Summary
우리는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여 유리 표면을 패시베이션하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 표면 세정, 표면 기능화 및 PEG 코팅을 다룹니다. 우리는 기존의 방법에 비해 보호의 우수한 품질을 얻을 수있는, 두 차례에 걸쳐 PEG 분자와 표면을 치료하기위한 새로운 전략을 소개합니다.
Abstract
단일 분자 형광 분광법은 나노 스케일의 생물학적 현상의 넓은 범위를 이해하는 수단이 될 입증되었습니다. 이 기술은 생물 과학에 굴복 할 수있는 중요한 예는 단백질 - 단백질 및 단백질 - 핵산의 상호 작용에 대한 기계적인 통찰력이다. 단백질의 상호 작용은 단일 분자 수준에서 프로빙하는 경우, 단백질 또는 기판들은 종종 장기간 관측 가능 유리 표면에 고정화된다. 이 고정 방식은 원치 않는 표면 유물을 소개하고있다. 따라서,이 불활성 있도록 유리 표면을 패시베이션하기 위해 필수적이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 이용한 표면 코팅은 비특이적 유리 표면과 상호 작용하는 단백질을 방지하는 높은 성능을 띈다. 그러나, 폴리머 코팅 절차로 인해 표면이 필요한 표면 처리 및 일련의 엄격한 요건으로 인한 합병증 어렵다프로 시저의 끝에서 모든 형광 분자의 자유 롭다. 여기, 우리는 단계별 지침과 함께 강력한 프로토콜을 제공합니다. 그것은 피라니아 에칭, 아민 그룹과 표면 기능화, 그리고 마지막으로 PEG 코팅 등의 표면 세정을 다룹니다. PEG 층의 높은 밀도를 얻으려면, 우리는 현저 보호의 질을 향상 두 라운드, 이상 PEG 분자와 표면을 치료하는 새로운 전략을 소개합니다. 사람이 높은 품질의 표면 보호를 달성 할 수 있도록 우리는 대표적인 결과뿐만 아니라 각 중요한 단계에 대한 실질적인 조언을 제공합니다.
Introduction
단일 분자 단백질 연구를 수행 할 때 그 실험이 어떤 표면에 의한 단백질의 고장 또는 변성 1,2에서 무료로되도록 표면 보호의 높은 품질을 달성하기 위해 필수적이다. 예컨대 소 혈청 알부민 등의 계면 활성제로 처리 된 유리 표면은 일반적으로 단일 분자 핵산 연구 3에 사용되지만, 그 보호의 정도는 단백질 연구에 충분히 높지 않다. 중합체 (폴리에틸렌 글리콜, PEG)로 코팅 된 유리 표면은 패시베이션 성능 4-6 우수하다. 이것에 의해, 그것은 단일 분자 형광 연구 7-10에 도입 된 이래 단일 분자 단백질 연구에 보편적으로 사용되고있다. 폴리머 코팅 절차는 여러 표면 처리 7,11,12이 필요합니다. 따라서, 자세한 설명없이 전체 절차를 수행하는 것이 곤란하다. 종종 표면 보호의 정도는 프로토콜 I에 따라 달라집니다의는 다음에. 여기에서 우리는 단일 분자의 단백질 연구의 주요 병목 현상을 제거합니다 단계별 지침과 함께 강력한 프로토콜을 제시한다. 개요를 그림 1을 참조하십시오.
Protocol
1. 준비 및 청소를 밀어
미세 유체 챔버는 석영 슬라이드와 커버 슬립으로 구성되어 있습니다. 프리즘 형 전반사 형광 (TIRF) 현미경으로 석영 슬라이드의 표면에 묘화된다. 따라서, 철저 H 2 O, 아세톤, KOH 및 피라니아 용액을 사용하여 석영 슬라이드를 청소하는 것이 중요하다. 토륨은 다단계 세정은 단일 분자 형광 측정을 방해 표면에 형광성 유기 분자를 제거이다. 또한 피라냐 에칭 수산기를 생성하여 석영 표면 친수성을 만든다. 자유 수산기 3 단계에서 아미노 실란 화 반응에 필수적이다.
- 드릴링 석영 슬라이드. 3 / 4 밀리 다이아몬드 드릴 비트 (그림 2a)와 석영 슬라이드에 한 쌍의 구멍을 뚫습니다. 여러 채널이 요구되는 경우, 더 많은 파를 드릴국세청의 구멍 (그림 2B). 이 구멍은 7 단계의 미세 유체 챔버에 솔루션을 주입하는 데 사용됩니다.
- 드릴링 동안 H 2 O에 젖은 드릴 비트를 유지합니다. 드릴 비트의 수명을 증가 윤활제로서 H 2 O를 수행한다.
- 가끔 드릴 비트의 끝을 닦는 것은 시추 구멍을하는 데 도움이됩니다.
- 드릴 구멍 후, PEG 화 프로세스 중에 쉽게 식별 슬라이드의 한쪽을 표시한다. 마커는 나중에 혼동을 피하기 위해 참조로서 사용될 수있다. 마킹, 다이아몬드 드릴 비트가 사용될 수있다. 잉크가 표면에 걸릴 수 있기 때문에 어떤 펜을 사용하지 마십시오.
- H 2 O와 청소 유리 염색 항아리에 슬라이드를 놓습니다. 전형적으로 5-15 슬라이드 단일 항아리에 배치 될 수있다. 를 MilliQ H 2 O와 슬라이드를 씻어 이를 3 회 반복하고 먼지를 제거하기 위해 5 분을 MilliQ H 2 O와 슬라이드를 초음파 처리. 물을 폐기하고 다시 3 번 슬라이드를 씻어130 W는이 프로토콜에 사용되는 초음파의 힘입니다을 MilliQ H 2 O 주. 높은 초음파 전력은 석영 슬라이드의 수명을 줄일 수있다.
- 아세톤으로 세척. 아세톤을 MilliQ H 2 O를 교체합니다. 20 분 이상, 아세톤으로 초음파 처리 슬라이드.
- H 2 O와 린스 아세톤을 취소하고를 MilliQ H 2 O와 슬라이드를 씻어 임의의 잔류 아세톤을 제거하기 위해 3 번을 반복한다.
- KOH와 청소. 1 M KOH으로 물을 교체하고 20 분 이상에 대한 슬라이드를 초음파 처리. 과도한 에칭 (예 : 밤새의 KOH 처리) 표면의 질을 향상되지만, 형광 이미징을 방해 할 수 흠집을 소개 할 것이다.
- H 2 O와 린스 KOH의 흔적을 제거하기 위해 3 번을 MilliQ H 2 O와 슬라이드를 씻어.
- 피라니아 에칭.
- 듀란 슬라이드 홀더 또는 주문품 테플론 홀더 및 PL 슬라이드로 이동화학 후드에 위치한 비이커 (1 L)에 그 에이스.
- H 2의 450 ㎖의 SO 4로 비커를 입력합니다.
- SO 4 H 2 사이의 비율은 3:1과 H 2 O 2 H 2 O 2의 150 ML을 추가합니다. 이 솔루션은 자발적으로 비등하기 시작하면, 온도가 90 °에 C를 증가 반드시 H 2 O 2 용액이 반응을 시작하기 전에 실온에서임을 확인. 그렇지 않으면, 비등 용액의 온도보다 낮은 90 ° C. 수도
- 적절한 혼합을위한 솔루션을 저어 비커는 20 분 동안 방해받지하자.
- 함께 슬라이드 홀더 피라 솔루션 밖으로 슬라이드를 가지고,을 MilliQ H 2 O를 포함하는 슬라이드 홀더에 넣어 실온에 도달하면 한편, 지정 폐기물 병으로 피라니아 용액을 버린다.
- 를 MilliQ H 2 O와 슬라이드 3 번 씻어 추가 치료가 더 인트에주의해야한다슬라이드의 오염 가능성을 방지하기 PS. 3 단계로 진행합니다. 그것은 바로 다음 단계를 진행하는 것이 좋습니다.
*주의 : 피라니아 솔루션은 매우 민감하다. 이 솔루션을 취급 할 때 특히주의를 기울여야합니다. 또한, 때 아세톤과 같은 유기 용매와 혼합 실수로 폭발의 원인이 될 수 있습니다.
2. 커버 슬립 청소
미세 유체 챔버는 석영 슬라이드와 커버의 립으로 구성되어있다. 프리즘 형 TIRF 현미경이 사용되는 경우, 커버 슬립의 표면은 묘화되지 않는다. 따라서, 단지 H 2 O 및 KOH로 커버 슬립을 청소하기 위해 충분하다. 경우에 커버 슬립이 (객관적 형 TIRF 현미경을 통해 예) 몇 군데해야합니다, 그것은 피라니아 솔루션 (단계 1.7)와 커버 슬립을 치료하는 것이 좋습니다. 커버 슬립면의 PEG 화 고품질 아닌 경우,이 단백질에 대한 싱크로서 작용할 수 있음을 유의단백질 농도의 변화를 야기 ㄹ.
- H 2 O와 린스 장소의 coverslips 유리 염색 항아리 (24 × 30, 24 × 40, 24 × 50 MM 2). 전형적으로 5-15 커버 슬립은 단일 용기에 배치 될 수있다. 를 MilliQ H 2 O와 커버 슬립을 3 번 씻어
- KOH와 청소. 1M KOH으로 물을 교체하고 20 분 이상에 대한 커버 슬립을 초음파 처리.
- H 2 O와 린스 KOH의 흔적을 제거를 MilliQ H 2 O와 커버 슬립을 3 번 씻어. 3 단계로 진행합니다.
슬라이드 및 Coverslips는 3. 아미노 실란 화
아미노 실란 화 화학 통해 석영 슬라이드 및 아민 그룹과 커버 슬립의 표면을 기능화. 메탄올 아미노 실란 화 반응을위한 촉매로서, 용매 및 아세트산으로 사용된다.
- 메탄올로 세정. S에서 염색 요리의를 MilliQ H 2 O를 (교체TEPS 1, 2) 메탄올. 단계 3.3까지 메탄올의 슬라이드와 커버 슬립을 유지합니다. 메탄올에있는 불순물 때문에 시간이 불필요하게 오랜 기간 (예 : 몇 시간) 메탄올의 슬라이드와 커버 슬립을 저장하지 마십시오 표면에 흡착됩니다.
- 아미노 실란 화 솔루션을 준비합니다.
- 메탄올로 파이렉스 플라스크에 여러 번 씻어. 5 분 이상 메탄올로 플라스크를 초음파 처리. 그것은 청결 유지되는 전용 플라스크를하는 것이 좋습니다.
- 플라스크에 메탄올 100 ㎖를 붓는다.
- 아세트산 5 ㎖를 추가합니다.
- APTES 3 ㎖ (3 - 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란)를 추가하고 부드럽게 흔들어 섞는다.
- 아미노 실란 화. aminosilanization 반응 혼합물과 함께 슬라이드와 커버 슬립을 포함하는 염색 접시에 메탄올을 대체합니다.
- 20 ~ 30 분 동안 품어. 배양하는 동안, 한 번 1 분 동안 초음파 처리.
- 메탄올로 세정. 를 교체메탄올 minosilanization 반응. 메탄올을 취소하고 신선한 메탄올 용액을 추가합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다.
폴리머 (첫 라운드)를 사용하여 4. 표면 패시베이션
NHS-에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 컨쥬 게이트에 의해 석영 슬라이드 및 커버 슬립의 아민 코팅 된 표면을 패시. 이 반응물을 하룻밤 동안 pH를 8.5에서 PEG 용액의 포화 농도로 수행된다.
- 슬라이드와 커버 슬립을 건조. N 2 가스를 사용하여 슬라이드와 커버 슬립을 건조 측면이 PEG 화이 위를 향이어야하는 방식으로 깨끗한 피펫 상자에 넣습니다. 피펫 상자가 부분적를 MilliQ H 2 O로 가득 이 습한 환경은 하룻밤 배양 동안 마르지 PEG 화 솔루션을 방지 할 수 있습니다.
- 반응 버퍼를 준비합니다. 10ml에 중탄산 나트륨 84 mg의 용해시켜 신선한 중탄산 나트륨 완충액 (pH 8.5) 중 0.1 M 준비를 MilliQ H 2 O pH를 조정의 필요가 없다. 이 솔루션은 다음 사용 (예를 들어, 단계 6.1) 냉동 저장 될 수있다.
- PEG 화 솔루션을 준비합니다.
- 1.5 ML 튜브에 NHS-에스테르 PEG NHS-에스테르 된 mPEG (5000 다)의 (5000 다) (13)와 8 ㎎의 비오틴 0.2 mg을 PEG 혼합물을 준비합니다. 슬라이드의 N 번호를 준비 할 때, 하나의 튜브에 PEG 혼합물의 N 배 더 많은 양을 준비합니다.
- 64 μL (또는 N 번 슬라이드의 N 번호 64 μL)을 새로 제조 된 버퍼 (4.2 단계)의 추가. 완전히 용해하기 위해 그것을하고 아래로 피펫.
- 공기 방울을 제거하기 위해 1 분 동안 16,100 XG에 원심 분리기. 그 후 피펫하지 마십시오. 그렇지 않으면, 기포는 단계 8.8에서 PEG 화를 방해하는 형성 할 것이다.
- PEG 화.
- 단계 4.1에서 건조 된 석영 슬라이드에 PEG 화 혼합물의 70 μl를 삭제합니다. 24 × 50 MM 2 COV의 경우에는 90 μl를 사용하여erslip.
- 부드럽게 솔루션을 통해 단계 4.1에서 건조 커버 슬립을 배치합니다.
- , PEG 화 균일하고 높은 품질을 가지고하는 기포를 도입하지 않도록주의. 때문에, 표면 장력, 기포의 대부분은 자발적으로 표면 장력에 의한 5 분 내에 반응 부피를 남길 수있다.
- 어둡고 습한 환경에서 슬라이드를 품어. 우리는 pH가 8시에 사용 NHS-에스테르 PEG의 반감기는 약 1 시간. 최소한 2 시간 동안 그들을 품어. 밤새 인큐베이션 PEG 화 (데이터 미도시)의 높은 품질에 이르게한다.
5. 장기 저장
-20 º C에서 PEG 화의 슬라이드와 N 2의 coverslips 저장
- 슬라이드와 커버 슬립을 건조. 조심스럽게,면에 커버 슬립을 밀어 슬라이드와 커버 슬립을 분해를 MilliQ H 2 O로 헹구어, 그리고 N 2로 건조.
- 슬라이드와 커버 슬립을 저장. FOR 즉시 사용, PEG 화 (6 단계)의 두 번째 라운드의 절차를 따르십시오. 오랜 기간 동안 저장하기 위해, 다음 단계를 따른다.
- PEG 화 표면이 서로 떨어져 직면하고있는 것과 같은 50 ㎖ 튜브 슬라이드와 커버 슬립 한 쌍을 배치합니다.
- 부분적으로, 튜브를 닫 튜브를 진공 청소기로 청소 한 후 N 2로 채 웁니다. 이러한 단계는 장시간 PEG 화면을 보존하는 데 도움이. 단단히 튜브를 나사 및 -20 ℃에서 보관 슬라이드의 품질 (오른쪽 그림 3a) 최대 3 개월 동안 잘 남아있다.
폴리머 (두 번째 라운드)를 사용하여 6. 표면 패시베이션
PEG 층의 밀도를 확인하고 또한 표면에 남아있는 아민 그룹을 해소하기 위해 PEG 화의 추가 라운드. 짧은 NHS-에스테르 PEG 분자 (333 다)의 사용은 기존의 PEG 층으로 침투하는 효과가있다. 그것은 레크 리 에이션이다오른쪽으로 슬라이드를 사용하기 전에 PEG 화의 두 번째 라운드를 할 권고했다.
- 반응 버퍼를 준비합니다. 신선한 탄산 수소 나트륨 완충액 (pH 8.5)의 0.1 M을 준비합니다. 단계 8.4 냉동 용액을 사용할 수도있다.
- PEG 화 솔루션을 준비합니다. 탄산 수소 나트륨 완충액 63 μL에 250 ㎜ MS4-PEG의 12 μl를 녹입니다.
- PEG 화. 단계 4.4에서와 동일한 절차를 따르십시오. 하룻밤에 30 분 동안 품어.
- 슬라이드와 커버 슬립을 건조. 슬라이드의 한 쌍의 커버 슬립을 분해,,를 MilliQ H 2 O로 헹구어 N 2로 건조하고 깨끗한 피펫 상자에 보관하십시오. 7 단계에서 미세 유체 챔버를 조립 진행합니다.
7. 미세 유체 챔버를 조립
PEG 화 석영 슬라이드 쌍의 커버 슬립을 이용하여 미세 유체 챔버를 조립. 양면 접착 테이프를 스페이서로 사용됩니다. 챔버는 그래서, 에폭시 접착제로 밀봉하고lutions는 석영 슬라이드에있는 구멍을 통해 소개합니다.
- PEG 화면이 위로 향하게하여 평평한 표면에 석영 슬라이드를 놓습니다.
- 슬라이드에 양면 접착 테이프를 넣어 대각선 PEG 화 표면에 채널 (7 mm의 폭 5)를 확인합니다. 구멍이 채널의 중앙에 위치되어 있는지 확인합니다. 실을 만드는 과정에서 PEG 화 표면을 해치지 않게주의하십시오. 이는 (도 2 참조)에 배치하고 다른 양면 접착 테이프를 고집함으로써 멀티 채널 슬라이드를 만드는 것이 가능하다.
- 부드럽게 챔버를 완료하기 위해 상단에 PEG 화 coverslip에 배치합니다. PEG 화면이 아래로 향하게해야합니다.
- 양면 테이프가 배치되는 영역에 걸쳐 커버 슬립을 가압하여 챔버를 밀봉. 챔버는 물 밀봉이되도록 부드럽게하지만 철저하게 작업을 수행합니다.
- 에폭시 접착제로 챔버의 가장자리를 닫습니다.
- 에 스트렙 타비 딘 또는 뉴트라 비딘 고정화P200 피펫을 사용하여 T50에 스트렙 타비 딘 또는 뉴트라 비딘 용액 (10 mM 트리스 - 염산 [pH8.0], 50 mM의 NaCl을 버퍼)의 0.1 ㎎ / ㎖의 50 μl를 추가하여 비오틴 PEG 층. 후 T50 버퍼 100 μL와 같은 높이 배양의 1 분,.
- 당신의 단일 분자 이미징 바이오틴 생물 분자를 추가합니다.
8. 재활용을 밀어
석영 슬라이드를 재활용합니다. 중고 슬라이드를 커버 슬립과 양면 접착 테이프를 복용하여 재활용됩니다.
- 사용 후에는 수돗물의 챔버를 저장합니다. 물에서 장기 배양은 챔버의 분해를 용이.
- 전자 레인지를 사용하여 수돗물에 실을 끓인다. 파이렉스 비커를 사용합니다. 10 분 이상 끓인다.
- 면도날을 사용하여 커버 슬립과 양면 접착 테이프를 제거한다. 그면에 수직 석영 슬라이드를 누르지 마십시오. 그렇지 않으면 나누기. 멀리 채널로부터 면도날을 유지한다. OTherwise,이 채널에 흠집을 소개합니다.
- 손가락을 문질러 가정용 세제를 사용하여 슬라이드를 씻어.
- 유리 염색 항아리에 슬라이드를 놓습니다. 전형적으로 5-15 슬라이드 단일 항아리에 배치 될 수있다. 10 %의 가정용 세제를 추가하고 20 분 이상에 대한 슬라이드를 초음파 처리. 탭 다량의 물로 슬라이드를 씻어.
- 1.2 단계로 이동합니다.
Representative Results
미세 유체 챔버 조립 후 (7.1 단계 - 7.6) 및 7.7 단계를 수행하기 전에, 그것은 PEG 화 표면의 품질 관리를 수행하는 것이 좋습니다.
표면 패시베이션 성공적 완료 되었다면, 10 미만이 비특이적 1-10 nM의 형광 표지 된 단백질은 챔버 내로 (왼쪽 그림 3a, 다)을 첨가 할 때 관찰 이미징 영역 (x 25mm 25mm) 당 단백질을 흡착있다.
세척이나 반응 절차 중에 제대로 수행되지 않은 경우, 비특이적의 수는 현저하게 증가 단백질을 흡착하고, CCD 화면이 형광 신호에 의하여 포화 될 수있다. 피라니아 에칭 건너 예를 들어, 관찰 비특이적 흡착의 100 배 더 많은 양이 (그림 3a, 중간 왼쪽)와 비교. 두 번째 PEG 화 단계가 생략되면, 약 3 시간이 있었다SA 비특이적 흡착 관찰의 더 많은 양의 (그림 3B). 만료 된 화학 물질 (예 APTES 수개월 동안 실온에서 보관) (데이터는 도시되지 않음)를 사용하는 경우 PEG 화의 낮은 정도를 관찰된다. 상당한 시간이 그것 PEG 화 된 이후로 경과하면 표면의 품질도 아래로 떨어진다 (도 3a, 오른쪽과 왼쪽과 비교).
우리의 최선의 지식, 그것은 PEG 화의 두 라운드는 단일 분자 연구에 도입 된 것은 이번이 처음이다. PEG 화의 두 라운드는 PEG 층 형성 (그림 3b)의 최고 품질을 보장합니다. 이중 PEG 화의 뛰어난 자연은 눈에 띄게 (영화 1B와 영화 1A 비교) 영화에 표시됩니다. 이 영화에서, 용액에서 형광 분자의 배경 신호가 두 번 PEG 첨가 였을 때 훨씬 약한 것으로 관찰된다 단백질이 이중 페 길화 층에 의해 더욱 효율적으로 격퇴하고 있음을 나타냅니다하는 데 사용됩니다. 이 두 단계의 프로세스가 강력하게 권장합니다 비록 실험이 최적 보호를 허용하는 경우, 두 번째 PEG 화 단계는 건너 뛸 수 있습니다.
그림 1. 표면 처리의 도식 () 현미경 슬라이드 아세톤, KOH 및 피라 솔루션을 청소한다. 그것은 NHS-에스테르 PEG와 APTES와 PEG 화와 함께 작용한다. 필요한 경우, (b)는 커버 슬립 피라니아 용액 KOH뿐만 아니라 청소된다. 그것은 NHS-에스테르 PEG와 APTES와 PEG 화와 함께 작용한다.
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그림 2. 미세 유체 챔버 () 단일 채널 실. 현미경 슬라이드를 뚫고 두 개의 구멍이있다. 그것은 양면 접착 테이프의 두 조각을 사용하여 커버 슬립으로 조립된다. (b) 3 채널 챔버. 현미경 슬라이드 드릴 여섯 구멍이 있습니다. 이것은 양면 접착 테이프의 네 개의 슬라이스를 이용하여 커버 슬립으로 조립된다.
그림 3 : 용액에서 염료 표지 단백질로 촬영 CCD 이미지. (a) CCD 이미지는 용액에 10 nM의 Cy3가-으로 labeld 담당자와 60X 대물 렌즈를 이용하여 프리즘 형 전반사 형광 현미경에 의해 촬영 하였다. (왼쪽) 표면은이 문서의 프로토콜에 따라 제조 하였다. (중간) 표면 prepa했다이 문서의 프로토콜 다음과 같은 빨강,하지만 피라 에칭은 건너 뛰었습니다. (오른쪽) 표면은이 문서의 프로토콜에 따라 제조 및 질소 하에서 -20 º C에서의 3 개월 동안 보관 하였다. (B) 용액에 10 nM의 Cy3에 -으로 labeld 담당자로 촬영 CCD 이미지. (왼쪽) 표면은이 문서의 프로토콜에 따라 제조 하였다. (오른쪽) 표면은이 문서의 프로토콜에 따라 제조되었지만, PEG 화의 두 번째 라운드는 건너 뛰었습니다. 스케일 바 = 5 μm의.
영화 1 : 용액에서 염료 표지 단백질로 촬영 CCD 영화. CCD 영화는 용액에 10 nM의 Cy3에 -으로 labeld 담당자와 60X 대물 렌즈를 사용하는 프리즘 형 전반사 형광 현미경으로 촬영했다. 시간 해상도는 100 밀리 초이다. (A) 표면은이 문서의 프로토콜에 따라 제조 하였다. (b)의 표면은이 문서의 프로토콜에 따라 제조되었지만, PEGyl의 두 번째 라운드ATION은 건너 뛰었습니다. 여기를 클릭하여 영화 1A를보고하기 위해 여기를 클릭 영화 1B를 볼 수 있습니다.
Discussion
이 프로토콜 내에서 중요한 단계
이 아미노 실란 화 반응 전에, 표면 친수성을 만들기 위해 필수적이다. 이것은 유리 / 석영 표면에 자유 히드 록 실기를 생성 피라니아 식각을 통해 달성되었다. 그것은 점차적으로 내려가는 표면의 친수성시기 장시간 H 2 O 또는 공기 중 하나에 노출 피라냐 에칭 표면을 계속하지 않을 것을 권장한다.
NHS-에스테르 PEG 분자는 반응성이다. 그것은 -20 º C에서 분주을 질소에서 보관하는 것이 좋습니다 실온에서 APTES 화학의 수명이 짧다. 이것은 매달 새 것으로 교체하도록 의뢰한다.
이 프로토콜의 수정
어떤 실용적인 이유로 피라니아 에칭을 사용할 수없는 경우, 장시간 KOH를 사용하여 에칭 (예를 들어 Overnight), 이는 또한 수산기가 노출 된 것입니다. 이 대안의 함정 슬라이드 심한 상처로 인해 약간의 재순환 후 사용할 수 없게되는 것입니다.
그것은 종종 형광 유기 재료 7을 제거하는 효과가 프로판 토치를 사용하여 유리 / 석영 표면을 구울 실시됩니다. 이 피라니아 에칭에 대한 중복 때문에이 절차는이 프로토콜에 포함되지 않았습니다. 이 절차가 잠재적으로 수산기의 산화로 이어질 것입니다 있습니다. 표면이 KOH 또는 피라니아 용액을 사용하여 에칭하면 따라서이 절차를 수행 할 수 없습니다.
7 미만의 pH를 가진 버퍼가 단일 분자 이미징에 사용되는 경우, PEG의 형태는 보호의 정도를 감소시킨다 "브러쉬"내지 "버섯"에서 변경한다. 7.0보다 낮은 pH를 사용할 때 따라서는, 더 디 숙신 이미 딜 타르 타 <를 사용하여 표면을 패시베이션하기 위해 권장SUP> 7.
전망
이 작품은 높은 품질의 표면 보호를 달성하기위한 강력한 프로토콜을 제공하고 있습니다. 이 프로토콜은 단백질 14뿐만 아니라 세포 추출물 내 단백질 복합체에 참여하고 15 면역 침전물하는 단일 분자 형광 연구에 도움이 될 것입니다. 그것은 널리 힘 분광 및 토크 분광법 (16)과 같은 다른 단일 분자 기술에 사용됩니다. 또한 표면 (17)에 흡착 세포를 예방하는데 유용 할 것이다.
이 작품에서 제공하는 프로토콜은 여러 단계의 절차에 요구하고있다. 지질 PEG 8, 폴리 라이신 PEG 9를 사용하여 표면 보호는 대체 방법으로 사용할 수 있습니다. 이후, 그들은 쉽게 구현할 수있는 화학 반응을 필요로하지 않습니다. 그러나, 보호의 정도는 화학 modif 통해 달성만큼 높지 않다표면의 주시죠.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
SDC, ACH, 그리고 CJ는 유럽 연구위원회를 통해 보조금 (ERC - 엑츄 - 2012-309509)를 시작으로 지원했다. J.-MN은 한국 연구 재단 (NRF) (2011-0018198)에 의해 지원되었다; 한국의 NRF 통해 파이오니어 연구 센터 프로그램 (2012-009586)는 과학, ICT 장관, 그리고 미래의 계획 (MSIP)에 의해 투자. 이 작품은 또한 글로벌 프론티어 프로젝트 (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) 등 한국의 MSIP에 의해 투자 바이오 나노 건강 감시 센터에 의해 지원되었다. YKL 및 J.-HH는 서울, 한국의 서울 과학 원정대 프로그램에 의해 지원되었다. 레이블 담당자 단백질 박사 수아 MYONG에서 관대 한 선물이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J. Surface that resist biodegradation. Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
