Summary
Nous avons mis au point une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte pour enregistrer et contrôler l'activité électrique via correctif enregistrement de serrage des neurones et d'autres cellules Mauthner réticulospinales dans embryons de poissons zèbres. Ainsi, nous sommes en mesure d'enregistrer les courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs, l'activité des canaux voltage-dépendants et des potentiels d'action des neurones clés dans un embryon en développement.
Abstract
Cellules Mauthner (cellules M) sont de grands neurones réticulo situées dans le cerveau postérieur de poissons téléostéens. Ils sont des neurones clés impliqués dans un comportement caractéristique connue comme la réponse C-démarrer ou échapper qui se produit lorsque l'organisme perçoit une menace. Le M-cellulaire a été étudiée chez le poisson rouge adulte où il a été démontré à recevoir une large gamme de excitateurs, des signaux inhibiteurs et neuromodulateurs 1. Nous avons examiné l'activité M-cellule embryonnaire chez le poisson zèbre pour étudier les aspects du développement synaptique dans une préparation de vertébrés. À la fin des années 1990 Ali et ses collègues ont développé une préparation pour l'enregistrement patch clamp de cellules M dans embryons de poissons zèbres, dans lequel le CNS était 2,3,4 en grande partie intact. L'objectif à l'époque était d'enregistrer l'activité synaptique des neurones du cerveau postérieur, les neurones de la moelle épinière et le tronc muscle squelettique, tout en maintenant des connexions synaptiques fonctionnelles au sein d'une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte.Cette préparation est encore utilisée dans notre laboratoire aujourd'hui. Pour examiner les mécanismes de la plasticité synaptique sous-jacente de développement, nous enregistrons excitateur (AMPA et NMDA médiation) 5,6 et inhibiteurs (GABA et glycine) courants synaptiques de développer les cellules M. Surtout, cette préparation unique nous permet de revenir à la même cellule (M-cellule) de la préparation à la préparation d'examiner attentivement la plasticité synaptique et neuro-développement dans un organisme embryonnaire. Les avantages offerts par cette préparation comprennent: 1) intact, les connexions synaptiques fonctionnelles sur le M-cellulaire, 2) les préparations relativement bon marché, 3) une grande quantité d'embryons facilement disponibles 4) la capacité de retourner au même type de cellule (c. M- cellule) dans chaque préparation, afin que le développement synaptique au niveau d'une cellule individuelle peut être examiné à partir de poissons à pêcher, et 5) l'imagerie des préparations entières en raison de la nature transparente des embryons.
Introduction
L'une des questions en suspens dans la neurobiologie du développement se rapporte au rôle des phénomènes de plasticité synaptique lors de la maturation synaptique. Notre recherche se concentre sur la compréhension des mécanismes de plasticité synaptique qui sous-tendent le développement avec un objectif global de la compréhension du comportement des animaux dans le contexte du développement synaptique. Pour ce faire, nous avons développé une préparation en grande partie intacte dans un organisme (le poisson zèbre, Danio rerio) qui a pris de l'ampleur considérable des études sur le développement à la fin des années 1990.
Le poisson zèbre offre plusieurs avantages distincts pour les études sur le développement neurologique. Par exemple, son génome est séquencé et l'on peut effectuer passes rabattues morpholino et KO nucléases à doigts de zinc pour réduire au silence l'activité des gènes et l'expression des protéines. On peut également effectuer des études de surexpression et lignées transgéniques peut être construit 7-9. Les embryons sont relativement faciles et abondantes à acquérir, etle caractère transparent de l'embryon se prête bien à des études d'imagerie et opto-génétique. En outre, l'analyse comportementale peut être effectuée, et les expériences électrophysiologiques peut être réalisée sur les fibres musculaires, les neurones de la moelle épinière et du cerveau postérieur neurones dans les organismes en grande partie intacts, permettant un pour examiner la fonction cellulaire in vivo. Surtout, nous sommes en mesure d'examiner l'activité synaptique dans non seulement la même classe de la cellule, mais dans la même paire de neurones, de la préparation à la préparation. En d'autres termes, il s'agit d'un des rares préparations de vertébrés dans lequel on peut retrouver le même neurone, in situ, d'étudier son développement.
Afin de maintenir circuits neuronaux aussi viable que possible, nous avons développé une préparation dans laquelle le cerveau postérieur et de la moelle épinière ont été laissés intacts, tandis que patch clamp des cellules M. Dans cette préparation, les yeux, la mâchoire et la peau recouvrant le cerveau sont éliminées en douceur et le cerveau postérieur est peeled loin de la notochorde, permettant l'accès à la surface ventrale du cerveau postérieur. Les neurones réticulo sont situés à quelques micromètres de profondeur et sont relativement faciles d'accès. À 48 heures après la fécondation (HPF; certaines abréviations sont énumérées dans le tableau 1), les cellules sont électriquement compact et on peut enregistrer fidèlement l'activité synaptique (à la fois excitateurs et inhibiteurs courants), les courants de voltage-dépendants et des potentiels d'action de leur part.
Nos résultats suggèrent que de nombreux aspects du développement synaptique et la maturation se produisent dans le 24 heures avant l'éclosion, et donc beaucoup de notre attention est centrée sur les organismes âgés de 24 à 72 HPF HPF. Cependant, par 72 hpf, les cellules M sont moins compact électriquement et sont difficiles à bien l'espace de serrage. La technique peut être utilisée pour enregistrer non seulement les cellules M, mais aussi de ses homologues, MID2 cm et MiD3 cm. Théoriquement, on peut également effectuer des enregistrements doubles, d'un spneurone cordon inal comme un neurone moteur primaire et du M-cellule, mais cela est difficile et on pourrait faire valoir que les avantages tirés de cette technique difficile peut-être pas en valeur l'effort extraordinaire qui est nécessaire.
Protocol
Une. Préparation et dissection
- Préparer le plat de dissection bordée de Sylgard. Enregistrement chambres de WPI (Sarasota, Floride, États-Unis, les fournisseurs sont énumérés dans le tableau 2) sont utilisés comme disséquer plats (figure 1). Les chambres sont conçues pour accueillir des lames de verre et de petites rondelles de plastique sont utilisés comme moules pour le Sylgard. Les rondelles sont d'abord fixées sur la lame avec la graisse et Sylgard liquide est ajouté à l'axe de la rondelle. Le Sylgard va guérir du jour au lendemain et comme il le fait, il forme un petit lit circulaire sur la lame de verre, qui devient la base de la boîte de dissection. La lame est placée dans la chambre d'enregistrement et sert de base de la chambre dans laquelle la préparation est fixée (figure 1).
- Préparer les solutions énumérées dans le tableau 3. Solutions extracellulaires doivent être laissées à la température ambiante alors que les solutions intracellulaires doivent être conservés stérile. On peut également ajouter Lucifer jaune (0,1%) à la solution intracellulaire de telle sorte que la visualisation de la morphologie des cellules M peut être réalisée à la fin de l'expérience. Ceci permet de confirmer l'identité des cellules (figure 2).
- Levez sauvages embryons de poisson zèbre de type dans l'eau d'œuf à 28,5 ° C, et de recueillir et stade selon Kimmel et al. 10. Pour les dissections, transfert d'embryons à la dissection plat qui sert aussi de chambre d'enregistrement. Anesthésier pour 7-10 min dans une solution de sel d'anesthésier (0,02% de tricaïne; solution 1, tableau 3) qui se rapproche étroitement de la solution saline physiologique. On peut déterminer s'ils sont suffisamment anesthésiés par l'examen de la réponse à un pincement de la queue douce.
- Epingler les embryons par la notochorde et sur le plat Sylgard bordée de 0,001 "fil de tungstène (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) en utilisant un grossissement 25X sur un microscope à dissection (figure 1). Le fil de tungstène est facilement coupé dansà petits segments avec des ciseaux fins de dissection.
- Réglez l'agrandissement sur la portée de dissection à 40 50X pour effectuer la dissection. Une fois l'embryon est tombé à plat, la mâchoire, les yeux et le cerveau antérieur sont éliminées à l'aide d'une belle paire de pinces (Dumont # 5).
- Le cerveau postérieur est légèrement décollée de la notocorde sous-jacente, en travaillant avec soin la pince entre la notochorde et le cerveau. Le cerveau postérieur est ensuite retourné doucement de sorte que la face ventrale vers le haut. Ce positionnement offre un bon accès aux cellules M, qui sont généralement dans les 5-10 pm de la surface ventrale chez les jeunes embryons et ~ 20-50 um dans les larves plus âgées (figure 2A).
- Déplacez doucement la préparation à la configuration de l'enregistrement où l'expérience de patch-clamp peut être effectuée. Les cellules M sont visualisées avec Nomarski interférence différentielle (DIC), bien que d'autres modes de prise de vue (c.-à-Hoffman modulation de contraste ou Dodt Gradient imagerie de contraste deLuigs et Neumann, Allemagne) peuvent également être utilisés.
2. Patch Clamp enregistrement (mode cellulaire total)
- Tous les enregistrements sont réalisés dans l'ensemble du mode de correction des cellules de serrage 11. Chambres d'enregistrement sont placés sur une platine de microscope dans une configuration d'électrophysiologie. Nos étapes sont fixées en position verticale et le patch clamp microscope est boulonné sur une plate-forme de microscope mobile ou un traducteur de microscope.
- Pipettes de patch-clamp sont tirés sur un extracteur horizontal (P-97; Sutter Instruments Co.) de paroi mince, verre borosilicate obtenu de WPI. diamètres de pointe de la pipette sont de l'ordre de 0,2-0,4 um après polissage au feu à un bord lisse, et le cône de queue est ~ 4 mm de longueur.
- Fixez la pipette à la tête étage amplificateur dans la configuration de l'électrophysiologie. Il est important de garder la tête au-stade plus ou moins 45 ° d'angle de l'axe horizontal comme cela assure un angle d'entrée de la pipette qui est approprié pour la formation de joint d'étanchéité haute résistances sur la cellule Mauthner.
- Juste avant d'entrer la solution de bain, appliquez une petite quantité de pression positive à la pipette pour réduire le risque de salir le bout. Lors de l'enregistrement mEPSCs, des solutions de bain comprennent 1 uM TTX pour bloquer les potentiels d'action, 5 uM strychnine pour bloquer les récepteurs de la glycine et 10 uM bicuculline ou 100 uM Picrotoxine pour bloquer les récepteurs GABA A. Lors de l'enregistrement mIPSCs, des solutions de bain comprennent 1 uM TTX, acide kynurénique et soit bicuculline ou la strychnine en fonction de l'activité du récepteur d'intérêt.
- Approcher le M-cellule avec une petite quantité de pression positive dans la pipette. La pression positive pousse doucement la cellule de gauche à droite et quand il est positionné immédiatement au-dessus de la cellule, forme une petite bosse sur la membrane cellulaire. Laisser la pipette en place pendant quelques secondes pour nettoyer délicatement la surface de la cellule de sorte qu'une forte étanchéité entre la pipette et la membrane peut être formé. Le relâchement de la pression positive dans la pipettepermet au joint d'étanchéité à être initié et une petite quantité de pression négative couplée à des potentiels négatifs de la pipette se traduit par des joints GigaΩ formant l'espace de quelques secondes.
- Changer le potentiel de maintien de l'amplificateur à -60 mV. Rompre la membrane cellulaire par une série de courtes impulsions d'aspiration. Immédiatement enregistrer des potentiels membranaires et de minimiser les artefacts de capacitance. Compenser la capacité de la cellule (C m) et l'accès (série) résistance (R a) de 70 à 85%. R un devrait être surveillés de façon systématique, toutes les 30 secondes à une minute, et si il ya un changement de 20% ou plus, avorter l'expérience.
- Une fois que l'essai est terminé et que suffisamment de données ont été acquises, la préparation est sacrifié par élimination du cerveau postérieur avec une paire de forceps. À ce stade, l'analyse des données peut commencer.
Representative Results
Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode pour l'enregistrement de patch-clamp en mode cellule entière de neurones réticulo chez le poisson zèbre, en particulier en mettant l'accent sur le M-cellule. Bien sûr, il est également possible d'enregistrer dans d'autres modes tels que la cellule attachée, à l'intérieur et à l'extérieur hors-out patch clamp. Le type de données que l'on peut obtenir ne se limite pas à ce que nous avons présenté ici, mais nous essayons de donner un exemple à la fois de l'activité synaptique (excitateur et inhibiteur) en mode voltage-clamp ainsi que les potentiels d'action en pince de courant. Avec le vieillissement de l'organisme et les cellules se développent M dendrites plus étendus et complexes, la capacité à la tension adéquate de serrage et serrer l'espace cellulaire est compromise et le mode de blocage de courant devient l'enregistrement des choix.
La figure 3 montre des enregistrements représentatifs des courants excitateurs du récepteur AMPA et NMDA obtenues à partir d'embryons de 48 hpf en présence de TTX (1 pM) et des agents pharmacologiques àbloquer GABA et la glycine des récepteurs. Lorsque les cellules M-tension sont serrés à -60 mV, les courants synaptiques sont dues à l'activation des récepteurs AMPA (figure 3A). Acquisition et analyse de ces événements permet d'enregistrer des paramètres tels que le temps de montée, temps de descente, l'amplitude et la fréquence. Événements AMPA ont généralement un temps de montée rapide (20-80% du temps de montée de ~ 0,1 ms) et le temps de décroissance (~ 0,5 ms), et présentent une amplitude moyenne d'environ 25 pA. Lorsque les cellules M sont serrés à 40 mV, les courants sortants qui en résultent sont en raison de l'AMPA et NMDA l'activité du récepteur (figures 3C et 3D). Courants des récepteurs NMDA présentent des cours de plus longues périodes que les courants des récepteurs AMPA, et doivent être enregistrées à des potentiels positifs ou en solution de Mg-libre pour enlever le bloc Mg de la NMDA récepteurs 2,6. Le mEPSC moyenne de la figure 3D représente courants AMPA et NMDA mixtes enregistrées à 40 mV.
Figure 4 montre des résultats représentatifs lors de l'enregistrement à partir de cellules mIPSCs Mauthner. Ces événements ont eu lieu en présence de TTX (1 pM) et l'acide kynurénique (1 mM) pour bloquer les récepteurs AMPA et NMDA. Ces événements présentent hausse assez rapide et cinétique de décroissance de 48 HPF et sont assez fréquentes pour acquérir beaucoup d'entre eux sur un enregistrement min 3 2-3. Figure 5 montre les potentiels d'action enregistrés à la suite de l'injection de courant de dépolarisation dans la cellule. M-cellules de 48 HPF embryons feu généralement un potentiel d'action unique (figure 5B), mais ils tirent parfois plusieurs points d'accès lorsqu'ils sont injectés à des stimuli supraliminaires (figure 5A).
| Abréviation | Nom et prénom | |
| Une. | MPSC | Courant post-synaptique miniature |
| 2. | mEPSC | Miniature courant post-synaptique excitateur |
| 2 | mIPSC | Miniature courant post-synaptique inhibitrice |
| 3. | MQ | Mega Ohm (unité de résistance; 10 6 Ohm) |
| 4. | GQ | Giga Ohm (unité de résistance; 10 9 Ohm) |
| 4. | MOsM | Milli osmolaire (unité de l'osmolarité; 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | tétrodotoxine |
| 5. | ATP | adénosine triphosphate |
| 6. | GTP | guanosine triphosphate |
| 7. | GFP | La protéine fluorescente verte |
Tableau 1.
| Entreprise | Numéro de catalogue | | |
| Une. | Dissection vaisselle | Warner Instruments | 64-0291 |
| 2. | 0.001 "Fil de tungstène | Instruments scientifiques Services Inc. | W406 |
| 2 | Loupe binoculaire | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| 3. | Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige Groupe | MF-900 |
| 5. | Montant patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA |
| 6. | Micromanipulateur | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| 7. | Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| 8. | Amplificateur | Molecular Devices | 200B |
| 9. | Logiciel d'acquisition | Molecular Devices | pClamp9 |
| 10. | Axograph X | Axograph | Axograph X |
Tableau 2.
| Nom de la solution | Réactif et concentration (mM) | |
| Une. | Solution dissection | 134 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose et 0,02% Tricaine |
| 2. | MPSC solution extracellulaire | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose et 0,001 TTX |
| 3. | MPSC intracellulaire solutiontion | 134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2 ATP, 0,4 Li-GTP |
| 4. | Action solution extracellulaire potentiel | 137 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES et 10 glucose (avec 10 uM D-tubocurarine) |
| 5. | Action solution intracellulaire potentiel | 130 KCl, NaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP et 0,4 Li-GTP. |
Tableau 3. Toutes les solutions extracellulaires sont ajustées à 290 mOsm et pH 7,8. Toutes les solutions intracellulaires sont ajustées à 280 mOsm et pH 7,4.
Figure 1. Dissection plat et intact préparation de cordon hindbrain-spinal. (A) à disséquer et à l'enregistrement plat obtenu de WPI. Une rondelle mince est soigneusement scellé sur til lame de verre au fond de la boîte et Sylgard est appliquée sur le puits. (B) 48 hpf rhombencéphale-spinal préparation de cordon. La surface ventrale du cerveau postérieur est orientée vers le haut et le M-cellule se trouve juste en dessous de la surface du tissu au niveau de la pointe de flèche.
Figure 2. (A) l'image de contraste d'interférence différentielle de Nomarski d'un M-cellulaire obtenue à partir d'un embryon de 2 dpf peu après l'éclosion. L'image a été prise après enregistrement de l'activité synaptique excitatrice spontanée de la M-cellule. (B) La cellule a été remplie avec Lucifer jaune pendant l'expérience. Adapté de 12 avec la permission.
Figure 3. (A) mEPSCs AMPA spontanées enregistrées à partir d'un M-cellule à un potentiel de maintien de -60 mV. (B) mEPSCs moyennes obtenues à partir de l'enregistrement en (A). (C) spontanée AMPA et NMDA (pointes de flèches) mEPSCs enregistrées à partir d'un M-cellule à un potentiel de maintien de 40 mV. (D) mEPSCs moyennes obtenues à partir de l'enregistrement en (C). mEPSCs du glutamate ont été enregistrés dans la présence de TTX (1 uM) pour bloquer des potentiels d'action, la strychnine (5 M) et PTX (100 M) pour bloquer la glycine et GABA courants.
Figure 4. (A) mIPSCs spontanées enregistrées à partir d'un M-cellule à un potentiel de maintien de -60 mV. (B) mEPSCs moyennes obtenues à partir de l'enregistrement à (A). mIPSCs ont été enregistrés dans la présence de TTX (1 uM) pour bloquer des potentiels d'action, l'acide kynurénique (1 mm) pour bloquer l'activité des récepteurs du glutamate et bicuculline (10 M) pour bloquer les courants de GABA.
Figure 5. Potentiels d'action enregistrés à partir d'un M-cellule. Dans cette cellule un stimulus supraliminaire (0,48 nA) a suscité plusieurs potentiels d'action (A), mais une incitation à seuil résultats seulement dans la production d'un potentiel d'action unique (B). (C) Les protocoles actuels pour les tracés affichés dans A et B.
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus permet de patcher dossier de serrage des cellules M et ses homologues. La technique est difficile et il faut prendre soin dans plusieurs domaines clés tout au long de la procédure. Nous allons maintenant discuter de certains de ces domaines et offrira des conseils utiles pour assurer le succès.
La construction de la chambre de dissection / d'enregistrement est un aspect critique de l'expérience. Les cellules M sont difficiles à voir, sauf si le contraste d'interférence différentiel est utilisé. DIC Nomarski fonctionne mieux avec des lamelles de verre propre, mais nous avons trouvé qu'une très fine couche de Sylgard (~ 1-2 mm) ne sera pas fausser le DIC à un point tel que cela interfère avec l'identification des cellules M. Par conséquent, on utilise une chambre d'enregistrement qui a une mince lamelle de verre sur la partie inférieure sur laquelle est placée une petite rondelle de plastique (~ de 5 mm de diamètre). Nous mélangeons Sylgard 184 dans une boîte de Pétri et ajoute soigneusement le Sylgard de liquide à l'intérieur de la rondelle avec une pipette Pasteur. Le Sylgard peut être durcie à la température ambiante pendant quelques jours, ou peut être chauffé pour un durcissement rapide. La rondelle peut être éliminé après la Sylgard a durci, même si cela n'est pas nécessaire. Une fois la chambre dissection / enregistrement a été fait, il peut être utilisé pendant plusieurs semaines avant une lame de verre de Sylgard bordée frais est nécessaire.
L'étape suivante de la procédure consiste à compenser toutes les solutions pertinentes sur le jour de l'expérience (tableau 3). Solutions intracellulaires contenant tout, mais l'ATP et GTP sont faites à l'avance et stockées dans 5 ml aliquotes à -20 ° C. Le jour de l'enregistrement d'un aliquot est décongelé à température ambiante et de l'ATP frais et GTP est ajouté. La solution est ajusté à 280 mOsm et pH 7,4. Dans nos mains, nous constatons que plus d'ATP et GTP frais sur un résultat de base par jour dans de bons enregistrements. Toutes les solutions doivent être conservés stérile pour la meilleure chance de succès.
Solutions intracellulaires doivent être filtrés Througha 0,22 um filtre (Sigma) pour éliminer les petites particules et de débris qui pourraient affecter l'enregistrement. Pour ce faire, nous attirons d'abord la solution intracellulaire dans une seringue de 1 ml, apposer le filtre à l'extrémité de la seringue et ajouter une pointe de pipette en plastique qui a été chauffé et tiré à pointe fine, à la fin du filtre. Cela nous permet d'appliquer la solution intracellulaire filtrée directement à l'intérieur des pipettes de patch de verre.
Une fois que les solutions sont préparées, l'embryon peut être anesthésiés et disséqués. Avant la dissection, il faut prendre soin de bien évaluer l'âge de l'organisme. Chaque embryon dans un âge d'embrayage à un rythme légèrement différent. Par conséquent, lors de l'évaluation de l'âge de l'organisme, il est important de le faire selon les procédures établies 10,13, à l'aide de signaux phénotypiques tels que le nombre de somites, la forme globale du corps et le moment de la fécondation de l'œuf. Tous les dissections sont réalisées avec un # 5 belle paire de Dumontforceps. Celles-ci doivent être forte et en bonne condition de travail sinon il sera très difficile d'enlever la peau recouvrant le cerveau postérieur et tout le tissu conjonctif sur la face ventrale du cerveau postérieur. Nous avons souvent pour aiguiser les pinces après quelques semaines d'utilisation, et le faire nous-mêmes avec une pierre à aiguiser.
Pour épingler le poisson à la mince couche de Sylgard, nous utilisons les repères fabriqués à partir de fil fin de tungstène 0,001 pouces de diamètre. Les broches sont coupés avec un vieux, ciseaux micro-dissection au microscope de dissection, et sont suffisamment petits pour tenir tout au long de la notochorde. Épingler les embryons à un autre point ne les immobiliser et ne fait dissections presque impossible à réaliser. Lors de l'apprentissage d'abord pour effectuer les enregistrements, il peut être difficile pour l'identité de la M-cellulaire de ses homologues (notamment MID2 cm, qui est situé dans le rhombomère voisin - rhombomère 5). Dans certains embryons ces deux paires de cellules apparaissent de taille similaire. Le otolithes proVide un point de repère idéal pour aider à l'identification des cellules M. À 48 HPF les cellules M sont situés juste à côté des otolithes, et même si les otolithes sont supprimés lors de la dissection, ils laissent derrière eux une région latérale légèrement endommagé du cerveau postérieur, qui sert de marqueur pour leur position d'origine. Les poissons transgéniques qui expriment la GFP ou un autre marqueur fluorescent dans le M-cellule, offrent d'excellentes préparations pour les nouveaux expérimentateurs. Dans nos mains les cellules M ont une capacité de membrane d'environ 18-24 pF à 48 HPF, tandis que les plus homologues sont plus proches de 12-14 pF. Les cellules avec une plus grande aire de surface ont de plus grandes valeurs de capacité de la membrane (mesurée en pico farads (PF)) par rapport à des cellules plus petites. Ainsi, la capacité de la membrane peut être utilisée comme indicateur brut de la taille des cellules, où des cellules plus grandes ont des valeurs de capacitance plus larges. Cette caractéristique électrophysiologique sert une autre propriété par laquelle le M-cellule peut être identifié à partir de ses homologues. Enfin, nous utilisons souvent Lucifer jaune dans notre enregistrement (intracellulaires) des solutions, ce qui nous permet de procéder à une identification entreprise du type cellulaire à l'étude utilisant l'imagerie par fluorescence une fois les enregistrements sont complets.
résistances de pointe de la pipette dans la gamme de 3,5-4,5 MQ sont le meilleur compromis entre la taille de la pointe et faible résistance d'accès, qui varie généralement de 8 à 15 MQ. Ceci est particulièrement important pour les événements avec une cinétique rapide; ~ 0,1 ms (20-80%) temps de montée et ~ 0,5 ms exponentielle désintégrations 12,14,15 (figures 3A et 3B). Les données sont acquises à une vitesse de 50 à 100 kHz de la numérisation et filtré avec un passe-bas de fréquence de 5 à 10 KHz. En ce qui concerne les pipettes de patch, nous avons constaté qu'ils n'ont pas besoin d'être d'obtenir un enregistrement poli-le-feu, mais de façon anecdotique, il semble offrir un peu plus de chances d'obtenir de bons joints rapport avec des pipettes non polis. Depuis les embouts de pipette sont relativement grandes, nous n'ajoutons pas very pression beaucoup de positif à la pipette avant d'entrer dans la solution. Il faut de la pratique de décider de la quantité appropriée de pression positive à appliquer comme un excès de pression se déplace la cellule trop, et éviter la formation de joint. Il peut également endommager les contacts synaptiques que la cellule est déplacée doucement de sa position d'origine. D'autre part, trop peu de résultats de pression dans des conseils sales et ne pas nettoyer la surface de la cellule assez bien pour former de bons joints. Un juste milieu n'est atteinte par la pratique et une expérience significative. la formation de joint peut être améliorée avec des applications de tensions négatives à la pipette. Nous avons généralement des joints de 1.2-2 GQ, qui sont excellents pour les percées dans le mode de cellules entières.
Lorsque des agents pharmacologiques doivent être appliqués dans le cytoplasme des cellules, on les inclure dans la solution intracellulaire avant le remplissage de la pipette. Des précautions doivent être prises lors de la préparation des solutions de pipette pour éviter la perte des agentsen le faisant se lier au filtre de 0,22 um. Par conséquent, nous filtrons le milieu intracellulaire d'abord, puis ajoute soigneusement l'agent pharmacologique à la solution filtrée. Application des composés vers le compartiment intracellulaire a son propre ensemble unique de défis. Par exemple, l'addition de la drogue dans le milieu intracellulaire réduit habituellement les chances de former un joint de GQ, mais pas au point où il est un obstacle majeur à l'expérience.
On devrait se rendre compte que l'application d'agents pharmacologiques de cette façon ne permet pas à l'expérimentateur d'enregistrer le contrôle le plus approprié étant donné que l'agent a un accès immédiat à la cellule à partir du début de la configuration de cellules entières. Par conséquent, alors que nous enregistrons des données tout au long de ce type d'expérience, il faut être conscient que la meilleure commande est l'application intracellulaire d'une forme inactive de l'agent. Dans de nombreux cas, cela prend la forme d'un composé inactivé par la chaleur, un peptide brouillé or un isomère inactif obtenu auprès du fournisseur.
Nous acquérons des données sous la forme de courants synaptiques (de mPSC), les courants de voltage-dépendants et des potentiels d'action. Courants miniatures peuvent être analysés par quelques excellents programmes (pClamp, Axograph, etc), bien que nous préférons utiliser Axograph X (John Clements). Axograph X fonctionne sur les plates-formes Windows et Macintosh et peut être utilisé à la fois pour l'acquisition et l'analyse des données électrophysiologiques. mEPCs sont acquises à l'aide d'un modèle de choix de l'expérimentateur, obtenu à partir de l'enregistrement lui-même. Événements individuels peuvent être analysés pour des propriétés telles que le temps de montée, amplitude, demi-largeur et le temps de descente, etc Nous exportons la feuille de calcul des données de Kaleidagraph (Synergy Software) où nous pouvons produire des chiffres, y compris les copies de traces d'événements de Axograph X.
Un des aspects les plus difficiles de l'expérience est de déterminer si l'enregistrement a été effectué assez bien pour fournir une énergie propre,données fiables. Par exemple, les questions de serrage spatiales peuvent survenir lors de l'enregistrement mPSC de cellules M qui ont de grandes axones et de vastes processus dendritiques. Lorsque la tension de serrage, on peut généralement contrôler la tension au niveau de la pointe de la pipette raisonnablement bien (surtout si la résistance d'accès (R a) est faible), mais peuvent ne pas avoir le contrôle approprié du potentiel de membrane dans les procédés dendritiques ou des axones qui sont beaucoup l'écart de la pointe de pipette. Une méthode de déterminer si la cellule était bien serrée espace est de produire un diagramme de dispersion des temps de montée vs l'amplitude des mPSC qui ont été enregistrés. Une corrélation entre les données est suggestive de serrage insuffisant de l'espace. En d'autres termes, si la pince de l'espace est pauvre alors mPSC qui se produisent près de la pipette devront rapidement s'élever temps et des amplitudes plus importantes que les événements survenus à une certaine distance de la pipette. S'il existe une corrélation, puis les données est problématique et ne peut pas être utilisé.
Un autre aspectdes enregistrements électrophysiologiques qui doit être abordée est celle des courants de fuite. Cela est particulièrement vrai lorsque la tension de serrage dans une cellule afin d'enregistrer les courants de voltage-dépendants, tels que Na + ou K + des courants. Lorsque le potentiel de membrane est écartée de repos, les courants de fuite peuvent être enregistrées en même temps que l'activité de voltage-dépendant. courants de fuite (I L), une combinaison de potassium (I K), sodium (I Na) et chlorure (I Cl) courant à travers-non voltage-dépendants canaux seront occulter l'activité d'intérêt et doivent être soustraites de l'enregistrement. L'amplificateur est capable de remplir cette fonction en ligne lors de l'enregistrement en exécutant ce qui est généralement appelé un protocole P / N. Pendant un protocole P / N, l'amplificateur de fonctionner plusieurs petites dépolarisations (ou hyperpolarisations) de repos et enregistrer le courant de fuite qui se produit résultant. Il est important d'utiliser suffisamment petites impulsions qui n'activent pas les canaux voltage-dépendants. Le courants qui se produisent au cours de ces impulsions sont enregistrées et calculées de telle façon que ces courants de fuite peuvent être soustraites de l'activité des canaux voltage-dépendants.
Enfin, il faut tenir compte du potentiel de jonction, qui se produit à la pointe de l'électrode entre le intracellulaires et extracellulaires solutions. Solutions intracellulaires et extracellulaires sont typiquement composés d'ions différents, avec des activités et des mobilités différentes. Grandes ions à mobilités inférieures offriront une plus grande résistivité de mouvement des ions que les plus petits, ce qui peut entraîner une légère mais significative différence de potentiel à la jonction des solutions. Ce potentiel de jonction doit être prise en compte lors de la détermination des tensions appropriées subies par la cellule.
La technique présentée ici est celui utilisé par notre laboratoire pendant de nombreuses années. Cependant, il existe d'autres méthodes d'enregistrement de la M-cellule. Plus particulièrement, Joseph Fetcho et ses collègues ont développered une excellente préparation dans lequel on peut enregistrer des cellules M de larves plus âgées (4-5 jours) d'une manière moins invasive que présenté ici, où le M-cellulaire est abordée à partir de la surface dorsale 16. Nous avions essayé une technique similaire, mais plus de facilité à aborder le M-cellule de la face ventrale du cerveau postérieur, où la cellule est plus proche de la surface du cerveau, en particulier chez les jeunes poissons (soit 24 à 72 HPF HPF). En outre, une approche à partir de la surface dorsale exige habituellement l'utilisation d'une lignée transgénique qui exprime un marqueur fluorescent dans le M-cellule, qui a le potentiel d'introduire des variables supplémentaires dans l'enregistrement. Ce problème n'est pas présent lors de l'utilisation de type de poissons sauvages. Cependant, avec la technique présentée ici, nous sommes limités à l'étude des animaux plus jeunes (24 à 72 HPF HPF). Ainsi, chaque méthode a ses avantages et ses limites.
Test t de Student peut être utilisé pour comparer les deux groupes de données tandis que l'analyse de variance (ANOVA) peut être utilisé pour comparer des groupes multiples. Il faut prendre soin de choisir le test post-hoc approprié pour paramétrique vs données non paramétriques.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et de la Fondation canadienne pour l'innovation (FCI), pour DWA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
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