Summary
Biz, polietilen glikol (PEG) kullanılarak bir cam yüzey pasifleştirilmesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yüzey temizleme, yüzey işlevselleştirilmesini ve PEG kaplama kapsar. Biz, mevcut yöntemlere kıyasla, pasivasyon üstün kalite sağlar ki, iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak.
Abstract
Tek molekül floresan spektroskopisi nano biyolojik olayların geniş bir anlayış vesile olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknik, biyolojik bilimlerin verebilir ne önemli örnekleri protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimleri üzerinde mekanik anlayışlar vardır. Protein etkileşimleri, tek molekül düzeyinde problandı zaman, proteinler ya da alt-tabakalar, genellikle uzun süreli bir gözlem için izin veren bir cam yüzey üzerinde immobilize edilir. Bu immobilizasyon şeması istenmeyen yüzey eserleri tanıtmak olabilir. Bu nedenle, bu atıl hale getirmek için cam yüzeyi etkisizleştirmek için gereklidir. Polietilen glikol (PEG) ile yüzey kaplama spesifik olmayan bir cam yüzey ile etkileşim proteinleri önlenmesinde yüksek performans için öne çıkmaktadır. Bununla birlikte, polimer kaplama prosedürü nedeniyle yüzey için gereken yüzey işlemleri, bir dizi ve sıkı zorunluluğundan kaynaklanan komplikasyon için, zordurProsedürün sonunda herhangi bir flüoresan molekül arındırılmış olması. Burada, biz adım adım talimatları ile sağlam bir protokol sağlar. Bu pirana aşındırma, amin gruplarıyla yüzey işlevsellik ve son olarak PEG kaplama dahil olmak üzere bir yüzey temizleme kapsar. PEG tabakanın bir yüksek yoğunluk elde etmek için, oldukça pasivasyon kalitesini artırır iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak. Herkes yüksek kaliteli yüzey pasivasyon elde edebilirsiniz, böylece temsili sonuçlar yanı sıra her bir kritik aşama için pratik önerilerde bulunur.
Introduction
Tek moleküllü protein çalışma yaparken bu deney, herhangi bir yüzey kaynaklı protein arıza veya denaturasyon 1,2 arınmış, böylece yüzey pasivasyon yüksek bir kalite elde etmek için gereklidir. , Sığır serum albümin gibi yüzey aktif maddeler, ile muamele edilmiş, bir cam yüzey, genel olarak, tek bir nükleik asit molekülü çalışmalar 3 için kullanılır iken, bu pasivasyon derecesi protein çalışmaları için yeterince yüksek değildir. Polimer (polietilen glikol, PEG) ile kaplanmış bir cam yüzeyi pasifleştirme performans 4-6 üstündür. Böylece, o bir tek-molekül floresan çalışmada 7-10 tanıtıldı beri tek-molekül protein çalışmaları için evrensel kullanılır hale gelmiştir. Polimer kaplama prosedürü birden fazla yüzey işlemleri 7,11,12 gerektirir. Bu nedenle, ayrıntılı talimatlar olmadan tüm prosedürü takip etmek zordur. Genellikle yüzey pasivasyon derecesi protokol i bağlı olarak değişirs izledi. İşte biz tek-molekül protein çalışmaların önemli darboğazları birini kaldıracak adım-adım talimatlar ile sağlam bir protokol mevcut. Genel bakış için Şekil 1'e bakınız.
Protocol
1.. Hazırlama ve Temizleme kaydırın
Bir microfluidic odası, bir kuvars slayt ve bir lamel oluşur. Prizma-tipi toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi yılında, kuvars slayt yüzey görüntüsü alınır. Bu nedenle, iyice 2 H, O, aseton, KOH ve pirana çözeltiler kullanılarak bir kuvars slayt temizlemek için önemlidir. Th çok aşamalı temizleme tek bir molekül fluoresans ölçümleri ile müdahale, bir yüzey üzerinde floresan organik molekülleri ortadan kaldırır. Buna ek olarak, pirana gravür hidroksil gruplarını üreterek kuvars yüzeyi hidrofilik hale getirir. Serbest hidroksil grupları, adım 3'te amino-silanizasyon reaksiyonu için gereklidir.
- Sondaj kuvars slaytlar. 3/4 mm elmas matkap ucu (Şekil 2a) ile bir kuvars slayt içine delik bir çift delin. Birden fazla kanal istenirse, daha pa matkapirs delikleri (Şekil 2b). Bu delikler, Adım 7'de bir mikroakışkan odası içine enjekte çözüm için kullanılır.
- Sondaj sırasında H 2 O ıslak matkap ucu tutun. Matkap ucunun ömrünü arttıran bir yağlayıcı olarak H 2 O gerçekleştirir.
- Ara sıra matkap ucu silerek delik delme yardımcı olur.
- Delikler sonra PEGilasyon işlemi sırasında kolay tanımlama için sürgünün bir tarafı işaret eder. Belirteçler daha sonra karışıklığı önlemek için referans olarak kullanılabilir. Markalama için, bir elmas matkap ucu kullanılabilir. Mürekkep yüzeyinde alabilirsiniz beri herhangi bir kalem kullanmayınız.
- H 2 O. ile temizleme Cam boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tipik haliyle 5-15 slaytlar tek bir kavanoza yerleştirilebilir. MilliQ H 2 O. ile slaytlar durulayın Bunu 3 kez tekrarlayın ve kirleri çıkarmak için 5 dakika boyunca MiliQ H 2 O ile slaytlar ses dalgalarına maruz. Su atılması ve tekrar 3 kez slaytlar durulayın130 W, bu protokol için kullanılan ultrasonik titreşim güç olduğunu MiliQ H 2 O. Not. Yükseköğretim Sonication güç kuvars slaytların ömrünü azaltabilir.
- Aseton ile temizleme. Aseton ile MilliQ H 2 O değiştirin. 20 dakika veya daha uzun süre boyunca aseton ile slaytlar sonikasyon.
- H 2 O ile durulama Aseton atın ve MiliQ H 2 O. ile slaytlar durulayın Herhangi bir aseton artıklarını uzaklaştırmak için 3 kez tekrarlayın.
- KOH ile temizlik. 1 M KOH ile su yerine yerleştirin ve 20 dakika ya da daha uzun süre için slaytlar sonikasyon. Aşırı dağlama (örn. gece KOH tedavi) yüzey kalitesini artıracaktır, ancak floresan görüntüleme ile engel olabilecek çizik, tanıtacak.
- H 2 O ile durulama KOH izlerini çıkarmak için 3 kez MilliQ H 2 O ile slaytlar durulayın.
- Piranha dağlama.
- Bir Duran slayt sahibinin veya bir ısmarlama Teflon tutucu ve pl Transfer slaytlarKimyasal bir kaput bulunan bir kaba (1 L) içinde onları as.
- H 2 450 ml SO 4 ile beher doldurun.
- SO 4 H, 2 ila 3:01 oranında ve H2O 2 H, 2 O 2 150 ml ilave edilir. Çözüm kendiliğinden kaynamaya başladığında, sıcaklık 90 ° C üzerinde artırır Emin H 2 O 2 çözeltisi, reaksiyon başlamadan önce, oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Aksi takdirde, kaynama çözeltinin sıcaklığı daha düşük 90 ° C olabilir,
- Uygun karıştırma için bir çözüm karıştırılır ve beher 20 dakika boyunca rahatsız sağlar.
- Birlikte slayt tutucu ile piranha çözüm dışarı slaytlar almak ve MiliQ H 2 O. içeren bir slayt tutucuya koyun Oda sıcaklığına ulaştığında Bu arada, bir belirtilen atık şişeye piranha çözüm atın.
- MilliQ H 2 O. ile slaytlar 3 kez durulayın Ekstra bakım daha ste alınmalıdırslaytlar olası kontaminasyonu önlemek için ps. 3. Adım devam. Hemen aşağıdaki adımlarla devam etmek için tavsiye edilir.
* Dikkat: piranha çözüm son derece duyarlıdır. Bu çözüm tutarken ekstra dikkatli alınmalıdır. Buna ek olarak, bu tür aseton gibi organik çözücü ile karıştırılmış yanlışlıkla, bir patlamaya yol açabilir.
2.. Lamel Temizleme
Bir microfluidic odası, bir kuvars slayt ve bir kapağı s dudak oluşmaktadır. Bir prizma tipi TIRF mikroskop kullanıldığında, bir lamel yüzey görüntüsü değildir. Bu nedenle, sadece H2O ve KOH ile bir lamel temizlemek için yeterlidir. Halinde, bir lamel (nesnel tipi TIRF mikroskobu ile örneğin) yansıması gereken, bu pirana çözeltisi (Aşama 1.7) ile lamelleri tedavisi için önerilir. Lamel yüzeyinin PEG'leme kaliteli değilse, bu proteinler için bir lavabo olarak hareket olabilir unutmayın birprotein konsantrasyonundaki değişikliklere neden d.
- H 2 O ile durulama Yeri lamelleri cam boyama kavanoz (24 x 30, 24 x 40 veya 24 x 50 mm 2). Tipik haliyle 5-15 lamelleri tek bir kavanoza yerleştirilebilir. MilliQ H 2 O. ile lamelleri 3 kez durulayın
- KOH ile temizlik. 1M KOH ile su yerine yerleştirin ve 20 dakika veya daha uzun süre lamelleri sonikasyon.
- H 2 O ile durulama KOH izlerini kaldırmak için MiliQ H 2 O ile lamelleri 3 kez durulayın. Adım 3'e devam ediyor.
Slaytlar ve Lameller 3. Amino-silanlaştıncı
Amino-silanizasyon kimyası ile kuvars slaytlar ve amin grubu ile lamelleri yüzeyini işlevselleştirilmesi. Metanol amino-silanizasyon reaksiyonu için bir katalizör olarak bir çözücü ve asetik asit gibi kullanılır.
- Metanol ile durulama. S'den boyama yemekler MilliQ H 2 O (değiştirinTeps'in 1 ve 2) metanol ile. Adım 3.3 kadar metanol slaytlar ve lamelleri tutmak. Metanol kirliliklerin beri bir zaman gereksiz yere uzun süre (örneğin birkaç saat) metanol slaytlar ve lamelleri tutmayın yüzeyine yapışır.
- Amino-silanizasyon çözelti hazırlanması.
- Metanol ile bir PYREX şişesi birkaç kez durulayın. 5 dakika veya daha uzun süre boyunca metanol ile şişesi sonikasyon. Bu temiz tutulan özel bir şişeyi olması tavsiye edilir.
- Şişe içine 100 ml metanol dökülür.
- Asetik asit içinde 5 ml.
- APTES 3 ml (3-aminopropil trimetoksisilan) ekleyin ve yavaşça çalkalanarak karıştırılır.
- Amino-silanizasyon. Aminosilanization reaksiyon karışımı ile slaytlar ve lamelleri içeren boyama yemekler metanol değiştirin.
- 20-30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, bir kez 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
- Metanol ile durulama. A değiştirinReaksiyon, metanol ile minosilanization. Metanol atın ve yeni bir metanol çözeltisi ilave edilir. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
Polimer (First Round) kullanarak 4. Yüzey Pasifleme
NHS-ester, bir polietilen glikol (PEG) ile birleştirilmesi yoluyla kuvars slaytlar ve lamelleri amin kaplı bir yüzey pasifleştirme. Bu reaksiyon, bir gece boyunca pH 8.5 'da PEG çözeltisinin doyurucu konsantrasyonu ile gerçekleştirilir.
- Slaytlar ve lamelleri Kurutma. N2 gaz kullanarak slaytlar ve lamelleri kurutun ve yan PEG'lenmiş yukarı baktığından olmak zorunda olduğu bir şekilde temiz bir pipet kutulara yerleştirin. Pipet kutu kısmen MilliQ H2O ile doldurulur Bu nemli ortam gecede inkübasyon sırasında kurumasına PEG'leme çözümü engeller.
- Reaksiyon tamponu hazırlanması. 10 ml sodyum bikarbonat ve 84 mg çözülmesiyle taze sodyum bikarbonat tampon maddesi (pH 8.5), 0.1 M hazırlanmasıMilliQ H 2 O. PH değerinin ayarlanması için hiç gerek yoktur. Bu solüsyon bir sonraki kullanımı (örneğin, adım 6.1) için dondurulmuş depolanabilir.
- PEGylation çözüm hazırlanması.
- Bir 1.5 ml bir tüp içinde NHS-ester PEG-NHS ester mPEG (5000 Da) içindeki bir (5000 Da), 13 ve 8 mg biyotinile 0.2 mg arasında bir PEG karışım hazırlayın. Slaytları N sayıda hazırlanırken, tek bir tüp içerisinde PEG karışımın K kat daha büyük bir miktarda hazırlar.
- 64 ul (veya N kez slaytlar K sayısı için 64 ul) yeni hazırlanmış bir tampon maddesi (4.2 Aşama) ekleyin. Onları tamamen eritmek için onu yukarı ve aşağı Pipet.
- Hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 dakika 16.100 xg ile santrifüj. Sonra pipetle etmeyin. Aksi takdirde, hava kabarcıkları Adım 4.4 de PEG'lenmesi müdahale hangi oluşturacak.
- PEGylation.
- Aşama 4.1 'den kurutulmuş bir kuvars slayta PEGilasyon karışımın 70 ul bırakın. 24 x 50 mm 2 cov durumunda, 90 ul kullanınerslip.
- Yavaşça çözüm üzerinde Adım 4,1 kurutulmuş lamel yerleştirin.
- , PEG'lenmesi bir üniforma ve kaliteli olması için hava kabarcıkları tanıtmak için özen. Nedeniyle yüzey gerilimi için, hava kabarcıklarının en kendiliğinden yüzey gerilimi nedeniyle beş dakika içinde, reaksiyon hacmi bırakabilir.
- Bir karanlık ve nemli ortamda slaytlar inkübe. Biz, pH 8 kullanımı NHS-ester PEG yarı ömrü yaklaşık bir saattir. En azından, 2 saat boyunca inkübe. Bir gecelik inkübasyon PEGilasyon (veriler gösterilmemiştir) daha yüksek kaliteli olur.
5. Uzun vadeli Depolama
-20 º C'de PEGillenmiş slaytlar ve N 2 lamelleri saklanması
- Slaytlar ve lamelleri Kurutma. Dikkatle, bir tarafına lamel kaydırarak slayt ve lamel sökmeye MiliQ H 2 O ile durulayın ve N2 ile kurulayın.
- Slaytlar ve lamelleri saklama. For hemen kullanım, PEG'lenmesi (Adım 6) ikinci turu için prosedürü takip edin. Uzun bir süre saklamak için, aşağıdaki adımları uygulayın.
- PEG'lenmiş yüzeyleri birbirinden uzağa doğru bakacak şekilde bir 50 ml tüp içinde kayması ve lamel bir çift yerleştirin.
- Kısmen, bunun tüpü kapatmak tüpü vakum ve daha sonra N2 ile doldurun. Bu adımlar, uzun bir süre için PEG'lenmiş yüzeyi koruyarak yardımcı olur. Tüpü sıkıca vidalayın ve -20 ° C'de saklayın Slaytların kalitesi (sağ, Şekil 3a) 3 aya kadar iyi kalır.
Polimer (İkinci Tur) kullanılması 6. Yüzey Pasifleme
PEG katmanı daha kalın yapmak ve aynı zamanda yüzey üzerinde kalan amin gruplarını söndürmek için PEGilasyon ilave tur. Kısa NHS ester PEG moleküllerinin (333 Da) kullanımı varolan PEG tabakası içine nüfuz etkili olabilir. Bu recDoğru bir slayt kullanmadan önce PEG'lenmesi bu ikinci turda yapmak tavsiye olunur.
- Reaksiyon tamponu hazırlanması. Taze sodyum bikarbonat tampon maddesi (pH 8.5), 0.1 M hazırlayın. Aşama 4.2 'den dondurulmuş çözeltisi de kullanılabilir.
- PEGylation çözüm hazırlanması. Sodyum bikarbonat tampon maddesi 63 ul 250 mM MS4-PEG 7 ul içinde çözündürülür.
- PEGylation. Adım 4.4 gibi aynı prosedürü uygulayın. Gece boyunca kadar 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Slaytlar ve lamelleri Kurutma. Slayt çifti ve lamel sökün, MiliQ H 2 O ile durulayın N 2 ile onları kuru ve temiz bir pipet kutuda saklayın. Adım 7'de, bir mikro-akışkan haznesi monte edilmesi için devam edin.
7. Bir mikroakışkan Odası Montaj
Bir PEGile kuvars slayt bir çift ve bir lamel kullanarak microfluidic odasını Montaj. Çift taraflı yapışkan bant bir ara parçası olarak kullanılır. Bölme böylece, epoksi yapıştırıcı ile kapatılır veEtkin çözüm kuvars slayt deliklerden tanıtılmaktadır.
- PEGilatlanmış tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye bir kuvars slayt yerleştirin.
- Slayt üzerinde çift taraflı yapışkan bantlar koyarak çaprazdan PEGillenmiş yüzeyinde bir kanal (7 mm genişliği 5) olun. Delik kanalın merkezinde konumlandırılmış olduğundan emin olun. Bir odasını yapma sürecinde PEGillenmiş yüzeyini bozmamak için özen gösterin. Bu, (bkz. Şekil 2) yerleştirilmesi ve farklı çift taraflı yapışkan bantlar yapışarak çok kanallı bir slayt yapmak mümkündür.
- Yavaşça odası tamamlamak için üstüne PEG'lenmiş lamel yerleştirin. PEGile tarafı aşağı dönük olmalıdır.
- Çift taraflı bantlar yerleştirilir alana lamel basarak odasına mühür. Haznesi su sıkıca kapatılmış olur böylece yavaşça ama iyice yapın.
- Epoksi yapıştırıcı ile haznenin kenarları kapatın.
- Üzerinde streptavidin veya nötravidin hareketsizP200 pipet kullanarak T50 içinde streptavidin veya nötravidin çözeltisi (10 mM Tris-HCI [pH 8.0], 50 mM NaCl tamponu) 0.1 mg / ml, 50 ul ekleyerek biyotinile edilmiş PEG katmanı. Sonra, T50 tampon 100 ul ile aynı hizada inkübasyondan 1 dk.
- Senin tek molekül görüntüleme için biotinli biyolojik moleküllerin ekleyin.
8. Geri Dönüşüm kaydırın
Kuvars slaytlar Geri Dönüşüm. İkinci slaytlar lamelleri ve çift taraflı yapışkan bantlar kapalı alarak geri dönüştürülür.
- Kullanımdan sonra, musluk suyu içinde odacıkları saklayın. Su içinde uzun süreli inkübasyon bölmelerin sökülmesini kolaylaştırır.
- Bir mikrodalga kullanarak musluk suyunda odaları kaynatın. Bir Pyrex beher kullanın. 10 dakika veya daha uzun süre kaynatın.
- Bir jilet kullanarak lamelleri ve çift taraflı yapışkan bantlar çıkar. Kendi düzlemine dik bir kuvars slayt basmayın. Aksi takdirde, kırar. Uzak kanaldan jilet tutun. Otherwise, bu kanalda çizikler tanıttı.
- Parmakları ile ovularak bir ev deterjan kullanılarak slaytlar durulayın.
- Cam boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tipik haliyle 5-15 slaytlar tek bir kavanoza yerleştirilebilir. 10% ev deterjanı ekleyin ve 20 dakika ya da daha uzun süre için slaytlar ses dalgalarına maruz. Sekme büyük bir su miktarı ile slaytlar durulayın.
- 1.2 Adım gidin.
Representative Results
Mikroakışkan odası montajı sonra (7.1 Adım - 7.6) ve Adım 7,7 yapmadan önce, bu PEGillenmiş yüzeyinin kalite kontrol yürütmek için tavsiye edilir.
Yüzey pasivasyon başarılı bir şekilde yapılmış ise, en az 10, spesifik olmayan bir 1-10 nM, floresanla işaretlenmiş protein haznesine (sol Şekil 3a) ilave edildiğinde gözlenen bir görüntüleme alanı (25 mm x 25 mm) başına adsorbe edilmiş proteinler bulunmaktadır.
Temizlik veya reaksiyon adımlardan biri düzgün yürütülen edilmediği zaman, non-spesifik sayısı önemli ölçüde artar proteinleri adsorbe ve CCD ekran floresan sinyalleri ile doymuş olabilir. Piranha dağlama atlanır Örneğin, gözlemlenen non-spesifik adsorpsiyon 100 kat daha büyük bir miktarı vardır (Şekil 3a; ortasında sol karşılaştırın). İkinci PEG'leme adım atlanır edildiğinde, yaklaşık 3 saati vardısa spesifik olmayan adsorpsiyon gözlenen daha büyük miktarda (Şekil 3b). Süresi kimyasal maddeler (örneğin, APTES birkaç ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza) (veriler gösterilmemiştir) kullanıldığında PEGilasyon düşük derecede görülmektedir. Zaman önemli bir miktarda da PEGillenmiş beri geçti zaman yüzey kalitesi de düşer (Şekil 3a, sağ ile sol karşılaştırın).
Bildiğimiz kadarıyla, bu PEGilasyonun iki tur tek-molekül çalışmaları için tanıtıldı ilk kez. PEGilasyonun iki tur PEG tabaka oluşumu (Şekil 3b) en yüksek kalitesini garanti eder. Çift PEGilasyonun üstün niteliği belirgin (Film 1b Film 1a karşılaştır) filmlerde gösterilir. Bu filmler, çözelti içinde floresan moleküller gelen arka plan sinyalleri çift PEGilasyon olduğu zaman, çok daha zayıf olduğu gözlenmiştir proteinler, iki kat PEG'lenmiş tabakası tarafından daha etkili bir şekilde püskürtüldü olduğunu gösterir, el. Bu iki aşamalı bir süreçtir şiddetle tavsiye edilir olsa deneme optimal olmayan pasivasyonu tolere ise, ikinci PEG'leme adım atlanabilir.
Şekil 1:. Yüzey işlemleri şematik: (a) bir mikroskop lamı, aseton, KOH, ve pirana çözümleri ile temizlenir. Bu NHS-ester PEG ile APTES ve PEG'lenmiş ile işlevlendirilmektedir. Gerektiğinde (b) bir örtücü cam, çözelti ile pirana KOH yanı sıra ile temizlenir. Bu NHS-ester PEG ile APTES ve PEG'lenmiş ile işlevlendirilmektedir.
fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2:. Mikroakışkan odası (a) bir tek kanallı odası. Mikroskop lamı delinmiş iki delik vardır. Bu bir çift taraflı yapışkan bant, iki dilim kullanarak lamel ile monte edilir. (B) üç kanallı odası. Mikroskop lamı delinmiş altı delik vardır. Bu bir çift taraflı yapışkan bant, dört dilim kullanarak lamel ile monte edilir.
Şekil 3: çözelti içinde boya etiketli proteinler ile çekilen CCD görüntüler. (A) CCD görüntüleri çözeltisi içinde 10 nM Cy3-labeld temsilcisi ile 60X objektif lens kullanarak prizma tipi toplam iç yansıma floresan mikroskop ile alınmıştır. (Sol) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı. (Orta) bir yüzey prepa olduBu makalede protokol aşağıdaki kırmızı, ama piranha dağlama geçildi. (Sağ) bir yüzey bu makalede protokol takip edilerek hazırlandı ve azot altında -20 ° C 'de 3 ay boyunca depolanmıştır. (B) çözeltisi içinde 10 nM Cy3-labeld Rep ile çekilen CCD görüntüler. (Sol) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı. (Sağ) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlanmıştır, ancak PEGilasyonun ikinci tur geçildi. Ölçek çubuğu = 5 um.
Film 1: çözelti içinde boya etiketli proteinleri ile alınmıştır CCD film. CCD filmler çözelti içinde 10 nM Cy3-labeld temsilcisi ile 60X objektif lens kullanarak prizma tipi toplam iç yansıma floresan mikroskop ile alınmıştır. Zaman çözünürlüğü 100 msn. (A) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı. (B) Bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı, ama oldu PEGyl ikinci turtirme geçildi. buraya tıklayın Film 1a görüntülemek için buraya tıklayın Film 1b görüntülemek için.
Discussion
Bu protokol kapsamında kritik adım
Bu amino-silanizasyon reaksiyondan önce yüzeyi hidrofilik hale getirmek için gereklidir. Bu, cam / kuvars yüzeyi üzerindeki serbest hidroksil grubu oluşturur pirana aşındırma yoluyla elde edildi. Yavaş yavaş iner yüzeyin hidrofil bu yana uzun bir süre için 2 H, O ya da hava ya da maruz kalan pirana kazınmış yüzey tutmak için önerilir.
NHS-ester PEG molekülü reaktiftir. -20 º C'de numuneler oluşturun ve azot altında bunları saklamak için tavsiye edilir Oda sıcaklığında APTES kimyasal raf ömrü kısa. Her ay bir yenisi ile değiştirmeniz tavsiye edilir.
Bu protokolün Değişiklikler
Eğer herhangi bir pratik bir nedenle piranha aşındırma kullanamazsınız zaman, zaman uzun bir süre için KOH kullanılarak aşındırma (örneğin oyeterli olmasını) e sahip ve hidroksil grubu da maruz yapacaktır. Bu alternatif yaklaşımın sıkan slayt ciddi çizikler nedeniyle birkaç geri dönüştürür sonra kullanılamaz hale geliyor.
Bu genellikle floresan organik malzemeler 7 giderilmesinde etkilidir propan meşale kullanarak bir cam / kuvars yüzey yakmak için uygulanmaktadır. Bu piranha gravür yedekli olduğundan bu işlem bu protokolde yer değildi. Bu işlem potansiyel olarak hidroksil gruplarının oksidasyonu yol unutmayın. Bir yüzey ya da KOH pirana çözeltisi kullanılarak kabartma bir kez Bu nedenle, bu işlem gerçekleştirilebilir olmamalıdır.
7 'den daha düşük pH değerine sahip bir tampon tek molekül görüntüleme için kullanıldığı zaman, PEG konformasyon pasivasyon derecesini azaltır "fırça" için "mantar" değişir. 7.0 'dan daha düşük pH kullanıldığı zaman, bu nedenle, daha da disukinimidil tartarat <kullanarak yüzeyi etkisizleştirmek için önerilirsup> 7.
Perspektifler
Bu çalışma, yüksek kaliteli yüzey pasivasyon ulaşmak için sağlam bir protokol sağlamıştır. Bu protokol, protein 14 hem de hücre ekstreleri içinde protein kompleksleri ile ilgili ve 15 imüno olan tek molekül floresan çalışmaları için yararlı olacaktır. Bu, yaygın olarak kuvvet ve tork spektroskopisi spektroskopisi 16 gibi diğer tek molekül teknikleri kullanılacaktır. Ayrıca, bir yüzey 17 adsorbe hücreleri önlemek için yararlı olacaktır.
Bu çalışmada verilen protokol, çok adımlı işlemler için talep edilir. Lipid-PEG 8 ve poli-lisin PEG 9 ile yüzey pasivasyon alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu yana, bunu uygulamak kolay olan herhangi bir kimyasal reaksiyonlar gerektirmez. Ancak, pasivasyon derecesi kimyasal modif yoluyla elde bu kadar yüksek değilBir yüzeyin ication.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
SDC, ACH ve CJ Avrupa Araştırma Konseyi aracılığıyla Hibeler (ERC-StG-2012-309509) Başlangıç tarafından desteklenmiştir. J.-MN Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) (2011-0018198) tarafından desteklenen; ve Kore ÇKS sayesinde Pioneer Araştırma Merkezi Programı (2012-009586) Bilim, ICT Bakanlığı ve Gelecek Planlaması (MSIP) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Küresel Frontier Projesi (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) gibi Kore MSIP tarafından finanse BiyoNanoTeknoloji Sağlık-Guard Merkezi tarafından desteklenmiştir. YKL ve J.-HH Seul City, Kore Seul Bilim Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Etiketli Rep proteini Dr Şua Myong cömert bir hediye oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J. Surface that resist biodegradation. Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
