Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Patchclamp Optagelser fra embryonale zebrafisk Mauthner Cells

doi: 10.3791/50551 Published: September 10, 2013

Summary

Vi har udviklet en intakt hjerne-rygmarv forberedelse til at registrere og overvåge elektriske aktivitet via patch clamp-optagelse fra Mauthner neuroner og andre reticulospinal celler i zebrafisk embryoner. Således er vi i stand til at optage excitatoriske og hæmmende synaptiske strømme, spændingsstyret kanal aktivitet og action potentialer fra vigtige neuroner i et embryo under udvikling.

Abstract

Mauthner celler (M-celler) er store reticulospinal neuroner beliggende i baghjerne af benfisk. De er centrale neuroner, der er involveret i en karakteristisk opførsel er kendt som C-starter eller undslippe reaktion, der opstår, når organismen opfatter en trussel. M-celler er blevet grundigt undersøgt hos voksne guldfisk, hvor det har vist sig at modtage en bred vifte af excitatoriske, hæmmende og neuromodulatory signaler 1. Vi har været at undersøge M-celleaktivitet i embryonale zebrafisk for at studere aspekter af synaptisk udvikling i et hvirveldyr præparat. I slutningen af 1990'erne udviklede Ali og kolleger en forberedelse til patch clamp optagelse fra M-celler i zebrafisk embryoner, hvor CNS var stort set intakt 2,3,4. Målet var dengang at optage synaptisk aktivitet fra baghjernen neuroner, rygmarvsneuroner og bagagerum skeletmuskulatur samtidig opretholde funktionelle synaptiske forbindelser inden for en intakt hjerne-rygmarv forberedelse.Dette præparat er stadig bruges i vores laboratorium i dag. For at undersøge mekanismerne bag udviklingsmæssige synaptisk plasticitet, registrerer vi excitatory (AMPA og NMDA-medieret) 5,6 og hæmmende (GABA-og glycin) synaptiske strømme fra udviklingslandene M-celler. Vigtigere er det, denne unikke forberedelse giver os mulighed for at vende tilbage til den samme celle (M-celle) fra forberedelse til forberedelse til nøje at undersøge synaptisk plasticitet og neuro-udvikling i et embryo organisme. De af dette præparat fordele omfatter 1) intakte, funktionelle synaptiske forbindelser onto M-celle, 2) relativt billige præparater, 3) et stort udbud af let tilgængelige embryoner 4) evnen til at vende tilbage til den samme celletype (dvs. M- celle) i enhver forberedelse, så synaptisk udvikling på niveau med en enkelt celle kan undersøges fra fisk til fisk, og 5) billeddannelse af hele præparater på grund af den åbne karakter af embryonerne.

Introduction

Et af de udestående spørgsmål i udviklingsmæssige neurobiologi vedrører den rolle synaptisk plasticitet fænomener under synaptisk modning. Vores forskning fokuserer på at forstå plasticitet mekanismer, der ligger til grund for synaptisk udvikling med et overordnet mål om at forstå dyrs adfærd i forbindelse med synaptisk udvikling. For at gøre dette, har vi udviklet en stort set intakt præparat i en organisme (zebrafisk, Danio rerio), som har vundet stor trækkraft til udviklingsmæssige undersøgelser i slutningen af 1990'erne.

Zebrafisken tilbyder flere forskellige fordele for neurologiske undersøgelser. For eksempel er dens genom sekventeret og man kan udføre morpholino knockdowns og zink-finger nuclease knockouts til tavshed genaktivitet og proteinekspression. Man kan også udføre overekspression undersøgelser og transgene linier kan konstrueres 7-9. Embryoner er relativt let og rigelig til at erhverve, ogden åbne karakter af embryo egner sig godt til billedbehandling og opto-genetiske studier. Derudover kan adfærdsanalyse skal udføres, og elektrofysiologiske eksperimenter kan foretages på muskelfibre, rygmarvsneuroner og baghjernen neuroner i stort set intakte organismer, tillader en at undersøge cellulære funktion in vivo. Vigtigere er det, vi er i stand til at undersøge synaptisk aktivitet i ikke bare den samme klasse af cellen, men i meget samme par neuroner, fra forberedelse til forberedelse. Med andre ord, det er et af de sjældne præparater hvirveldyr, hvor man kan vende tilbage til samme neuron in situ at studere dens udvikling.

For at opretholde neuronal kredsløb rentabel som muligt, har vi udviklet et præparat, hvori baghjerne og rygmarven blev efterladt intakt, mens patch fastspænding fra M-celler. I dette præparat, er øjnene, kæben og huden overliggende hjernen fjernes forsigtigt og baghjerne er Peeled væk fra rygstrengen, som giver adgang til den ventrale overflade af baghjernen. De reticulospinal neuroner er placeret nogle få mikrometer dybe og er relativt let tilgængelige. På 48 timer efter befrugtning (HPF, nogle forkortelser er anført i tabel 1) cellerne er elektrisk kompakt og kan man trofast optage synaptisk aktivitet (både stimulerende og hæmmende strømninger), spændingsåbnede strømme og handling potentialer fra dem.

Vores resultater har antydet, at mange aspekter af synaptisk udvikling og modning sker i 24 timer forud for udklækning, og derfor meget af vores opmærksomhed er fokuseret på organismer i alderen fra 24 HPF til 72 HPF. Men ved 72 HPF, M-celler er mindre elektrisk kompakt og er vanskelige at korrekt plads klemme. Teknikken kan anvendes til at optage ikke kun fra M-celler, men også af dens homologer, MiD2 cm og MiD3 cm. Teoretisk kan man også udføre dobbelt optagelser fra et spnelle snor neuron, såsom en primær motor neuron og fra M-cellen, men det er svært og det kan hævdes, at de fordele, der opnås fra sådan en vanskelig teknik ikke kan være værd at den ekstraordinære indsats, der er påkrævet.

Protocol

1.. Forberedelse og Dissection

  1. Forbered dissekere fad foret med Sylgard. Optagelse kamre fra WPI (Sarasota, Florida, USA; Leverandørerne er anført i tabel 2) anvendes som dissekere retter (figur 1). Kamrene er designet til at rumme objektglas og små plastik skiver anvendes som forme til Sylgard. Skiverne først er fastgjort til objektglasset med fedt og flydende Sylgard tilsættes til midten af ​​skiven. Den Sylgard vil kurere natten over og da det gør det, det danner en lille, rund seng på objektglasset, som bliver bunden af ​​dissekere fad. Objektglasset anbringes i optagelsen kammeret og fungerer som bunden af kammeret, hvor præparatet er anbragt (figur 1).
  2. Forbered de løsninger, der er anført i tabel 3. Ekstracellulære løsninger bør stå ved stuetemperatur, mens intracellulære løsninger bør holdes steril. Man kan også tilføje LuCifer gul (0,1%) til det intracellulære løsning, så visualisering af M-cellemorfologi kan udføres ved afslutningen af ​​forsøget. Dette tjener til at bekræfte celle identitet (figur 2).
  3. Hæv vildtype zebrafisk embryoner i æg vand ved 28,5 ° C, og indsamle og scene ifølge Kimmel et al. 10.. For dissektioner overføre embryoner til dissekere fad der også fungerer som optagelsen kammeret. Bedøver for 7-10 min i en bedøve saltopløsning (0,02% tricaine, løsning 1, tabel 3), der nøje tilnærmer fysiologisk saltvand. Man kan bestemme, om de er tilstrækkeligt bedøvet ved at undersøge svaret på en blid hale knivspids.
  4. Nål embryoner gennem notochord og onto Sylgard-foret fad med 0,001 "wolfram tråd (videnskabeligt instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) ved hjælp 25X forstørrelse på et dissektionsmikroskop (Figur 1). Wolfram tråd er nemt at skære itil små segmenter med fine Dissecting saks.
  5. Juster forstørrelsen på dissekere omfang til 40-50X at udføre dissektion. Når fosteret er fastgjort til skålen, kæbe, øjne og forhjernen fjernes med en fin pincet (Dumont # 5).
  6. Baghjerne forsigtigt skrællet væk fra den underliggende notochord ved omhyggeligt arbejde tangen mellem notochord og hjernen. Baghjerne bliver derefter forsigtigt vendes, så den ventrale overflade vender opad. Denne placering giver god adgang til M-celler, som sædvanligvis inden for 5-10 um af den ventrale overflade i unge embryoner og ~ 20-50 um i ældre larver (figur 2A).
  7. Flyt forsigtigt forberedelse til optagelsen setup, hvor plastret clamp forsøget kan udføres. M-celler er visualiseret med Nomarski Differential Interference Contrast (DIC), selv om andre former for billedbehandling (dvs. Hoffman modulation kontrast eller Dodt Gradient kontrast imaging fraLuigs og Neumann, Tyskland) kan også anvendes.

2. Patch Clamp Recording (hel celle tilstand)

  1. Alle optagelser er foretaget i hele celle patch clamp tilstand 11. Optagelse kamre er placeret på et mikroskop etape i en elektrofysiologi setup. Vores faser er faste og den opretstående patch clamp mikroskop er boltet til en bevægelig mikroskop platform eller et mikroskop oversætter.
  2. Patch clamp pipetter er trukket på en vandret aftrækker (P-97 Sutter Instruments Co) fra tyndvægget, borosilikatglas fås fra WPI. Pipettespids diametre er i størrelsesordenen 0,2-0,4 um efter brand polering til en glat kant, og skanken taper er ~ 4 mm i længden.
  3. Fastgør pipetten til forstærkeren head-etape i elektrofysiologi setup. Det er vigtigt at holde hovedet trin på ca 45 ° vinkel i forhold til den vandrette akse, da dette sikrer en indgangsvinkel for pipetten, der er egnet til dannelse af høj modstand tætnings onto Mauthner celle.
  4. Lige før ind badopløsningen anvende en lille mængde af positivt tryk til pipetten for at reducere risikoen for tilsmudsning af spidsen. Når du optager mEPSCs, bad løsninger omfatter 1 pM TTX at blokere virkningspotentialer, 5uM stryknin til at blokere glycinreceptorer og 10 uM bicucullin eller 100 pM picrotoxin at blokere GABAA-receptorer. Når du optager mIPSCs, bad løsninger omfatter 1 pM TTX, kynurensyre og enten bicucullin eller stryknin afhængig receptor aktivitet af interesse.
  5. Approach M-celle med en lille mængde af positivt tryk i pipetten. Den positive tryk skubber forsigtigt cellen fra side til side, og når den er placeret umiddelbart over cellen, danner en lille fordybning på cellemembranen. Lad pipetten i stedet for nogle få sekunder til forsigtigt at rengøre celleoverfladen så at en stærk forsegling mellem pipetten og membranen kan dannes. Frigørelse af positivt tryk i pipettentillader tætningen skal initieres og en lille mængde af undertryk kombineret med negative pipette potentialer resulterer i GigaΩ sæler danner inden for et par sekunder.
  6. Skift den bedrift potentiale på forstærkeren til -60 mV. Briste cellemembranen med en serie af korte pulser sugning. Straks registrere membranpotentialer og minimere kapacitans artefakter. Kompensere celle kapacitans (C m) og adgang (serie) modstand (R a) med 70-85%. R a bør rutinemæssigt overvåges hvert 30. sek til et minut, og hvis der er en ændring på 20% eller mere, afbryde forsøget.
  7. Når eksperimentet er afsluttet og nok data er blevet opnået, præparatet aflivet ved at fjerne baghjerne med en pincet. På dette tidspunkt kan dataanalyse begynde.

Representative Results

I dette manuskript præsenterer vi en metode til patch-clamp-optagelse i hel-celle mode fra reticulospinal neuroner i zebrafisk, især med fokus på M-cellen. Selvfølgelig er det også muligt at registrere andre patch-clamp modes såsom celle-bundet, vrangen ud og uden ud. Den type data, som man kan få er ikke begrænset til, hvad vi har præsenteret her, men vi forsøger at give et eksempel på både synaptisk aktivitet (excitatory og hæmmende) i spænding-clamp-mode såvel som action potentialer i strømtang. Som organismen aldre og M-celler udvikler mere omfattende og udarbejde dendritter, er evnen til at tilstrækkeligt spændingsklemme og rum klemme cellen kompromitteret og strømtangstilbehør tilstand bliver optagelsen af ​​valg.

Figur 3 viser repræsentative optagelser af excitatoriske AMPA og NMDA-receptor-strømme opnået fra 48 HPF embryoner i nærvær af TTX (1 uM) og farmakologiske midler tilblokere GABA og glycinreceptorer. Når M-celler er spænding fastspændt ved -60 mV, synaptiske strømme skyldes aktivering af AMPA-receptorer (figur 3A). Indsamling og analyse af disse begivenheder tillader en at optage parametre såsom stigetid, henfaldstid, amplitude og frekvens. AMPA begivenheder har typisk en hurtig stigetid (20-80% stigning tid på ~ 0,1 ms) og forfald tid (~ 0,5 ms), og udviser en gennemsnitlig amplitude på cirka 25 pA. Når M-celler er fastspændt ved +40 mV, de resulterende ydre strømme skyldes AMPA og NMDA-receptor-aktivitet (figur 3C og 3D). NMDA-receptor-strømme udstille længere tidsforløb end AMPA receptor strømninger, og har brug for at blive optaget på positive potentialer eller Mg-fri løsning til at fjerne Mg blok af NMDA-receptorer 2,6. Den gennemsnitlige mEPSC vist i figur 3D repræsenterer blandede AMPA og NMDA strømme optaget ved +40 mV.

Figur 4 viser repræsentative resultater, når du optager mIPSCs fra Mauthner celler. Disse hændelser i nærvær af TTX (1 uM) og kynurensyre (1 mM) for at blokere AMPA og NMDA-receptorer. Disse begivenheder udviser rimelig hurtig stigning og halveringskinetik ved 48 HPF og er hyppige nok til at erhverve mange af dem i løbet af en 2-3 min optagelse 3. Figur 5 viser virkningspotentialer registreres som følge af intravenøs depolariserende strøm ind i cellen. M-cellerne i 48 HPF embryoner normalt affyre en enkelt handling potentiale (figur 5B), selv om de undertiden fyre flere APs når injiceres med suprathreshold stimuli (figur 5A).

Forkortelse Fulde navn
1.. MPSC Miniature postsynaptiske strøm
2. mEPSC Miniature excitatoriske postsynaptiske strøm
2 mIPSC Miniature hæmmende postsynaptiske strøm
3. MOhm Mega Ohm (enhed af resistens 10 6 Ohm)
4.. GQ Giga Ohm (enhed af resistens 10 9 Ohm)
4.. Mosm Milli osmolær (enhed osmolaritet, 10 -3 osmol)
4.. TTX tetrodotoxin
5.. ATP adenosintriphosphat
6.. GTP guanosintriphosphat
7.. GFP Grønt fluorescerende protein

Tabel 1.

Firma Katalognummer
1.. Dissekere Dish Warner Instruments 64-0291
2. 0.001 "Wolfram Wire Scientific Instruments Services Inc. W406
2 Dissektionsmikroskop Leica Microsystems MZ9.5
3. Pipette Puller Sutter Instruments Co P-97
4.. Microforge Narishige Group MF-900
5.. Upright Patch clamp mikroskop Leica Microsystems DMLFSA
6.. Mikromanipulator Siskiyou Inc. MX7500
7.. Digidata Molecular Devices 1322A
8.. Forstærker Molecular Devices 200B
9.. Erhvervelse software Molecular Devices pClamp9
10.. Axograph X Axograph Axograph X

Tabel 2.

Løsning Name Reagens og koncentration (mM)
1.. Dissekere løsning 134 NaCl, 2,9 KCI, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose og 0,02% tricaine
2. MPSC Ekstracellulær løsning 134 NaCl, 2,9 KCI, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose og 0,001 TTX
3. MPSC Intracellular løsningtion 134 CsCl 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2-ATP, 0,4 Li-GTP
4.. Aktionspotentialet Ekstracellulær opløsning 137 NaCl, 2,9 KCI, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES og 10 Glucose (med 10 pM D-tubocurarin)
5.. Aktionspotentialet Intracellulær opløsning 130 KCI, 2 NaCI, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP og 0,4 Li-GTP.

Tabel 3. Alle ekstracellulære opløsninger justeret til 290 mOsm og pH 7,8. Alle intracellulære opløsninger justeret til 280 mOsm og pH 7,4.

Figur 1
Figur 1. Dissekere skålen og intakt baghjerne-rygmarv forberedelse. (A), kirurgisk og optage parabol fås fra WPI. En tynd skive omhyggeligt forseglet på than objektglas i bunden af skålen, og Sylgard påføres brønden. (B) 48 HPF baghjerne-rygmarv forberedelse. Den ventrale overflade af baghjerne vender opad, og M-cellen er placeret lige under overfladen af ​​vævet på niveau med pilespidsen.

Figur 2
Figur 2. (A) kontrast Nomarski differential interferens billede af en M-celle opnået fra en 2 dpf embryo kort efter udklækning. Billedet blev taget efter optagelse spontan excitatorisk synaptisk aktivitet fra M-cellen. (B) Cellen blev fyldt med Lucifer gult, når eksperimentet. Tilpasset fra 12 med tilladelse.

Figur 3
Figur 3. (A) Spontane AMPA mEPSCs optaget fra en M-celle ved et holdepotentiale på -60 mV. (B) Gennemsnitlige mEPSCs opnået fra optagelsen i (A). (C) Spontan AMPA og NMDA (pilespidser) mEPSCs optaget fra en M-celle på en bedrift potentiale +40 mV. (D) Gennemsnitlige mEPSCs opnået fra optagelsen i (C). Glutamat mEPSCs blev registreret i nærværelse af TTX (1 uM) for at blokere virkningspotentialer, stryknin (5 uM) og picrotoxin (100 uM) for at blokere glycin-og GABA-strømme.

Figur 4
Figur 4.. (A) Spontane mIPSCs optaget fra en M-celle på en bedrift potentiale -60 mV. (B) Gennemsnitlige mEPSCs opnået fra optagelsen i (A). mIPSCs blev registreret i nærværelse af TTX (1 uM) for at blokere virkningspotentialer, kynurensyre (1 mM) for at blokere glutamat receptor aktivitet og bicucullin (10 uM) for at blokere GABA strømme.

nt "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 5
Figur 5.. Action potentialer optaget fra en M-celle. I dette særlige celle en suprathreshold stimulus (0,48 NA) frembragte flere virkningspotentialer (A), men et incitament til tærskel kun resulterer i produktionen af en enkelt handling potentiale (B). (C) Nuværende protokoller for de spor vist i A og B.

Discussion

Den ovenfor beskrevne protokol tillader en at lappe klemme rekord fra M-celler og dens homologer. Teknikken er udfordrende og pleje bør tages på flere nøgleområder hele proceduren. Vi vil nu diskutere nogle af disse områder og vil tilbyde nyttige tips til at sikre succes.

Konstruktion af dissekere / optagelse kammer er et kritisk aspekt af forsøget. M-celler er vanskeligt at se, medmindre kontrast forskellen forstyrrelser, der bruges. Nomarski DIC fungerer bedst med rent dækglas, men vi har fundet, at et meget tyndt lag af Sylgard (~ 1-2 mm) ikke vil forvride DIC i en sådan grad, at det interfererer med identifikation af M-celler. Derfor bruger vi en optagelse kammer, der har en tynd dækglas på bunden, hvorpå der er placeret en lille plastik skive (~ 5 mm i diameter). Vi blander Sylgard 184 i en petriskål, og der tilsættes forsigtigt væsken Sylgard til indersiden af ​​skiven med en Pasteur-pipette. Den Sylgard kan hærdes ved stuetemperatur i løbet af et par dage eller kan opvarmes til hurtig hærdning. Vaskemaskinen kan fjernes efter Sylgard er hærdet, selv om dette ikke er nødvendigt. Når dissektion / optagelse kammer er blevet gjort, kan det bruges i flere uger før en frisk Sylgard-foret objektglas er nødvendig.

Det næste trin i proceduren er at gøre op alle relevante løsninger på dagen for forsøget (tabel 3). Intracellulære opløsninger indeholdende alt, men ATP og GTP er lavet i forvejen og opbevares i 5 ml portioner ved -20 ° C. På dagen for at optage en portion optøs til stuetemperatur og frisk ATP og der tilsættes GTP. Opløsningen indstilles til 280 mOsm og pH 7,4. I vores hænder, finder vi, at tilsætning af frisk ATP og GTP på daglig basis resulterer i gode optagelser. Alle løsninger skal holdes sterilt i den bedste chance for succes.

Intracellulære løsninger skal filtreres througha 0,22 um filter (Sigma) til at fjerne små partikler og snavs, der kan påvirke optagelsen. For at gøre dette, vi først trække den intracellulære opløsning i en 1 ml sprøjte, anbringe filteret til enden af ​​sprøjten, og der tilsættes en plastik pipette tip, der blev opvarmet og trukket til fin spids, til udgangen af ​​filteret. Dette giver os mulighed for at anvende den filtrerede intracellulære løsning direkte på indersiden af ​​glasset patch pipetter.

Når løsninger er forberedt, kan embryoet bedøves og dissekeret. Forud for dissektion, der skal sørges for tilstrækkelig vurdering alder af organismen. Hvert embryon inden en kobling aldre på en lidt anden sats. Derfor, når de vurderer en alder af organismen, er det vigtigt at gøre det i henhold til fastlagte procedurer 10,13, vha. fænotypiske signaler såsom antallet af somitter, den overordnede form af kroppen og tidspunktet for æg befrugtning. Alle dissektioner udføres med en Dumont # 5 fine parpincet. Disse skal være skarpe og i god stand ellers vil det være meget vanskeligt at fjerne huden overliggende baghjerne og enhver bindevæv på den ventrale overflade baghjerne. Vi har ofte nødt til at skærpe pincet efter et par ugers brug, og gør det selv med en slibesten.

At skyde fisk til det tynde lag af Sylgard, bruger vi stifter gammeldags fra fine wolfram tråd 0,001 inches i diameter. Stifterne er skåret med en gammel, mikro-dissektion saks under et dissektionsmikroskop, og er små nok til at passe lige igennem notochord. Pinning embryoner på ethvert andet punkt ikke immobilisere dem og gør dissektioner næsten umuligt at udføre. Når først at lære at udføre de optagelser, kan det være svært at identificere, M-cellen fra dens homologer (især MiD2 cm, som er beliggende i den nærliggende rhombomere - rhombomere 5). I nogle fostre disse to par celler vises ens i størrelse. Den øresten proVide en bekvem vartegn for at hjælpe med identifikationen af ​​M-celler. På 48 HPF M-celler er placeret lige ved siden af ​​øresten, og selvom øresten fjernes under dissektion, de efterlader en lettere beskadiget lateral region baghjerne, der tjener som en markør for deres oprindelige position. Transgene fisk, der udtrykker GFP eller en anden fluorescerende markør i M-cellen, giver gode forberedelser til nye eksperimentatorer. I vores hænder M-celler har en membran kapacitans på ca 18-24 pF ved 48 HPF, mens de mindre homologer er tættere på 12-14 pF. Celler med større overfladeareal har større membran kapacitans værdier (målt i pico farad (PK)) sammenlignet med mindre celler. Således kan membran kapacitans anvendes som en grov indikator for cellestørrelse, hvor større celler har større kapacitansværdier. Denne elektrofysiologisk karakteristik tjener som en anden ejendom, som M-celle kan identificeres ud fra dens homologer. Endelig har vi ofte bruger LuCifer gul i vores optagelse (intracellulære) løsninger, som giver os mulighed for at foretage en fast identifikation af den celletype under efterforskning ved hjælp af fluorescens billeddannelse, når optagelserne er komplette.

Pipettespids modstande i intervallet 3,5-4,5 MOhm er det bedste kompromis mellem spids størrelse og lave adgang modstand, der ligger typisk 8-15 MOhm. Dette er især vigtigt for arrangementer med hurtige kinetik ~ 0,1 msek (20-80%) stigetider og ~ 0,5 msek eksponentiel henfald 12,14,15 (fig. 3A og 3B). Data er erhvervet på en digitalisering på 50-100 kHz og filtreres med et low pass frekvens på 5-10 kHz. Med hensyn til de patch pipetter, har vi fundet, at de ikke behøver at være brand-poleret for at opnå en optagelse, men anekdotisk, det ser ud til at tilbyde lidt bedre chance for at opnå gode forseglinger sammenlignet med upoleret pipetter. Da pipettespidser er forholdsvis store, behøver vi ikke tilføje very meget positivt tryk til pipetten før ind i opløsningen. Det tager praksis valget af en passende mængde af positivt tryk til at anvende som et overskud af tryk vil bevæge cellen for meget, og vil forhindre sæl dannelse. Det kan også skade synaptiske kontakter cellen forsigtigt forskydes fra dens oprindelige position. På den anden side, er alt for lidt pres resulterer i beskidte tips og ikke rengøre overfladen af ​​cellen godt nok til at danne gode sæler. En gylden middelvej kun nås ved en betydelig praksis og erfaringer. Seal dannelse kan forbedres med anvendelse af negative spændinger til pipetten. Vi har typisk forseglinger af 1,2-2 GQ, som er fremragende til gennembrud i hele cellen mode.

Hvornår skal anvendes til cellen cytoplasma farmakologiske midler, vi medtage dem i den intracellulære opløsning før fylde pipetten. Der bør udvises forsigtighed ved udarbejdelsen pipetten løsninger for at undgå tab af agenterved at have det binde til 0,22 um filter. Vi foretage Derfor intracellulære medium først, og derefter tilsættes forsigtigt det farmakologiske middel til den filtrerede opløsning. Anvendelse af forbindelser til det intracellulære rum har sit eget unikke sæt af udfordringer. For eksempel tilsætning af lægemidler til det intracellulære medium normalt mindsker chancerne for at danne en GQ forsegling, men ikke til det punkt, hvor det er en væsentlig hindring for eksperimentet.

Man bør forstå, at anvendelsen af ​​farmakologiske midler på denne måde ikke tillader forsøgslederen til at optage den mest passende kontrol, da midlet har umiddelbar adgang til cellen fra starten af ​​helcelle konfiguration. Derfor, mens vi registrere data i hele denne type eksperiment, skal man være opmærksom på, at den næste bedste kontrol er den intracellulære anvendelse af en inaktiv form af midlet. I mange tilfælde sker dette i form af en varmeinaktiverede forbindelse, et forvrænget peptid or en inaktiv isomer fås fra leverandøren.

Vi erhverver data i form af synaptiske strømme (mPSCs), spændingsåbnede strømme og action potentialer. Miniature strømme kan analyseres af et par fremragende programmer (pClamp, Axograph, etc.), selv om vi foretrækker at bruge Axograph X (John Clements). Axograph X kører på både Windows og Macintosh-platforme og kan bruges til både erhvervelse og analyse af elektrofysiologiske data. mEPCs erhverves ved hjælp af en skabelon af eksperimentatorens valg, fås fra selve optagelsen. Enkelte arrangementer kan analyseres for egenskaber såsom stigetid, amplitude, halv bredde og forfald tid osv. Vi eksporterer regnearket af data til Kaleidagraph (Synergy Software), hvor vi kan producere tal, herunder kopier af hændelser fra den Axograph X.

Et af de mere vanskelige aspekter af forsøget er at afgøre, om optagelsen blev udført godt nok til at levere ren,pålidelige data. For eksempel kan rum-fastspænding problemer opstår, når optagelsen mPSCs fra M-celler, som har store axoner og omfattende dendritiske processer. Når spændingsfikseringsenheden, kan man generelt styre spændingen ved spidsen af pipetten rimeligt godt (især hvis modstanden adgang (R a) er lav), men må ikke have en ordentlig kontrol af membranpotentialet i dendritiske processer eller axoner, der er langt væk fra pipettespidsen. En metode til bestemmelse af, om cellen var ordentligt plads fastspændt er at producere et scatter plot af stigningen tid vs amplituden af ​​mPSCs, der blev optaget. En korrelation mellem data tyder på utilstrækkelig plads fastspænding. Med andre ord, hvis rummet klemme er dårlig derefter mPSCs der opstår tæt på pipetten vil have hurtigere stigetider og større amplituder end begivenheder nogle afstand fra pipetten. Hvis en korrelation eksisterer, så dataene er problematisk og kan ikke bruges.

Et andet aspektaf elektrofysiologiske optagelser, der må løses, er, at af læk strømme. Dette er især tilfældet, når spændingen fastspænding en celle med henblik på at optage spændingsstyrede strømme såsom Na + eller K +-strømme. Når membranpotentialet fraviges hvile, kan optages læk strømme sammen med spændingsstyrede aktivitet. Leak strømme (I L), en kombination af kalium (I K), natrium (jeg Na) og chlorid (I Cl) strøm gennem ikke-spændingsåbnede kanaler tilsløre aktiviteten af interesse og skal trækkes fra optagelsen. Forstærkeren er i stand til at udføre denne funktion online under optagelsen ved at køre det, der typisk kaldes en P / N-protokollen. Under en P / N-protokollen forstærkeren vil køre flere små depolariseringer (eller hyperpolarizations) fra hvile og registrerer den deraf lækstrøm, der opstår. Det er vigtigt at bruge små nok impulser, der ikke aktiverer spændingsafhængige kanaler. Den nuværendes, der opstår i løbet af disse impulser registreres og gennemsnit, således at disse læk strømme kan trækkes fra den spændingsstyret kanal aktivitet.

Endelig er man nødt til at tage hensyn til krydset potentiale, som forekommer ved spidsen af ​​elektroden mellem den intracellulære og ekstracellulære løsninger. Intracellulære og ekstracellulære løsninger er typisk sammensat af forskellige ioner, med forskellige aktiviteter og mobiliteter. Større ioner med lavere mobiliteter vil tilbyde en større modstand til ion bevægelse end mindre, og dette kan resultere i en lille, men signifikant potentiel forskel ved krydset af løsningerne. Denne krydset potentiale skal tages i betragtning ved fastsættelsen af ​​passende spændinger opleves af cellen.

Teknikken præsenteres her, er brugt af vores laboratorium i mange år. Men der er alternative metoder til optagelse fra M-cellen. Mest bemærkelsesværdigt har Joseph Fetcho og kolleger udviklered en glimrende forberedelse, hvor man kan optage fra M-celler i ældre larver (4-5 dage gamle) i en mindre invasiv måde end præsenteret her, hvor M-cellen er nærmede fra ryg overfladen 16.. Vi havde prøvet en lignende teknik, men fandt det lettere at nærme M-celler fra den ventrale side af baghjerne, hvor cellen er tættere på overfladen af hjernen, især i unge fisk (dvs. 24 HPF til 72 HPF). Desuden kan en fremgangsmåde fra den dorsale overflade normalt kræver brug af en transgen linie, der udtrykker en fluorescerende mærke i M-celle, som har potentiale til at indføre yderligere variabler i optagelsen. Dette spørgsmål er ikke til stede, når du bruger vildtype fisk. Men med den teknik, der præsenteres her, er vi begrænset til at studere yngre dyr (24 HPF til 72 HPF). Således hver tilgang har sine fordele og begrænsninger.

Student t-test kan anvendes til at sammenligne to grupper af data, mens en analyse af Variance (ANOVA) kan bruges til at sammenligne flere grupper. Pleje skal tages for at vælge den relevante post-hoc test for parametrisk vs ikke-parametriske data.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC) og den canadiske Foundation for Innovation (CFI) til DWA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting Dish Warner Instruments 64-0291
0.001" Tungsten Wire Scientific Instruments Services Inc. W406
Dissecting microscope Leica Microsystems MZ9.5
Pipette Puller Sutter Instruments Co. P-97
Microforge Narishige Group MF-900
Upright Patch clamp microscope Leica Microsystems DMLFSA
Micromanipulator Siskiyou Inc. MX7500
Digidata Molecular Devices 1322A
Amplifier Molecular Devices 200B
Acquisition software Molecular Devices pClamp9
Axograph X Axograph Axograph X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
  2. Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
  3. Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
  4. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
  5. Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
  6. Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
  7. Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
  8. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
  9. Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
  12. Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
  13. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
  14. Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
  15. Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
  16. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
Patchclamp Optagelser fra embryonale zebrafisk Mauthner Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roy, B., Ali, D. W. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (79), e50551, doi:10.3791/50551 (2013).More

Roy, B., Ali, D. W. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (79), e50551, doi:10.3791/50551 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter