة جزئيا مع MilliQ H 2 O. هذه بيئة رطبة يمنع حل من مضاد من الجفاف خلال فترة الحضانة بين عشية وضحاها.
- إعداد رد فعل العازلة. تحضير 0.1 M من الطازجة العازلة بيكربونات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.5) عن طريق إذابة 84 ملغ من بيكربونات الصوديوم في 10 مل منMilliQ H 2 O. ليست هناك حاجة لتعديل درجة الحموضة. هذا الحل قد يتم تخزين المجمدة لاستخدام المقبل (على سبيل المثال الخطوة 6.1).
- إعداد حل من مضاد.
- إعداد خليط PEG من 0.2 ملغ المعقدة البيروكسيديز NHS استر PEG (5،000 دا) 13 و 8 ملغ من NHS استر MPEG (5،000 دا) في أنبوب 1.5 مل. عند إعداد N عدد من الشرائح، وإعداد N مرات كمية أكبر من الخليط PEG في أنبوب واحد.
- إضافة 64 ميكرولتر (أو N 64 مرات ميكرولتر لN عدد الشرائح) من المخزن المؤقت الطازجة (الخطوة 4.2). ماصة صعودا وهبوطا من أجل حل لهم تماما.
- أجهزة الطرد المركزي مع 16،100 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء. لا ماصة بعد ذلك. خلاف ذلك، سوف تشكل فقاعات الهواء التي تتداخل مع من مضاد في الخطوة 4.4.
- من مضاد.
- إسقاط 70 ميكرولتر من خليط من مضاد لشريحة الكوارتز المجففة من الخطوة 4.1. استخدام 90 ميكرولتر في حالة 24 × 50 مم 2 COVerslip.
- وضع بلطف ساترة المجففة من الخطوة 4.1 على الحل.
- لديك موحدة وذات جودة عالية من مضاد لل، والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. بسبب التوتر السطحي، أكثر من فقاعات الهواء قد ترك من تلقاء أنفسهم وحجم رد الفعل في غضون خمس دقائق بسبب التوتر السطحي.
- احتضان الشرائح في بيئة مظلمة ورطبة. عمر النصف من NHS استر PEG التي نستخدمها في درجة الحموضة 8 هو حوالي ساعة واحدة. كحد أدنى، واحتضان لهم لمدة 2 ساعة. الحضانة بين عشية وضحاها يؤدي إلى جودة أعلى من من مضاد (لا تظهر البيانات).
5. التخزين على المدى الطويل
تخزين الشرائح مضاد للفيروسات وcoverslips في N 2 في -20 درجة مئوية.
- تجفيف الشرائح وcoverslips. تفكيك بعناية الشريحة وساترة عن طريق تحريك ساترة إلى الجانب، وشطف لهم MilliQ H 2 O، وتجفيفها مع N 2.
- تخزين الشرائح وcoverslips. FOص استخدام الفوري، اتبع الإجراء للجولة الثانية من مضاد من (الخطوة 6). من أجل تخزين لفترة أطول من الوقت، اتبع الخطوات التالية.
- وضع زوج من الشرائح وساترة في أنبوب 50 مل من هذا القبيل أن الأسطح مضاد للفيروسات والتي تواجه بعيدا عن بعضها البعض.
- إغلاق جزئي للأنبوب، أنبوب فراغ، ومن ثم ملء مع N 2. هذه الخطوات تساعد على الحفاظ على سطح مضاد للفيروسات لفترة طويلة من الزمن. المسمار الأنبوب بإحكام وتخزينها في -20 درجة مئوية. نوعية الشرائح لا تزال جيدة لمدة تصل إلى 3 أشهر (الشكل 3A، يمين).
6. التخميل السطحية باستخدام البوليمر (الجولة الثانية)
جولة إضافية من مضاد للجعل طبقة أكثر كثافة PEG وأيضا لإرواء أي مجموعة أمين المتبقية على السطح. استخدام جزيئات قصيرة NHS استر PEG (333 دا) قد يكون فعالا في اختراق طبقة PEG القائمة. فمن تفصيلommended للقيام بذلك الدور الثاني من من مضاد الحق قبل استخدام الشريحة.
- إعداد رد فعل العازلة. تحضير 0.1 M من الطازجة العازلة بيكربونات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.5). ويمكن أيضا أن الحل المجمدة من الخطوة 4.2 استخدامها.
- إعداد حل من مضاد. تذوب 7 ميكرولتر من 250 ملي MS4-PEG في 63 ميكرولتر من العازلة بيكربونات الصوديوم.
- من مضاد. اتبع نفس الإجراء كما في الخطوة 4.4. احتضان لمدة 30 دقيقة حتى ليلة وضحاها.
- تجفيف الشرائح وcoverslips. تفكيك زوج من الشرائح وساترة، وشطف لهم MilliQ H 2 O، وتجفيفها مع N 2، والاحتفاظ بها في صندوق ماصة نظيفة. المضي قدما لتجميع غرفة ميكروفلويديك في الخطوة 7.
7. تجميع الدائرة ميكروفلويديك
تجميع غرفة ميكروفلويديك باستخدام زوج من الكوارتز الشريحة مضاد للفيروسات وساترة. يستخدم شريط لاصق على الوجهين كفاصل. وختم الغرفة مع الايبوكسي الغراء، وهكذايتم إدخال lutions من خلال الفتحات الموجودة في الشريحة الكوارتز.
- وضع شريحة الكوارتز على سطح مستو مع الجانب مضاد للفيروسات مواجهة.
- جعل قناة (العرض 5-7 ملم) قطريا على سطح مضاد للفيروسات عن طريق وضع شرائط لاصقة على الوجهين على الشريحة. تأكد من أن يتم وضع ثقوب في مركز القناة. والحرص على عدم افساد سطح مضاد للفيروسات أثناء عملية صنع غرفة. فمن الممكن لجعل شريحة متعددة القنوات من خلال وضع وإصرارها على شرائط لاصقة على الوجهين بطريقة مختلفة (انظر الشكل 2).
- وضع بلطف ساترة مضاد للفيروسات على رأس لإكمال غرفة. الجانب مضاد للفيروسات وينبغي أسفل.
- ختم الغرفة عن طريق الضغط على ساترة على المنطقة حيث يتم وضع الأشرطة على الوجهين. تفعل ذلك بلطف ولكن بدقة بحيث يصبح غرفة المياه بإحكام مختومة.
- إغلاق حواف الغرفة مع الايبوكسي الغراء.
- شل Streptavidin أو Neutravidin علىطبقة البيروكسيديز PEG بإضافة 50 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل من Streptavidin أو Neutravidin الحل في T50 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [pH8.0]، 50 ملي كلوريد الصوديوم العازلة) باستخدام ماصة P200. بعد 1 دقيقة من الحضانة، مع تدفق 100 ميكرولتر من العازلة T50.
- إضافة الجزيئات البيولوجية البيروكسيديز للتصوير واحدة جزيء الخاص بك.
8. حرك تدوير
إعادة تدوير الشرائح الكوارتز. يتم تدوير الشرائح المستخدمة من قبل اقلاعها لل coverslips وأشرطة لاصقة على الوجهين.
- بعد الاستخدام، وتخزين غرف في مياه الحنفية. حضانة طويلة الأجل في الماء يخفف التفكيك للغرف.
- غلي غرف في مياه الحنفية باستخدام الميكروويف. استخدام كوب بيركس. يغلي لمدة 10 دقيقة أو أكثر.
- خلع لل coverslips وأشرطة لاصقة على الوجهين باستخدام شفرة حلاقة. لا تضغط شريحة الكوارتز عمودي على طائرتها. خلاف ذلك، فإنه يكسر. الحفاظ على شفرة حلاقة بعيدا عن القناة. بعد التمديدherwise، فإنه يدخل خدوش على القناة.
- شطف الشرائح باستخدام المنظفات المنزلية عن طريق فرك لهم الأصابع.
- وضع الشرائح في وعاء زجاجي تلطيخ. يمكن وضعها عادة 5-15 الشرائح في وعاء واحد. إضافة 10٪ المنظفات المنزلية ويصوتن الشرائح لمدة 20 دقيقة أو أكثر. شطف الشرائح مع كمية كبيرة من المياه التبويب.
- انتقل إلى الخطوة 1.2.
Representative Results
بعد التجمع غرفة ميكروفلويديك (الخطوة 7،1-7،6) وقبل تنفيذ الخطوة 7.7، وينصح لتنفيذ مراقبة الجودة لسطح مضاد للفيروسات.
إذا كان قد تم الانتهاء من التخميل السطح بنجاح، وهناك أقل من 10 كثف غير تحديدا البروتينات في منطقة التصوير (25 ملم × 25 ملم) لاحظ عند إضافة 1-10 نانومتر البروتين fluorescently المسمى في غرفة (الشكل 3A، يسار).
عندما لم يتم تنفيذ أي من التنظيف أو رد فعل من الخطوات بشكل صحيح، وعدد من غير وجه التحديد كثف البروتينات تزيد بدرجة كبيرة، وشاشة CCD قد تكون مشبعة بواسطة إشارات مضان. على سبيل المثال، إذا تم تخطي الحفر سمكة البيرانا، هناك 100 مرة كمية أكبر من الامتزاز غير محددة لاحظ (الشكل 3A، مقارنة مع ترك وسط). عندما يتم تخطي الخطوة الثانية من مضاد، كان هناك ما يقرب من 3 مراتسا كمية أكبر من الامتزاز وحظ غير محددة (الشكل 3B). ويلاحظ وجود انخفاض درجة من مضاد عند استخدام المواد الكيميائية منتهية الصلاحية (على سبيل المثال APTES تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر) (لا تظهر البيانات). نوعية سطح قطرات أيضا أسفل عندما قدرا كبيرا من الوقت قد مرت منذ كان مضاد للفيروسات (الشكل 3A؛ مقارنة مع ترك الحق).
لمعرفة أفضل لنا، هذه هي المرة الأولى التي يتم تقديمها جولتي من مضاد للدراسات جزيء واحد. جولتين من من مضاد ضمان أعلى جودة PEG طبقة تشكيل (الشكل 3B). يظهر طبيعة متفوقة من من مضاد مزدوجة بارز في الأفلام (مقارنة مع فيلم 1A 1B السينما). في هذه الأفلام، ويلاحظ الإشارات الخلفية من جزيئات الفلورسنت في حل أن يكون أضعف بكثير عندما كان من مضاد مزدوجة المستخدمة، والتي تشير إلى أن البروتينات وصدت أكثر فعالية من قبل طبقة مضاد للفيروسات على نحو مضاعف. على الرغم من ينصح هذه العملية من خطوتين بقوة، فإن الخطوة الثانية من مضاد قد يتم تخطي إذا كانت التجربة هو مقبول لالتخميل غير الأمثل.
الشكل 1: رسم تخطيطي للالمعالجات السطحية (أ) يتم تنظيف شريحة المجهر مع الأسيتون، كوه، والحلول سمكة البيرانا. ومن بين functionalized مع APTES ومضاد للفيروسات مع NHS استر PEG. (ب) يتم تنظيف ساترة مع KOH، وكذلك مع حل سمكة البيرانا إذا لزم الأمر. ومن بين functionalized مع APTES ومضاد للفيروسات مع NHS استر PEG.
fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2: غرفة ميكروفلويديك (أ) غرفة على قناة واحدة. الشريحة المجهر لديه اثنين من الثقوب المحفورة. يتم تجميعها مع ساترة باستخدام شريحتين من شريط لاصق على الوجهين. (ب) غرفة ثلاث قنوات. الشريحة المجهر لديه ستة ثقوب حفرت. يتم تجميعها مع ساترة باستخدام أربع شرائح من شريط لاصق على الوجهين.
الشكل 3: صور CCD اتخذت مع البروتينات المسمى الصبغة في الحل. (أ) وقد أخذت صور CCD بواسطة نوع المنشور مجموع مضان انعكاس داخلي المجهري باستخدام عدسة الهدف 60X مع 10 نانومتر CY3-labeld معدل تقييم في الحل. وقد أعد (يسار) سطح بعد بروتوكول في هذه المقالة. (الأوسط) وكان سطح استعداداتتم تخطي الحمراء بعد بروتوكول في هذه المقالة، ولكن سمكة البيرانا النقش. (يمين) وأعد السطح بعد بروتوكول في هذه المادة وتخزينها لمدة 3 أشهر عند درجة حرارة -20 º C تحت النيتروجين. (ب) وصور CCD اتخذت مع 10 نانومتر CY3-labeld معدل تقييم في الحل. وقد أعد (يسار) سطح بعد بروتوكول في هذه المقالة. (يمين) وأعد السطح بعد بروتوكول في هذه المقالة، ولكن تم تخطي الدور الثاني من من مضاد. شريط النطاق = 5 ميكرون.
الفيلم 1: الأفلام CCD اتخذت مع البروتينات المسمى الصبغة في الحل. أخذت الأفلام CCD بواسطة نوع المنشور مجموع مضان المجهري التأمل الداخلي باستخدام عدسة الهدف 60X مع 10 نانومتر CY3-labeld معدل تقييم في الحل. القرار الوقت هو 100 ميللي ثانية. (أ) تم إعداد السطح بعد بروتوكول في هذه المقالة. (ب) وقد تم إعداد السطح بعد بروتوكول في هذه المقالة، ولكن الجولة الثانية من PEGylتم تخطي أوجه. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم و1A انقر هنا لعرض فيلم 1B.
Discussion
خطوات حاسمة في هذا البروتوكول
فمن الضروري لجعل ماء السطح قبل رد الفعل الأمينية silanization. وقد تحقق ذلك من خلال النقش الذي يولد سمكة البيرانا مجموعات الهيدروكسيل الحرة على سطح الزجاج / الكوارتز. فمن المستحسن عدم الحفاظ على سطح محفورا سمكة البيرانا يتعرض إما H 2 O أو الهواء لفترة طويلة من الزمن منذ hydrophilicity من السطح وتنخفض تدريجيا.
جزيئات NHS استر PEG هي رد الفعل. ينصح لجعل مأخوذة وتخزينها تحت النيتروجين في -20 درجة مئوية. حياة الرف المادة الكيميائية APTES في درجة حرارة الغرفة قصيرة. ينصح ليحل محله مع واحدة جديدة كل شهر.
إدخال تعديلات على هذا البروتوكول
عندما لا يمكنك استخدام الحفر سمكة البيرانا لأي سبب من الأسباب العملية، قد حفر باستخدام KOH لفترة طويلة من الزمن (مثل سvernight)، الأمر الذي سيجعل أيضا مجموعات الهيدروكسيل عرضة للخطر. في شرك هذا النهج البديل هو أن يصبح غير قابل للاستخدام الشريحة بعد عدة بتدوير بسبب الخدوش شديدة.
وغالبا ما تمارس لحرق سطح الزجاج / الكوارتز باستخدام الشعلة البروبان، وهو فعال في القضاء على المواد العضوية الفلورسنت 7. لم يتم تضمين هذا الإجراء في هذا البروتوكول لأنه لا لزوم لالنقش سمكة البيرانا. لاحظ أن هذا الإجراء سوف تؤدي إلى أكسدة مجموعات الهيدروكسيل. لذلك، لا ينبغي أن يتم هذا الإجراء مرة واحدة كان محفورا على السطح باستخدام KOH أو حل سمكة البيرانا.
عند استخدام العازلة مع الرقم الهيدروجيني أقل من 7 لتصوير واحدة جزيء، والتشكل من PEG يتغير من "الفطر" إلى "فرشاة"، مما يقلل من درجة التخميل. لذلك، عندما يتم استخدام الرقم الهيدروجيني أقل من 7.0، فمن المستحسن لمزيد إيقاف فاعلية السطح باستخدام disuccinimidyl tartarate <سوب> 7.
وجهات نظر
وقد قدمت هذا العمل بروتوكول قوية لتحقيق جودة عالية التخميل السطح. وهذا البروتوكول يكون من المفيد للدراسات مضان واحدة جزيء التي تشارك مع البروتينات 14 وكذلك المجمعات البروتين داخل الخلايا ومقتطفات immunoprecipitates 15. سيتم استخدامه على نطاق واسع لغيرها من تقنيات جزيء واحد مثل التحليل الطيفي القوة وعزم الدوران الطيفي 16. وسوف يكون من المفيد أيضا لمنع الخلايا من التكثيف على السطح 17.
بروتوكول المنصوص عليه في هذا العمل وتطالب لإجراءات متعددة الخطوات الخاصة به. التخميل السطح باستخدام الدهون PEG-8 وبولي يسين PEG 9 تتوفر كنهج بديل. منذ ذلك الحين، أنها لا تتطلب أي التفاعلات الكيميائية فمن السهل لتنفيذ. ومع ذلك، فإن درجة التخميل ليست عالية كما أن يتحقق من خلال modif الكيميائيةication من السطح.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وتم دعم مركز إيداع الأوراق المالية، منظمة العمل ضد الجوع، وCJ بواسطة بدءا المنح (ERC-جنيها استرلينيا-2012-309509) من خلال مجلس البحوث الأوروبي. وأيد J.-MN من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث (جبهة الخلاص الوطني) (2011-0018198) كوريا؛ وبرنامج مركز البحوث بايونير (2012-009586) من خلال جبهة الخلاص الوطني من كوريا بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتخطيط المستقبلي (MSIP). وأيد هذا العمل أيضا من قبل مركز BioNano الصحية الممولة من قبل الحرس MSIP كوريا باسم مشروع الحدود العالمية (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). وتم دعم YKL وJ.-HH من قبل برنامج زمالة العلوم سيول مدينة سيول، كوريا. كان البروتين المسمى معدل تقييم هدية سخية من الدكتور سوا ميونغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J. Surface that resist biodegradation. Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
