Summary
Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.
Abstract
Mauthner hücreleri (M-hücreleri) teleost balık arka beyin bulunan büyük reticulospinal nöronlardır. Onlar organizma bir tehdit algıladığı oluşur C-başlatmak veya kaçış tepkisi olarak bilinen karakteristik bir davranış kilit rol oynayan nöronlar vardır. M-hücre yaygın bu eksitatör geniş bir yelpazede, önleyici ve nöromodülatör sinyalleri almak 1 gösterilmiştir yetişkin balığı olarak incelenmiştir. Biz omurgalı bir hazırlık sinaptik gelişme yönlerini incelemek amacıyla embriyonik zebrabalıkları M-hücre aktivitesini inceleyen edilmiştir. 1990'ların sonlarında Ali ve arkadaşları CNS büyük ölçüde sağlam 2,3,4 edildiği Zebra balığı embriyolarının, M-hücrelerinden kayıt yama kelepçe için bir hazırlık geliştirdi. O zaman amaç bir bozulmamış beyin-omurilik hazırlık içinde fonksiyonel sinaptik bağlantıları korurken Beyin nöronların, spinal kord nöronları ve gövde iskelet kası sinaptik aktivite kayıt oldu.Bu preparat, bugün laboratuarımızda kullanılmıştır. Mekanizmalar gelişimsel sinaptik plastisite incelemek için, eksitatör (AMPA ve NMDA-aracılı) ve 5,6-M hücrelerinin gelişmekte olan inhibitör (GABA ve glisin) sinaptik akımları kayıt. Önemlisi, bu benzersiz hazırlanması bizi dikkatle embriyonik organizmada sinaptik plastisite ve nöro-gelişimini incelemek için hazırlık hazırlık aynı hücrede (M-hücre) geri dönmek için izin verir. Bu karışımda sağladığı faydalar 1) gibi sağlam, M-hücre üzerine fonksiyonel sinaptik bağlantıları, 2) göreceli olarak pahalı olmayan preparatları, hazır embriyo 3), büyük bir kaynağı aynı hücre tipine dönmek için 4) yeteneği (örneğin M- Her hazırlanmasında hücre), tek bir hücrenin seviyede sinaptik geliştirme balık balık incelendi ve böylece 5) embriyoların saydam olmasından dolayı, bütün preparatları görüntüleme.
Introduction
Gelişimsel nörobiyoloji seçkin sorulardan biri sinaptik olgunlaşması sırasında sinaptik plastisite olayların rolü ile ilgilidir. Bizim araştırma sinaptik gelişme bağlamında hayvan davranışlarını anlamanın bir genel hedefi ile sinaptik gelişmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak plastisite üzerinde duruluyor. Bunu yapmak için, biz 1990'ların sonlarında gelişimsel çalışmalar için önemli bir çekiş kazanmış bir organizmanın (Zebra balığı, Br.rerio) bir ölçüde sağlam hazırlık geliştirdi.
Zebra balığı nörogelişimsel çalışmalar için birçok avantaj sunar. Örneğin, genom dizilimi ve bir gen aktivite ve protein ifadesi susturulur morfolino knockdowns ve çinko-parmak tırnakları nükleaz gerçekleştirebilir. Bir de aşırı ekspresyonu çalışmalarını gerçekleştirmek ve transjenik 7-9 yapılabilir. Embriyolar elde etmek nispeten kolay ve bol veembriyonun şeffaf doğası iyi görüntüleme ve opto-genetik çalışmaların kendisini ödünç. Ayrıca, davranış analizi yapılabilir, ve elektrofizyolojik deneyler, in vivo olarak bir hücre fonksiyonunu incelemek sağlayan, büyük ölçüde sağlam organizmalarda kas lifleri, omurilik nöronları ve arka beyin nöronları üzerinde yapılabilir. Daha da önemlisi, hazırlama hazırlanması için, hücrenin sadece aynı sınıfta sinaptik aktivitenin tetkiki, ancak nöronların aynı çift edebiliyoruz. Diğer bir deyişle, bu gelişimini incelemek için, yerinde, aynı nöron geri hangi nadir omurgalı hazırlıkları biridir.
Mümkün olduğu kadar canlı nöronal devre korumak için, biz, arka beyin ve omurilik değişmeden kalır edildiği bir preparasyon geliştirilen M-hücrelerinden yama sıkıştırma sırasında. Bu hazırlıkta, beyni kaplayan gözler, çene ve deri hafifçe kaldırılır ve arka beyin Peele olduğunu vardıruzaklıkta Notokordun D, arka beyin ventral yüzeyine erişim sağlar. Reticulospinal nöronlar birkaç mikrometre derin bulunan ve nispeten kolay erişilebilir. 48 saat sonra döllenme (hpf; bazı kısaltmalar Tablo 1'de listelenen) de hücreleri elektrik kompakt ve bir sadakatle, (eksitatör ve inhibitör akımları hem de) onlardan voltaj-kapılı akımları ve aksiyon potansiyelleri, sinaptik aktivite kaydedebilirsiniz.
Bulgularımız sinaptik gelişme ve olgunlaşma birçok yönleri önce kuluçka için 24 saat içinde meydana düşündürmektedir ve dikkatimizi bu nedenle kadar 72 hpf 24 hpf yaş arasında değişen organizmalar odaklanmıştır. Bununla birlikte, 72 ile HPF, M-hücreleri daha az elektrik kompakt ve uygun şekilde yer kelepçe zordur. Bu teknik, M-hücreleri, aynı zamanda onun homologları, Ort2 cm ve MiD3 cm sadece kaydetmek için kullanılabilir. Teorik olarak, bir de sp, çift kayıtları yapabilirinal kord böyle bir primer motor nöron olarak ve M-hücreden nöron, ama bu zor ve böyle bir zor tekniği elde faydaları gerekli olağanüstü çabaya değer olmayabilir savundu olabilir.
Protocol
1.. Hazırlık ve Diseksiyon
- Sylgard ile kaplı diseksiyon çanak hazırlayın. TEFE (Sarasota, Florida, ABD; Tedarikçiler Tablo 2'de listelenmiştir) itibaren kayıt odaları (Şekil 1) yemekleri diseksiyon olarak kullanılır. Odaları cam slaytlar barındıracak şekilde tasarlanmıştır ve küçük plastik pullar Sylgard için kalıp olarak kullanılır. Birinci çamaşır yağ ve sıvı Sylgard yıkama merkezine eklenir ile slayt sabitlenir. Sylgard gecede tedavi edecek ve bunu yaptığı gibi, bu diseksiyon çanak taban olur cam slayt, küçük, yuvarlak bir yatak oluşturur. Kayıcı kayıt odasına yerleştirilir ve preparat yapıştırılmış olduğu için bölmenin (Şekil 1) temel olarak hizmet vermektedir.
- Tablo 3'te listelenen çözümler hazırlayın. Hücre içi çözeltiler steril tutulması gereken süre Hücre dışı çözelti oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Bir de Lu ekleyebilirsinizM-hücre morfolojisi bu görselleştirme Deneyin sonunda gerçekleştirilebilir, böylece, hücre içi çözeltisine Cifer sarı (% 0.1). Bu hücre kimliğini (Şekil 2) onaylamak için hizmet vermektedir.
- 28.5 ° C'de yumurta su yabani tip Zebra balığı embriyolar yükseltmek ve Kimmel ve ark. 10'a göre toplamak ve sahne. Disseksiyonlarıyla için ayrıca kayıt odası olarak hizmet vermektedir diseksiyon çanak embriyolar transfer. Yakın fizyolojik tuzlu yaklaşmaktadır; bir anestezi tuz çözeltisi (çözelti 1, Tablo 3% 0.02 tricaine) içinde 7-10 dakika boyunca anestezisi. Yeterince hafif bir kuyruk tutam yanıt inceleyerek anestezi ise bir belirleyebilirsiniz.
- Notokordun boyunca ve 0.001 "bir mikroskop (Şekil 1) 25X büyütme kullanarak tungsten tel (Bilimsel Instrument Services. A.Ş., Ringoes, NJ, ABD). Tungsten tel rahatlıkla kesim ile Sylgard kaplı çanak üzerine embriyolar Pin içindeince diseksiyon makas ile küçük segmentlere.
- Diseksiyon 40-50X diseksiyon kapsamı üzerinde büyütmeyi ayarlayın. Embriyo çanak, çene, göz ve ön beyin tutturulmuş sonra forseps iyi bir çift (Dumont # 5) kullanılarak kaldırılır.
- Beyin hafifçe dikkatle notokord ve beyin arasındaki forseps çalışarak uzakta yatan Notokordun soyulur. Ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde arka beyin yavaşça ters çevrilir. Bu konumlandırma yaşlı larva 20-50 mikron (Şekil 2A) genç embriyoların ventral yüzeyinin 5-10 mikron içinde genellikle ve ~ M-hücreleri, iyi erişim sağlar.
- Dikkatlice yama kelepçe deney yapılabilir kayıt kurulum için hazırlık hareket ettirin. M-hücreleri, Nomarski Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) ile görüntülendi rağmen görüntüleme diğer modları (yani Hoffman modülasyon kontrast veya Dodt Degrade Kontrast Görüntüleme itibarenLuigs ve Neumann, Almanya) de kullanılabilir.
2. Patch Kelepçe Kaydı (Tüm Hücre Modu)
- Tüm kayıtlar Tam hücre yama kenetleme modunda 11 yapılmaktadır. Kayıt odaları elektrofizyoloji kurulumunda bir mikroskop sahneye yerleştirilir. Bizim aşamaları sabit ve dik yama kelepçe mikroskop hareketli bir mikroskop platform ya da bir mikroskop çevirmen cıvatalı.
- TEFE elde edilen ince duvarlı, borosilikat cam, yama kelepçe pipetlerinin yatay çektirmesi (Sutter Instruments Co P-97) üzerinde çekilir. Pipet ucu çapları pürüzsüz bir kenarına alev parlatma sonra 0,2-0,4 mikron mertebesindedir, ve sap konik uzunluğunda ~ 4 mm.
- Elektrofizyoloji kurulumunda amplifikatör kafa aşamasına pipet takın. Bu conta, yüksek direnç oluşumu için uygun olan bir pipet için bir giriş açısı sağlar olarak yatay eksene yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile baş sahne tutmak için önemlidirMauthner hücre üzerine s.
- Sadece banyo çözümü girmeden önce, ucu kirletme olasılığını azaltmak için pipet pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır. MEPSCs kaydederken, banyo çözümleri glisin reseptörleri ve 10 mcM Bicuculline veya GABA A reseptörleri bloke etmek için 100 mcM pikrotoksin engellemek için aksiyon potansiyelleri, 5 mcM striknin engellemek için 1 mcM TTX içerir. MIPSCs kaydederken, banyo çözümleri 1 mcM TTX, Kynurenic asit ve ilgi reseptör aktivitesine bağlı Bicuculline ya zehir ya içerir.
- Pipet pozitif basınç küçük bir miktar ile M-hücre Yaklaşım. Pozitif basınç yavaşça bir taraftan diğer tarafa iter hücre ve hücre hemen üzerinde yer alan zaman, hücre zarı üzerinde küçük bir çukur meydana getirir. Pipet ile membran arasında güçlü bir sızdırmazlık meydana getirilebilir, böylece hafifçe hücre yüzeyi temizlemek için birkaç saniye yerinde pipet bırakın. Pipet pozitif basıncı serbest bırakmakConta başlatılabilir ve negatif pipet potansiyelleri ile birlikte bir negatif basınç küçük bir miktar birkaç saniye içinde oluşan GigaΩ mühürler ile sonuçlanır sağlar.
- -60 MV amplifikatör tutma potansiyeli değiştirin. Emme kısa bir pals serisi ile hücre zarı yırtılabilir. Hemen membran potansiyelleri kayıt ve kapasitans eserler en aza indirmek. % 70-85, hücre kapasitansı (C m) ve erişimi (serisi) direnç (R a) dengeleyin. Ra, rutin, bir dakika 30 saniye izlenir ve% 20 veya daha fazla bir değişiklik varsa, deney iptal edilmelidir.
- Deney sona erdi ve yeterli veri elde edildikten sonra, preparat forseps bir çift arka beyin kaldırarak feda edilmektedir. Bu noktada, veri analizi başlayabilir.
Representative Results
Bu yazıda biz özellikle M-hücre odaklanarak, zebrabalıkları reticulospinal nöronlardan gelen bütün hücre modunda yama kelepçe kayıt için bir yöntem mevcut. Tabii ki, bu tür dışarı dışarıda hücre bağlı, iç-out ve diğer yama kelepçe modlarda kaydetmek de mümkün. Bir elde bir veri tipi burada sunduğumuz ne sınırlı, ama biz de sinaptik gerilim-kelepçe modunda aktivite (eksitatör ve inhibitör) yanı sıra güncel kelepçe aksiyon potansiyelleri bir örnek vermeye çalışacağız değildir. Organizma yaş ve M-hücreleri daha kapsamlı ve ayrıntılı dendrite geliştirmek gibi, yeterli hücre kelepçe kelepçe ve uzay voltaj yeteneği tehlikeye ve güncel kelepçe modu tercih kayıt haline gelir.
Şekil 3, (1 uM) ve farmakolojik maddeler için TTX mevcudiyetinde 48 HPF embriyolardan elde uyarıcı AMPA ve NMDA reseptörü akımları için temsili kayıtlarını gösterirGABA ve glisin reseptörleri bloke eder. M-hücreler -60 mV'de voltaj kenetlenmiş olduğunda, akımları sinaptik AMPA reseptörlerinin aktivasyonu (Şekil 3A) kaynaklanmaktadır. Toplama ve bu olayların analizi, böyle bir yükselme zamanı, çürüme zaman, genlik ve frekans gibi parametreleri kaydetmenize olanak verir. AMPA olaylar genelde bir hızlı yükselme zamanı (~ 0.1 msn% 20-80 yükselme zamanı) ve çürüme süresi (~ 0.5 msn), ve yaklaşık 25 PA ortalama genliği sergilerler. M-hücreleri 40 mV'de tespit edildiği zaman, elde edilen dışa doğru akımlar ve AMPA NMDA reseptör aktivitesi (Şekil 3C ve 3D) kaynaklanmaktadır. NMDA reseptör akımları AMPA alıcısı akımlarının daha uzun zaman süreçleri gösterirler ve 2,6 reseptörleri NMDA Mg blok çıkarmak için pozitif potansiyel ya da Mg içermeyen solüsyon içinde kayıtlı olması gerekir. Şekil 3D gösterilen ortalama mEPSC +40 mV kaydedildi karışık AMPA ve NMDA akımları temsil eder.
FiMauthner hücrelerden mIPSCs kaydederken Güre 4 temsilci sonuçlarını gösterir. Bu olaylar, AMPA ve NMDA reseptörlerini bloke etmek için TTX mevcudiyetinde (1 uM) ve Kynurenic asit (1 mM) oluştu. Bu olaylar 48 hpf göre oldukça hızlı artış ve eksilme kinetiği gösterirler ve 2-3 dk kayıt üzerinde 3 çoğu elde etmek için yeterince sık. Hücreye depolarize akımını enjekte sonucunda kaydedilen 5 gösterileri aksiyon potansiyelleri Şekil. Suprathreshold uyaranlara (Şekil 5A) ile birlikte enjekte edildiği zaman, bazen çok AP ateş, ancak 48 HPF embriyoların M-hücreleri, genellikle, tek bir eylem potansiyeli (Şekil 5B) yangın.
| Kısaltma | Tam adı | |
| 1.. | MPSC | Minyatür postsinaptik akım |
| 2. | mEPSC | Minyatür uyancı postsinaptik akım |
| 2 | mIPSC | Minyatür inhibe edici postsinaptik akım |
| 3. | MQ | Mega Ohm (direnci birimi, 10 6 Ohm) |
| 4. | GΩ | Giga Ohm (direnci birimi, 10 9 Ohm) |
| 4. | MOsm | Milli osmolar (ozmolaritenin ünitesi; 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | tetrodotoxin |
| 5. | ATP | adenozintrifosfat |
| 6. | GTP | guanosin trifosfat |
| 7. | GFP | Yeşil floresan proteini |
Tablo 1.
| Şirket | Katalog Numarası | | |
| 1.. | Bulaşık Diseksiyon | Warner Instruments | 64-0291 |
| 2. | 0.001 "Volfram teller | Scientific Instruments Hizmetleri A.Ş. | W406 |
| 2 | Diseksiyon mikroskobu | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| 3. | Pipet Çektirme | Sutter Aletleri A.Ş. | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige Grubu | MF-900 |
| 5. | Dik Patch kelepçe mikroskop | Leica Microsystems | DMLFSA |
| 6. | Mikromanipülatör | Siskiyou A.Ş. | MX7500 |
| 7. | Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| 8. | Amplifikatör | Molecular Devices | 200B |
| 9. | Kazanım yazılım | Molecular Devices | pClamp9 |
| 10. | Axograph X | Axograph | Axograph X |
Tablo 2.
| Çözüm adı | Reaktif ve konsantrasyonu (mM) | |
| 1.. | Çözüm Diseksiyon | 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glikoz ve% 0.02 Tricaine |
| 2. | Hücre dışı çözelti MPSC | 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz ve 0.001 TTX |
| 3. | MPSC Hücre içi çözümtion | 134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 2 Na-ATP, 0.4 Li-GTP |
| 4. | Aksiyon potansiyeli Hücre dışı çözelti | 137 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES ve (10 uM D-tubokurarin) ile 10 Glukoz |
| 5. | Aksiyon potansiyeli Hücre içi çözelti | 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4 mg-ATP ve 0.4 Li-GTP. |
Tablo 3. Tüm hücre dışı çözeltiler 290 mOsm ve pH 7.8 'e ayarlanır. Tüm hücre içi çözeltiler 280 mOsm ile pH 7.4' e ayarlanır.
Şekil 1. Çanak ve sağlam arka beyin-omurilik hazırlık Diseksiyon. (A) TEFE elde edilen çanak Diseksiyon ve kayıt. Ince bir yıkama dikkatle t üzerine kapatılıro yemeğin altındaki cam slayt ve Slygard iyi uygulanır. (B) 48 hpf Beyin-omurilik hazırlık. Arka beyin ve ventral yüzeyi yukarı bakacak ve M-hücresi sadece bir ok ucu seviyesinde doku yüzeyinin altında yer almaktadır.
Şekil 2. Kısa bir süre sonra, kuluçka 2 dpf embriyo elde edilen M-hücrenin (A) Nomarski, farklılık belirleyici kontrast image. Görüntü M-hücreden spontan harekete geçiren sinaptik etkinliği kayıt sonra çekilmiştir. (B), hücre boyunca Lucifer sarı ile dolduruldu deney. Izni ile 12 uyarlanmıştır.
Şekil 3,. (A) Kendiliğinden AMPA mEPSCs bir M-hücresinden kaydedilen -60 mV bir tutma potansiyelinde. (B) (A) kayıt elde edilen ortalama mEPSCs. (C) Kendiliğinden AMPA ve NMDA (ok uçları) +40 mV bir tutma potansiyelinden bir M-hücresinden kaydedilen mEPSCs. (D) 'de elde edilen kayıt Ortalama mEPSCs (C). Glutamat mEPSCs glisin ve GABA akımları engellemek için TTX varlığında aksiyon potansiyelleri engellemek için (1 uM), striknin (5 uM) ve pikrotoksin (100 uM) kaydedildi.
Şekil 4. (A) -60 mV bir tutma potansiyelinden bir M-hücresinden kaydedilen spontan mIPSCs. (B) (A) kayıt elde edilen ortalama mEPSCs. mIPSCs GABA akımları engellemek için glutamat reseptör aktivitesi ve Bicuculline (10 uM) engellemeye aksiyon potansiyelleri, Kynurenic asit (1 mM) engellemek için TTX mevcudiyetinde (1 uM) kaydedildi.
Şekil 5,. Aksiyon potansiyeli, bu özel hücrenin bir eşik üstü uyarıcı (0.48 nA) birçok aksiyon potansiyelleri (A) ortaya çıkardı. Bir M-hücreden kaydedilmiş, ancak eşik için bir uyarıcı, sadece tek bir hareket potansiyelini (B) 'nin üretimi ile sonuçlanır. A ve B de gösterilen izleri için (C) Current protocols.
Discussion
Yukarıda tarif edilen protokol tek M-hücreleri ve kendi homologlarını ikinci kelepçe kayıt yama sağlar. Tekniğin zor ve bakım prosedürü boyunca birçok kilit alanda alınmalıdır. Biz şimdi bu alanların bazı tartışacağız ve başarı sağlamak için yararlı ipuçları sunacak.
Diseksiyon / kayıt odasının inşaatı deney önemli bir yönüdür. M-hücreleri, diferansiyel-interferans-kontrast kullanılmadıkça görmek zordur. Nomarski DIC temiz bir cam kapak slipleri ile iyi çalışır, ancak Sylgard (~ 1-2 mm) çok ince bir tabakası, M-hücrelerinin tanımlanması müdahale böyle bir ölçüde DIC deforme olmaz bulduk. Bu nedenle, küçük plastik bir çamaşır makinesi (~ 5 mm çapında) yerleştirilir edildiği altındaki ince bir cam lamel sahip olan bir kayıt odası kullanın. Bir petri tabağına Sylgard 184 karıştırmak ve dikkatli bir Pasteur pipeti ile yıkama içine sıvı Sylgard ekleyin. Sylgard bir kaç gün boyunca oda sıcaklığında tedavi edilebilir ya da hızlı sertleşmesi için ısıtılabilir. Bu gerekli değildir, ancak yıkama, Sylgard kürlendikten sonra uzaklaştırılabilir. Diseksiyon / kayıt odası yapıldıktan sonra taze Sylgard kaplı cam slayt gerekli önce, birkaç hafta için kullanılabilir.
Prosedürü bir sonraki adım deney (Tablo 3) gününde ilgili çözümleri her telafi etmektir. ATP ve GTP ancak her ihtiva eden hücre-içi çözeltiler -20 ° C'de önceden yapılan ve 5 ml alikotlar içinde muhafaza edilirler Kayıt günde bir tümbölen oda sıcaklığında ve taze ATP'ye çözülmüş ve GTP ilave edilir. Çözelti, 280 mOsm ile pH 7.4 'e ayarlanır. Bizim ellerde, biz bulmak iyi kayıtları günlük olarak sonuçlar üzerinde taze ATP ve GTP eklenmesi. Tüm çözümler başarı iyi şans için steril tutulması gerekir.
Hücre içi çözeltiler throug süzüldü olmalıdırha 0.22 mikron filtre (Sigma) kaydını etkileyebilecek küçük parçacıklar ve enkaz kaldırmak için. Bunu yapmak için, ilk olarak, bir 1 ml şırınga içine hücre içi çözelti çizmek şırınganın ucuna filtre iliştirerek ısıtıldı ve filtrenin sonuna kadar, ince ucuna çekilmiş plastik bir pipet ekleyin. Bu bize cam yama pipet içine doğrudan süzülür hücre içi bir çözüm uygulamak için izin verir.
Çözeltiler hazırlanır sonra, embriyo anestezi uygulandı ve kesilmiş olabilir. Önceki diseksiyon için, yeterli bakım organizmanın yaşına değerlendirmek için alınmalıdır. Biraz daha farklı bir hızda bir kavrama yaşları içinde her embriyo. Organizmanın yaşına değerlendirilmesi Bu nedenle bu tür Somitlerin sayısı, vücudun genel şekli ve yumurta döllenme zaman olarak fenotipik işaretler aracılığı ile tespit edilmiş işlemler 10,13 göre bunu yapmak için önemlidir. Tüm diseksiyonlar bir Dumont # 5 ince çifti ile yapılırforseps. Bu keskin olması ve iyi çalışır durumda aksi takdirde arka beyin ventral yüzeyinde arka beyin ve herhangi bir bağ dokusu kaplayan deri kaldırmak için çok zor olacaktır gerekir. Biz sık sık kullanım birkaç hafta sonra forseps keskinleştirmek ve bileme taşı ile bu kendimiz yapmak zorundayız.
Sylgard ince tabaka balık pin, biz ince tungsten tel çapı 0.001 inç gelen moda işaretçilerine kullanın. Pimleri bir mikroskop altında bir eski, mikro diseksiyon makas ile kesilmiş ve sağ Notokordun aracılığıyla sığacak kadar küçük vardır. Başka noktada embriyolar iğneleme onları hareketsiz ve gerçekleştirmek için diseksiyon neredeyse imkansız hale getirir. İlk kayıtları gerçekleştirmek için öğrenme, bu onun homologları kimlik M-hücreye zor olabilir (komşu rhombomere bulunan özellikle Ort2 cm - rhombomere 5). Bazı embriyonlar, bu iki çift boyutunda benzer görünür. Otolitler proM-hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olması için uygun bir işareti sunabilir. 48 de M-hücreleri hemen yanında otolit için bulunan HPF ve otolitler diseksiyonu sırasında kaldırılır olsa bile, kendi orijinal pozisyon için bir belirteç olarak hizmet arka beyin bir hafif hasarlı yan bölge, geride bırakmak. M-hücresi ya da başka bir GFP floresan markörü eksprese eden transjenik balık, yeni deneyi için mükemmel preparatlar sağlar. Küçük homologlar pF 12-14 yakın iken bizim ellerde M-hücreleri, 48 hpf yaklaşık 18-24 pF bir membran kapasitans var. Daha büyük bir yüzey alanına sahip küçük hücreler hücrelere kıyasla (pico farad (pF) cinsinden ölçülen) daha büyük bir membran kapasitans değerleri vardır. Bu nedenle, daha büyük bir membran kapasitans hücreleri daha büyük kapasitans değerleri, hücre boyutu, kaba bir göstergesi olarak da kullanılabilir. Bu elektrofizyolojik karakteristik M-hücre türdeşlerini tespit edilebilir hangi başka bir özellik olarak hizmet vermektedir. Son olarak, sık sık Lu kullanınBizim kayıt bize kayıtları tamamlandıktan sonra floresan görüntüleme kullanarak soruşturma altında hücre tipi sağlam bir tanımlama yapmak için izin verir (hücre içi) çözümleri, sarı Cifer.
3.5-4.5 MQ aralığında pipet dirençler genellikle 8 ila 15 MQ değişmektedir uç boyutu ve düşük erişim direnci arasındaki en iyi uzlaşma vardır. ~ 0.1 msn (% 20-80) kez yükselecek ve ~ 0.5 msn üstel 12,14,15 bozunur (Şekil 3A ve 3B); Bu hızlı kinetik olaylar için özellikle önemlidir. Veriler, 50-100 kHz sayısallaştırılması oranında alınan ve 5-10 KHz'lik bir düşük geçiş frekansı ile süzülür. Yama pipetler ile ilgili olarak, biz onlar yangın cilalı bir kayıt elde etmek olması gerekmez bulduk, ama anekdotal, cilasız pipet ile karşılaştırıldığında iyi mühürler elde biraz daha iyi bir şans sunmak için görünür. Pipet uçları nispeten büyük olduğundan, biz ver katmayançözüm girmeden önce pipet y çok pozitif basınç. Bu basınç fazlalığı olarak uygulamak için pozitif basınç, uygun miktarı konusunda karar vermede bir uygulama çok hücre hareket edecek alır ve conta oluşumunu engeller. Hücre yavaşça eski yerinden olduğu gibi aynı zamanda sinaptik temas zarar verebilir. Diğer taraftan, çok az basınç kirli ipuçları sonuçları ve iyi bir conta oluşturmak için yeterince hücre yüzeyini temizlemek değildir. Orta bir tek önemli uygulama ve deneyim yoluyla elde edilir. Seal formasyonu pipet negatif gerilimlerden uygulamaları ile geliştirilebilir. Biz genellikle tüm hücre moduna devrimler için mükemmel 1.2-2 GΩ mühürleri var.
Farmakolojik maddeler, hücre sitoplazması uygulanacak gerektiğinde, önceden pipet doldurulmadan hücre içi çözelti içinde içerir. Ajanların kaybını önlemek için pipet çözüm hazırlanırken dikkat edilmelidirBu 0.22 mikron filtre bağlanan alarak. Bu nedenle, ilk olarak hücre-içi filtre ortamı, ve daha sonra dikkatli bir şekilde filtre edilmiş çözelti için bir farmakolojik madde ekleyin. Hücre içi bölmeye bileşiklerin uygulama zorlukları kendi benzersiz belirledi. Örneğin, hücre içi ortamı için ilaçların eklenmesi genellikle bir conta oluşturan GΩ şansını azaltır, ancak noktasına bu deney için önemli bir engel değildir burada.
Bir bu şekilde farmakolojik maddelerin bu uygulama madde, tam hücre konfigürasyonu başlangıcından itibaren hücreye anında erişim yana deneyi en uygun kontrol kayıt izin vermez gerçekleştirmek gerekir. Bu deney, bu tip boyunca veri kayıt sırasında, bu nedenle, bir sonraki en iyi kontrol maddesinin etkin olmayan bir formunun hücre içi bir uygulamadır farkında olmalıdır. Birçok durumda, bu, ısı ile inaktive edilmiş bileşiğin form, karıştırılmış peptid o alırtedarikçiden temin inaktif izomeri r.
Biz sinaptik akımlar (mPSCs), voltaj-kapılı akımları ve aksiyon potansiyelleri şeklinde veri kazanır. Biz Axograph X (John Clements) kullanmayı tercih rağmen Minyatür akımlar, birkaç mükemmel programlar (pClamp, Axograph, vb) ile analiz edilebilir. Axograph X hem Windows hem de Macintosh platformlarında çalışır ve elektrofizyolojik veri toplama ve analiz hem de kullanılabilir. mEPCs kaydın kendisi elde deneycinin tercih edilen bir şablon yardımıyla elde edilir. Bireysel olaylar Biz Axograph X'den olay izleri kopyaları da dahil olmak üzere rakamlar, üretebilir KaleidaGraph (Synergy Software) veri tabloyu dışa böyle yükselme zamanı, genlik, yarım genişlik ve çürüme süresi, vb gibi özellikleri için analiz edilebilir
Deneyin daha zor yönlerinden biri, kayıt temiz sağlamak için yeterince gerçekleştirilmiştir belirleyen birgüvenilir veri. Büyük akson ve geniş dendritik süreçleri var M-hücrelerinden mPSCs kaydederken Örneğin, uzay-sıkma sorunlar ortaya çıkabilir. Ne zaman gerilim sıkma, bir genel (erişim direnci (R a) düşük olup özellikle) oldukça iyi bir pipet ucundaki gerilimi kontrol edebilirsiniz, ama çok dendritik süreçleri veya akson zar potansiyelinin uygun şekilde kontrole sahip olmayabilir uzakta pipet ucundan. Hücre doğru sıkıştırılmış alanı olup olmadığını belirlemek için bir yöntem kaydedildi mPSCs genliği vs yükselme süresi bir dağılım grafiği üretmektir. Veriler arasında bir korelasyon yetersiz alan sıkma düşündürür. Uzay kelepçe kötü ise diğer bir deyişle, daha sonra pipet yakın meydana mPSCs hızlı uzak pipetle bazı mesafe meydana gelen olaylar daha kat ve daha fazla genliklere yükselecek olacaktır. Bir korelasyon mevcut ise, o zaman veri sorunludur ve kullanılamaz.
Başka bir görünümü,ele alınması gereken elektrofizyolojik kayıtları sızıntı akımlarının olmasıdır. Voltaj, Na + ya da K + gibi akımlar voltaj bağımlı akımları kayıt etmek için bir hücre bağlama olduğunda bu durum özellikle geçerlidir. Zar potansiyeli dinlenme sapma olduğunda, kaçak akımlar voltaj bağımlı aktivite ile birlikte kaydedilebilir. Kaçak akım (I L), potasyum bir kombinasyonu (I K), sodyum (Na I) ve non-voltaj kapılı kanallar vasıtasıyla klorid (I Cl) mevcut ilgi aktivitesini belirsiz ve kayıt çıkarılması gerekmektedir. Amplifikatör, tipik olarak P / N protokolü olarak adlandırılan çalıştırarak, kayıt sırasında çevrimiçi Bu fonksiyonu gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. P / N protokol sırasında amplifikatör diğerlerinden birkaç küçük kutupsallık giderilişlerini (veya hiperpolarizasyonu) çalışacak ve ortaya çıkan kaçak akımı kaydeder. Bu voltaj-kapılı kanalları etkinleştirmek yok yeterince küçük darbeleri kullanmak önemlidir. MevcutBu darbeler sırasında meydana s kaydedildi ve bu kaçak akımlar voltaj kapılı kanal aktivitesi çıkarılır böylece ortalaması alınır.
Son olarak, bir hesaba hücre içi ve hücre dışı çözümler arasında bir elektrodun ucunda oluşur birleşme potansiyeli almak gerekir. Hücre içi ve hücre dışı çözümler genellikle farklı etkinlikler ve hareketlilik ile, farklı iyonlarının oluşmaktadır. Alt mobilitelerde büyük iyonları küçük olanlardan daha iyon hareketine daha büyük bir rezistivitesi sunacak ve bu çözümleri kavşakta küçük ama önemli bir potansiyel farkı neden olabilir. Hücre tarafından yaşanan uygun gerilimler belirlenmesi, bu birleşme olası dikkate alınmalıdır.
Burada sunulan tekniği yıllardır bizim laboratuvarda tarafından kullanılan biridir. Bununla birlikte, M-hücre kayıt alternatif yöntem vardır. En önemlisi, Joseph Fetcho ve arkadaşları geliştirmek vared biri burada, M-hücresi dorsal yüzeyi 16 yaklaşılır burada sunulan daha az invaziv bir şekilde (4-5 günlük) büyük larvalarının M-hücrelerinden kayıt hangi mükemmel hazırlanması. Benzer bir teknik denedik ama daha kolay hücre, özellikle, genç balıklar (örneğin, 24 HPF HPF 72) olarak, beyin yüzeyine yakın olan arka beyin, ventral taraftan M-hücre yaklaşım buldu. Bundan başka, sırt yüzeyinden bir yaklaşım genellikle kayıt içine ek değişkenler tanıtmak için bir potansiyele sahip olan M-hücre, bir floresan etiket eksprese eden bir transgenik hattın kullanımını gerektirir. Yabani tip balık kullanırken bu sorun mevcut değil. Ancak burada sunulan tekniği ile, biz genç hayvanları (72 hpf 24 hpf) okuyan sınırlıdır. Böylece, her bir yaklaşım, yararları ve sınırlamaları vardır.
Varian bir analiz student t-testi, iki veri gruplarını karşılaştırmak için kullanılabilirce (ANOVA), birden fazla grubu karşılaştırmak için kullanılabilir. Bakım non-parametrik veriler vs parametrik için uygun post-hoc testi seçmek için alınmalıdır.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Fen Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve DWA için Yenilik Kanada Vakfı (CFI) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
