Summary
Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.
Abstract
Mauthner-Zellen (M-Zellen) sind große retikulospinale Neuronen im Hinterhirn der Knochenfische entfernt. Sie sind der Schlüssel-Neuronen in einem charakteristischen Verhalten wie die C-Start-oder Fluchtreaktion, wenn der Organismus eine Bedrohung wahrnimmt, tritt bekannten beteiligt. Die M-Zelle wurde umfassend in der Erwachsenengoldfisch, wo gezeigt wurde, um eine breite Palette von erregenden, hemmende und neuromodulatorischen Signale 1 erhalten sucht. Wir haben die Prüfung M-Zell-Aktivität in embryonalen Zebrafisch, um Aspekte der synaptischen bei einem Wirbeltier Vorbereitung studieren. In den späten 1990er Jahren Ali und Kollegen entwickelten eine Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufnahme von M-Zellen in Zebrafischembryonen, in denen das ZNS war weitgehend intakt 2,3,4. Das Ziel damals war es, synaptische Aktivität aufzeichnen von Hinterhirn-Neuronen, Nervenzellen des Rückenmarks und des Rumpfes Skelettmuskel und gleichzeitig funktionale synaptischen Verbindungen innerhalb einer intakten Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung.Diese Vorbereitung ist immer noch in unserem Labor heute verwendet. Um die zugrunde liegenden Mechanismen der synaptischen Plastizität Entwicklungs untersuchen, notieren wir erregenden (AMPA und NMDA-vermittelte) 5,6 und hemmenden (GABA und Glycin) synaptischen Ströme aus Entwicklungs M-Zellen. Wichtig ist, ermöglicht diese einzigartige Vorbereitung uns, auf der gleichen Zelle (M-Zellen) von der Vorbereitung bis Vorbereitung zurück, sorgfältig zu prüfen synaptische Plastizität und neuro-Entwicklung in einem embryonalen Organismus. Die Vorteile dieser Vorbereitung vorgesehen sind 1) intakt ist, funktionelle synaptische Verbindungen auf den M-Zellen, 2) relativ kostengünstige Präparate, 3) ein großes Angebot an leicht verfügbaren Embryonen 4) die Fähigkeit, auf den gleichen Zelltyp zurück (dh M- Zelle) in jedem Präparat, so daß die synaptische Entwicklung auf der Ebene einer einzelnen Zelle aus Fisch Fischsucht werden, und 5) Abbildungsvoll Zubereitungen wegen der Transparenz des Embryos.
Introduction
Eine der offenen Fragen in der Entwicklungsneurobiologie bezieht sich auf die Rolle der synaptischen Plastizität Phänomene während der synaptischen Reifung. Unsere Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Mechanismen, die synaptische Plastizität Entwicklung mit einer Gesamtziel zu verstehen das Verhalten von Tieren im Rahmen der synaptischen Entwicklung zugrunde liegen. Um dies zu tun, haben wir eine weitgehend intakte Zubereitung in einem Organismus (Zebrafisch, Danio rerio), die erhebliche Zugkraft für Entwicklungsstudien in den späten 1990er Jahren gewonnen hat.
Der Zebrafisch bietet mehrere deutliche Vorteile für neurologische Entwicklungsstudien. Beispielsweise ist ihr Genom sequenziert und einer Morpholino Niederschlägen und Zinkfinger-Nuclease-Knockouts führen kann Genaktivität und Proteinexpression auszuschalten. Man kann auch eine Überexpression Studien durchführen und transgenen Linien konstruiert werden 7-9. Embryonen sind relativ leicht und reichlich zu erwerben, unddie transparente Natur der Embryo eignet sich gut zur Bildgebung und opto genetische Studien. Zusätzlich können Verhaltensanalyse durchgeführt werden, und elektrophysiologischen Experimenten kann auf die Muskelfasern, Rückenmarksneuronen und Hinterhirn-Neuronen in weitgehend intakten Organismen vorgenommen werden, so dass man die Zellfunktion in vivo zu untersuchen. Wichtig ist, dass wir in der Lage, synaptische Aktivität nicht nur in der gleichen Klasse von Zelle zu untersuchen, aber in der gleichen Paar von Neuronen, von der Vorbereitung bis Vorbereitung. Mit anderen Worten, dies ist eine der seltenen wirbel Zubereitungen, in denen man auf die gleiche Neuronen zurückzukehren, in situ, um seine Entwicklung zu untersuchen.
Um neuronale Schaltkreise als lebensfähig wie möglich zu halten, entwickelten wir eine Vorbereitung, in der die Hinterhirn und Rückenmark wurden intakt gelassen, während der Patch-Clamp von den M-Zellen. In dieser Vorbereitung werden die Augen-, Kiefer-und Hautüberlagerung des Gehirns sanft entfernt und das Hinterhirn ist peeled weg von der Rückensaite, die den Zugang zu der ventralen Fläche des Hinterhirns. Die retikulospinale Neuronen nur wenige Mikrometer tief und sind relativ leicht zugänglich. Bei 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf, einige Abkürzungen sind in Tabelle 1 aufgeführt) die Zellen elektrisch kompakt und man kann getreue synaptische Aktivität (beide erregenden und hemmenden Ströme), spannungsabhängigen Ströme und Aktionspotentiale von ihnen.
Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass viele Aspekte der synaptischen Entwicklung und Reifung erfolgen in der 24 Stunden vor dem Schlupf und damit viel von unserer Aufmerksamkeit auf Organismen im Alter von 24 bis 72 hpf hpf konzentriert. Jedoch um 72 hpf, M-Zellen elektrisch weniger kompakt und lassen sich nur schwer richtig Klemmraum. Die Technik kann verwendet werden, um nicht nur die von den M-Zellen, sondern auch von dessen Homologen, MID2 cm und MID3 cm aufzuzeichnen. Theoretisch kann man auch durchführen Doppelaufnahmen, von einem spinal Kabel Neuron, wie einem primären motorischen Neurons und von der M-Zelle, aber das ist schwierig, und es könnte argumentieren, dass die Vorteile aus einer solchen schwierigen Technik gewonnen vielleicht nicht die außerordentlichen Anstrengungen, die erforderlich ist wert sein werden.
Protocol
1. Vorbereitung und Dissection
- Bereiten Sie das Sezieren Gericht mit Sylgard ausgekleidet. Aufnahmekammern von WPI (Sarasota, Florida, USA; Lieferanten sind in Tabelle 2 aufgeführt sind) werden als Sezieren Gerichte (Abbildung 1). Die Kammern sind so konzipiert, Glasobjektträger aufnehmen und kleine Kunststoffscheiben sind als Formen für die Sylgard verwendet. Die Scheiben werden zunächst der Schlitten mit Fett und Flüssigkeit Sylgard ist an der Mitte der Scheibe aufgenommen befestigt. Die Sylgard wird über Nacht heilen und wie sie dies tut, einen kleinen, runden Bett bildet sie auf dem Glasträger, die die Basis des Sezieren Gericht wird. Der Objektträger wird in die Aufzeichnungskammer angeordnet und dient als der Boden der Kammer zu dessen Herstellung befestigt (Fig. 1).
- Bereiten Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Lösungen. Extrazelluläre Lösungen sind bei Zimmertemperatur stehen gelassen werden, während intrazellulären Lösungen sollten steril gehalten werden. Man kann auch Lu hinzufügencifer gelb (0,1%) auf die intrazelluläre Lösung, so dass die Visualisierung des M-Zellmorphologie kann am Ende des Experiments durchgeführt werden. Dies dient dazu, Zellidentität (Fig. 2) zu bestätigen.
- Heben Wildtyp-Zebrafisch-Embryos in der Eier Wasser bei 28,5 ° C und sammeln und Stufe nach Kimmel et al. 10. Für Dissektionen, Transfer Embryonen in die Sezieren Gericht, das dient auch als Aufnahmeraum. Anesthetize für 7-10 min in einer Betäubung Salzlösung (0,02% Tricaine; Lösung 1, Tabelle 3), die eng angenähert physiologischer Kochsalzlösung. Man kann bestimmen, ob sie ausreichend durch Untersuchung der Reaktion auf eine sanfte Schwanz Klemm anästhesiert.
- Pin die Embryonen durch die Chorda und auf die Sylgard gesäumten Gericht mit 0,001 "Wolframdraht (Scientific Instrument Dienste. Inc., Ringoes, NJ, USA) unter Verwendung 25X Vergrößerung auf einem Binokular (Abbildung 1). Wolframdraht wird leicht geschnitten inauf kleine Teile mit feinen Seziersaal Schere.
- Stellen Sie die Vergrößerung auf dem Binokular auf 40-50X, die Präparation durchzuführen. Sobald der Embryo in die Schüssel, den Kiefer, Augen und Vorderhirn festgesteckt werden mit einer feinen Pinzette (Dumont # 5) entfernt.
- Das Hinterhirn wird sanft von der zugrunde liegenden Chorda durch sorgfältige Arbeit der Zange zwischen der Chorda und dem Gehirn abgezogen. Das Hinterhirn wird dann vorsichtig umgedreht, so dass die Bauchseite nach oben zeigt. Diese Positionierung bietet einen guten Zugang zu den M-Zellen, die in der Regel innerhalb von 5-10 um der Bauchseite sind bei jungen Embryonen und ~ 20-50 um in älteren Larven (2A).
- Vorsichtig bewegen Sie die Vorbereitung auf die Aufnahme-Setup, wo der Patch-Clamp-Experiment durchgeführt werden. Die M-Zellen werden mit Nomarski Differentialinterferenzkontrast (DIC) sichtbar, obwohl andere Formen der Bildgebung (dh Hoffman Modulationskontrast oder Dodt Gradient Contrast Imaging vonLuigs und Neumann, Deutschland) können ebenfalls verwendet werden.
2. Patch-Clamp-Aufzeichnung (Ganzzellmodus)
- Alle Aufnahmen werden in der ganzen Zelle Patch-Clamp-Modus 11 durchgeführt. Aufnahmekammern sind auf einem Mikroskoptisch in einem Elektrophysiologie-Setup platziert. Unsere Stufen befestigt sind und die aufrechten Patch-Clamp-Mikroskop ist mit einem beweglichen Mikroskop-Plattform oder einem Mikroskop Übersetzer verschraubt.
- Von dünnwandigen, Borosilikatglas von WPI erhalten; Patch-Clamp-Pipetten sind auf einer horizontalen Puller (Sutter Instruments Co. P-97) gezogen. Pipettenspitzen-Durchmesser in der Größenordnung von 0,2 bis 0,4 um nach dem Feuerpolieren zu einer glatten Kante, und die Schaftkegel ist ~ 4 mm in der Länge.
- Befestigen Sie die Pipette auf die Kopfverstärker-Stufe in der Elektrophysiologie-Setup. Es ist wichtig, die Kopfstufe in etwa 45 °-Winkel zu der horizontalen Achse zu halten, da dies gewährleistet einen Eintrittswinkel für die Pipette, die für die Bildung des Hochwiderstands Dichtungs auf die Mauthner-Zelle.
- Kurz vor Eintritt in die Bad-Lösung, eine kleine Menge von positiven Druck auf die Pipette, um die Wahrscheinlichkeit einer Verschmutzung die Spitze zu verringern. Bei der Aufnahme mEPSCs, Bad-Lösungen umfassen 1 uM TTX Aktionspotentiale, 5 uM Strychnin zu Glycin-Rezeptoren und 10 uM Bicucullin oder 100 uM picrotoxin an GABA A-Rezeptoren blockieren sperren blockieren. Bei der Aufnahme mIPSCs, sind der Bad-Lösungen 1 uM TTX, Kynurensäure und entweder Bicucullin oder Strychnin in Abhängigkeit von der Rezeptoraktivität von Interesse.
- Ansatz der M-Zellen mit einer kleinen Menge eines Überdrucks in der Pipette. Der Überdruck drückt sanft die Zelle von einer Seite zur anderen und, wenn er unmittelbar über der Zelle positioniert ist, bildet eine kleine Vertiefung an der Zellmembran. Lassen Sie die Pipette in Ort für ein paar Sekunden, um sanft reinigen die Zelloberfläche, so dass eine starke Dichtung zwischen der Pipette und der Membran gebildet werden kann. Freigeben des Überdrucks in der Pipetteermöglicht die Abdichtung eingeleitet werden und eine kleine Menge von Unterdruck verbunden mit negativen Pipette Potentiale ergibt GigaΩ Dichtungen bilden innerhalb weniger Sekunden.
- Ändern Sie den Haltepotential auf den Verstärker bis -60 mV. Bruch der Zellmembran mit einer Reihe von kurzen Impulsen von Saugen. Unmittelbar aufzeichnen Membranpotentiale zu minimieren und Kapazitäts Artefakte. Kompensieren Zellkapazität (C m) und Zugang (Serie) Widerstand (R a) von 70-85%. R ein routinemäßig überwacht werden, alle 30 Sekunden bis eine Minute, und wenn es eine Änderung von 20% oder mehr, Abbruch des Versuchs.
- Nachdem das Experiment beendet ist und genügend Daten erfasst worden ist, wird die Herstellung durch das Entfernen der Hinterhirn mit einer Pinzette geopfert. An diesem Punkt kann der Datenanalyse zu beginnen.
Representative Results
In diesem Manuskript wird eine Methode für die Patch-Clamp-Aufzeichnung in der Ganzzellmodus retikulospinale Neuronen im Zebrafisch, insbesondere die sich auf die M-Zellen. Natürlich ist es auch möglich, in anderen Patch-Clamp-Modi wie Cell-Attached-, innen-außen und von außen aus zu erfassen. Die Art der Daten, die man erhalten kann, ist nicht auf das, was wir hier vorgestellt beschränkt, sondern wir versuchen, ein Beispiel von sowohl synaptische Aktivität (exzitatorische und inhibitorische) in Voltage-Clamp-Modus als auch Aktionspotentiale in Stromklemme bereitzustellen. Wie der Organismus Altersgruppen und die M-Zellen entwickeln umfangreicher und aufwendiger Dendriten, ist die Fähigkeit, angemessen Klemmspannung und Raum klemmen die Zelle beeinträchtigt und die aktuelle Clamp-Modus wird die Aufnahme der Wahl.
Fig. 3 zeigt repräsentative Aufzeichnungen von exzitatorischen von HPF 48 Embryonen in Gegenwart des erhaltenen TTX (1 uM) und pharmakologische Mittel zu AMPA und NMDA-Rezeptor-Strömeblockieren GABA-und Glycin-Rezeptoren. Wenn die M-Zellen-Spannung bei -60 mV geklemmt sind die synaptischen Ströme aufgrund der Aktivierung der AMPA-Rezeptoren (Fig. 3A). Erfassung und Analyse dieser Ereignisse ermöglicht es, Parameter wie die Anstiegszeit, Abfallzeit, Amplitude und Frequenz aufzuzeichnen. AMPA Ereignisse haben typischerweise eine schnelle Anstiegszeit (20-80%-Anstiegszeit von ~ 0,1 ms) und Abfallzeit (~ 0,5 ms), und weisen eine mittlere Amplitude von etwa 25 Pa. Wenn die M-Zellen bei +40 mV geklemmt sind die resultierenden Auswärtsströme durch AMPA und NMDA-Rezeptor-Aktivität (Fig. 3C und 3D). NMDA-Rezeptor-Ströme zeigen längere Zeit Kurse als AMPA-Rezeptor-Ströme, und müssen bei positiven Potentialen oder Mg-freie Lösung aufgenommen, um die Mg-Block des NMDA-Rezeptoren zu entfernen 2,6. Die durchschnittliche mEPSC in Fig. 3D gezeigt ist, repräsentiert Misch AMPA und NMDA-Ströme bei +40 mV aufgezeichnet.
Figure 4 zeigt repräsentative Ergebnisse bei der Aufnahme von mIPSCs Mauthner-Zellen. Diese Ereignisse traten in der Gegenwart von TTX (1 uM) und Kynurensäure (1 mM) auf AMPA und NMDA-Rezeptoren zu blockieren. Diese Ereignisse zeigen einigermaßen schnellen Anstiegs-und Abfall Kinetik von HPF 48 und häufig genug, um viele von ihnen über einen 2-3 min Aufzeichnungs 3 erwerben. 5 zeigt Aktionspotentiale als Folge der Injektion von depolarisierenden Strom in die Zelle aufgenommen. M-Zellen der 48 hpf Embryonen feuern normalerweise ein einzelnes Aktionspotential (5B), obwohl sie manchmal mehrere APs feuern, wenn sie mit überschwelligen Reiz (5A) eingespritzt.
| Abkürzung | Vollständiger Name | |
| 1. | MPSC | Miniatur postsynaptischen Strom |
| 2. | mEPSC | Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Strom |
| 2 | mIPSC | Miniatur-hemmenden postsynaptischen Strom |
| 3. | MOhm | Mega Ohm (Einheit des Widerstandes; 10 6 Ohm) |
| 4. | GOhm | Giga Ohm (Einheit des Widerstandes; 10 9 Ohm) |
| 4. | MOsM | Milli osmolar (Einheit der Osmolarität; 10 -3 osmoles) |
| 4. | TTX | Tetrodotoxin |
| 5. | ATP | Adenosintriphosphat |
| 6. | GTP | Guanosintriphosphat |
| 7. | GFP | Grün fluoreszierendes Protein |
Tabelle 1.
| Firma | Katalog-Nummer | | |
| 1. | Zergliedern Geschirr | Warner Instruments | 64-0291 |
| 2. | 0,001 "Wolframdraht | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| 2 | Binokular | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| 3. | Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| 4. | Microforge | Narishige Gruppe | MF-900 |
| 5. | Upright Patch-Clamp-Mikroskop | Leica Microsystems | DMLFSA |
| 6. | Mikromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| 7. | Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| 8. | Verstärker | Molecular Devices | 200B |
| 9. | Erfassungssoftware | Molecular Devices | pClamp9 |
| 10. | Axograph X | Axograph | Axograph X |
Tabelle 2.
| Lösungsname | Reagenz und Konzentration (mM) | |
| 1. | Zergliedern Lösung | 134 NaCl, 2,9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 0,02% Tricaine |
| 2. | MPSC Extrazelluläre Lösung | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 0,001 TTX |
| 3. | MPSC Intrazelluläre Lösungtion | 134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2 ATP, 0,4 Li-GTP |
| 4. | Aktionspotential Extrazelluläre Lösung | 137 NaCl, 2,9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10 und 10 HEPES Glucose (mit 10 uM D-Tubocurarin) |
| 5. | Aktionspotential Intrazelluläre Lösung | 130 KCl, NaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 4 mg-ATP und 0,4 Li-GTP. |
Tabelle 3. Alle extrazellulären Lösungen werden auf 290 mOsm und der pH 7,8 eingestellt. Alle intrazellulären Lösungen werden auf 280 mOsm und der pH 7,4 eingestellt.
Fig. 1 ist. Sezieren Gericht und intakte Hinterhirn-Rückenmark Vorbereitung. (A) Zergliedern und Aufzeichnung Gericht aus WPI erhalten. Eine dünne Scheibe wird vorsichtig auf t abgedichteter Glasplättchen an der Unterseite der Schale und Sylgard der gut angelegt ist. (B) 48 hpf Hinterhirn-Rückenmark Vorbereitung. Die ventrale Oberfläche des Rautenhirns ist nach oben und der M-Zelle direkt unter der Oberfläche des Gewebes auf der Höhe der Pfeilspitze befindet.
2. (A) Nomarski Differentialinterferenzkontrast Bild einer M-Zelle kurz nach dem Schlüpfen von einem 2 dpf Embryo erhalten. Das Bild wurde nach der Aufnahme spontane erregende synaptische Aktivität von der M-Zelle aufgenommen. (B) Die Zelle wurde mit Lucifer Yellow während gefüllt das Experiment. 12 Angepasst mit Erlaubnis.
3. (A) Spontane AMPA mEPSCs von einer M-Zelle aufgenommen bei einem Haltepotential von -60 mV. (B) Durchschnitts mEPSCs vom Aufzeichnungs in (A) erhalten. (C) Spontane AMPA und NMDA (Pfeilspitzen) mEPSCs aus einem M-Zelle bei einem Haltepotential von +40 mV aufgezeichnet. (D) Durchschnittliche mEPSCs vom Aufzeichnungs erhaltenen (C). Glutamat mEPSCs wurden in Gegenwart von TTX (1 uM), um Aktionspotentiale zu blockieren, Strychnin (5 uM) und Picrotoxin (100 &mgr; M) zu Glycin und GABA-Ströme zu blockieren aufgezeichnet.
4. (A) Spontane mIPSCs aus einem M-Zelle bei einem Haltepotential von -60 mV aufgezeichnet. (B) Durchschnitts mEPSCs vom Aufzeichnungs in (A) erhalten. mIPSCs wurden in Gegenwart von TTX (1 uM) aufgezeichnet, um Aktionspotentiale, Kynurensäure (1 mM) zu blockieren, um Glutamat-Rezeptor-Aktivität und Bicucullin (10 uM) zu blockieren, um GABA-Ströme zu blockieren.
5. Aktionspotentiale aus einer M-Zelle aufgezeichnet. In dieser bestimmten Zelle ein überschwelligen Reiz (0,48 NA) ausgelöst mehrere Aktionspotentiale (A), sondern ein Stimulus Schwelle führt nur die Herstellung eines einzelnen Aktionspotentials (B). (C) Diese Protokolle für die in A und B gezeigten Spuren.
Discussion
Das oben beschriebene Protokoll kann eine Klemm Datensatz aus der M-Zellen und seinen Homologen zu patchen. Die Technik ist anspruchsvoll und es sollte in mehreren wichtigen Bereichen während des gesamten Verfahrens getroffen werden. Wir werden nun einige dieser Bereiche zu diskutieren und hilfreiche Tipps, um den Erfolg sicherzustellen anbieten.
Der Bau der Seziersaal / Aufnahme Kammer ist ein wichtiger Aspekt des Experiments. Die M-Zellen sind schwer zu sehen, es sei denn, Differentialinterferenzkontrast verwendet. Nomarski DIC funktioniert am besten mit sauberen Glasdeckgläser, aber wir fanden, dass eine sehr dünne Schicht von Sylgard (~ 1-2 mm) wird nicht die DIC in einem solchen Ausmaß, dass es mit der Identifizierung der M-Zellen behindert und zu verzerren. Deshalb verwenden wir eine Aufnahme Kammer, die ein dünnes Deckglas auf dem Boden, auf dem eine kleine Kunststoffscheibe (~ 5 mm Durchmesser) gelegt hat. Wir mischen Sylgard 184 in eine Petrischale und vorsichtig Sylgard die Flüssigkeit auf die Innenseite der Scheibe mit einer Pasteur-Pipette. Das Sylgard kann bei Raumtemperatur über einige Tage ausgehärtet werden oder kann für eine schnelle Aushärtung erwärmt werden. Die Scheibe kann nach der Sylgard Aushärten entfernt werden, obwohl dies nicht notwendig ist. Sobald die Dissektion / Aufnahme Kammer gemacht worden ist, kann es für mehrere Wochen verwendet werden, bevor eine neue Sylgard gesäumten Glasobjektträger benötigt wird.
Der nächste Schritt in dem Verfahren besteht darin, bis alle relevanten Lösungen am Tag des Experiments (Tabelle 3). Intrazelluläre Lösungen alles andere als ATP und GTP enthalten, werden im Voraus bei -20 ° C hergestellt und in 5 ml Aliquots Am Tag der Aufnahme ein Aliquot wird auf Raumtemperatur aufgetaut und frisch ATP und GTP zugesetzt. Die Lösung wird auf 280 mOsm und der pH 7,4 eingestellt. In unseren Händen, so finden wir, dass die Zugabe von frischem ATP und GTP auf einer täglichen Basis zu einer guten Aufnahmen. Alle Lösungen müssen steril für die beste Chance auf Erfolg gehalten werden.
Intrazelluläre Lösungen müssen throug gefiltert werdenha 0,22 um Filter (Sigma), kleine Partikel und Ablagerungen, die die Aufnahme beeinträchtigen könnten, zu entfernen. Um dies zu tun, haben wir zunächst die intrazelluläre Lösung ziehen in eine 1-ml-Spritze, bringen Sie den Filter auf das Ende der Spritze und fügen Sie eine Kunststoffpipettenspitze, die erhitzt wurde und gezogen, um feine Spitze, bis zum Ende des Filters. Dies erlaubt uns, den gefilterten intrazellulären Lösung direkt auf der Innenseite der Glaspatchpipetten anzuwenden.
Sobald die Lösungen sind, kann der Embryo anästhesiert und seziert werden. Vor der Präparation, sollte darauf geachtet werden, das Alter des Organismus angemessen einzuschätzen. Jeder Embryo innerhalb Kupplung Alter zu einem etwas anderen Geschwindigkeit. Daher bei der Beurteilung des Alters des Organismus, ist es wichtig, dies nach den üblichen Verfahren 10,13, mithilfe phänotypischen Hinweise, wie die Anzahl der Somiten, die Gesamtform des Körpers, und dem Zeitpunkt der Befruchtung der Eizelle zu tun. Alle Sektionen sind mit einem feinen Dumont Nr. 5 Paar durchgeführtPinzette. Diese müssen scharf sein und in gutem Zustand sein, sonst wird es sehr schwierig, die Haut, die über der Hinterhirn und jede Bindegewebe auf der ventralen Oberfläche des Rautenhirn entfernen. Wir haben oft die Zange nach wenigen Wochen der Anwendung zu schärfen und diese selbst zu machen mit einem Schleifstein.
Um die Fische an die dünne Schicht der Sylgard Pin, verwenden wir Stifte von feinen Wolframdraht 0,001 Zoll im Durchmesser gestaltet. Die Stifte werden mit einer alten, Mikro-Dissektion Schere unter einem Binokular geschnitten und sind klein genug, um direkt durch die Chorda passen. Pinning die Embryonen an jedem anderen Punkt nicht zu immobilisieren sie und macht Dissektionen fast unmöglich durchzuführen. Wenn die erste Lern die Aufnahmen durchzuführen, ist es schwierig, die Identität M-Zelle von ihrer Homologen sein können (insbesondere MID2 cm, die in der benachbarten Rhombomer befindet - Rhombomer 5). In einigen Embryonen diese beiden Paare von Zellen erscheinen in der Größe ähnlich. Die Otolithen provide günstig Wahrzeichen zur Identifizierung von M-Zellen zu unterstützen. Bei 48 HPF die M-Zellen werden direkt neben den Otolithen entfernt, und auch wenn die Otolithen sind während der Präparation entfernt, hinter einer leicht beschädigt seitlichen Bereich des Hinterhirn, das als Marker für ihre ursprüngliche Position verlassen sie dient. Transgene Fische, die GFP oder eine andere Fluoreszenzmarker in der M-Zellen zu exprimieren, bieten eine ausgezeichnete Vorbereitung neuer Experimentatoren. In unseren Händen die M-Zellen eine Membrankapazität von rund 18 bis 24 pF bei 48 hpf, während die kleineren Homologen sind näher an 12-14 pF. Zellen mit größeren Oberflächenbereich größere Membrankapazitätswerte (in Picofarad (pF) gemessen), verglichen mit kleineren Zellen. Somit kann Membrankapazität als grober Indikator für die Zellgröße, wo größere Zellen größere Kapazitätswerte verwendet werden. Diese Charakteristik elektro dient als weitere Eigenschaft, durch die die M-Zellen aus ihrer Homologe identifiziert werden. Schließlich benutzen wir oft Lucifer gelb in unserer Aufnahme (intrazelluläre)-Lösungen, die uns einen festen Identifizierung des Zelltyp in Untersuchung mit Fluoreszenz-Bildgebung einmal Aufnahmen abgeschlossen sind führen können.
Pipettenspitze Widerstände im Bereich von 3,5 bis 4,5 MOhm sind der beste Kompromiss zwischen Größe und Spitze niedrige Zugriffs Widerstand, der typischerweise im Bereich von 8 bis 15 MOhm. Dies ist besonders wichtig für Veranstaltungen mit schnellen Kinetik; ~ 0,1 msec (20-80%) steigen und mal ~ 0,5 msec exponentiell abklingt 12,14,15 (3A und 3B). Daten mit einer Digitalisierungsrate von 50-100 kHz erfaßt und mit einem Tiefpassfrequenz von 5-10 kHz gefiltert. Mit Blick auf die Patch-Pipetten, fanden wir, dass sie nicht brauchen, um Feuer-poliert, um eine Aufnahme zu erhalten, aber anekdotisch, scheint es etwas besser Chance auf gute Dichtungen, verglichen mit ungeschliffenen Pipetten bieten. Da die Pipettenspitzen relativ groß sind, haben wir nicht ver fügeny viel positiver Druck auf die Pipette vor dem Eintritt in die Lösung. Es braucht Übung der Entscheidung über die geeignete Menge von Überdruck als Überdruck gelten die Zelle zu viel zu bewegen, und wird Dichtung Bildung zu verhindern. Es kann auch synaptischen Kontakte beschädigen, wenn die Zelle leicht aus ihrer ursprünglichen Position verschoben. Auf der anderen Seite, hat zu wenig Druck führt zu schmutzig Tipps und nicht die Oberfläche der Zelle gut genug, um gute Dichtungen bilden reinigen. Ein Mittelweg ist nur durch erhebliche Praxis und Erfahrung erreicht. Dichtungsbildung mit Anwendungen von negativen Spannungen an der Pipette erhöht werden. Wir haben in der Regel 1,2-2 GOhm Dichtungen, die sich hervorragend für Durchbrüche in der ganzen Zelle Modus befinden.
Als pharmakologische Mittel zur Zytoplasma der Zelle angewendet werden müssen, umfassen wir sie in der intrazellulären Lösung vor dem Füllen der Pipette. Es sollte bei der Vorbereitung der Pipette Lösungen, um den Verlust der Mittel zu vermeiden genommen werdenindem sie dem 0,22 um-Filter binden. Deshalb haben wir zunächst auswählen, die intrazelluläre Medium und anschließend vorsichtig die pharmakologische Mittel zur gefilterten Lösung. Anwendung der Verbindungen auf das intrazelluläre Kompartiment hat seine eigene einzigartige Herausforderungen. Beispielsweise Zugabe von Arzneimitteln an das intrazelluläre Medium Regel reduziert die Chancen eines GOhm Dichtung bildet, aber nicht bis zu dem Punkt, wo es ein großes Hindernis für das Experiment.
Man sollte erkennen, dass die Anwendung von pharmakologischen Mitteln, die auf diese Weise nicht erlauben dem Experimentator, die geeignetste Steuersatz seit der Agent hat direkten Zugriff auf die Zelle vom Beginn der Ganzzellkonfiguration. Auch wenn wir Daten aufzuzeichnen in dieser Art von Experiment, muss man sich bewusst, dass die nächste beste Kontrolle ist die intrazelluläre Anwendung einer inaktiven Form des Mittels sein. In vielen Fällen geschieht dies in Form einer hitzeinaktiviertem Verbindung, eine verschlüsselte Peptid or eine inaktive Isomer vom Lieferanten erhalten.
Wir erwerben die Daten in Form der synaptischen Ströme (mPSCs), spannungsabhängigen Ströme und Aktionspotentiale. Miniatur-Ströme können durch ein paar hervorragende Programme (pClamp, Axograph, etc.) analysiert werden, obwohl wir lieber Axograph X (John Clements) zu verwenden. Axograph X läuft auf Windows-und Macintosh-Plattformen und kann sowohl für die Erfassung und Analyse von elektrophysiologischen Daten verwendet werden. mEPCs mit Hilfe einer Schablone nach Wahl des Experimentators, aus der Aufnahme selbst erhalten erworben. Einzelne Ereignisse können für Eigenschaften wie Anstiegszeit, Amplitude, Halbwertsbreite und Abfallzeit, etc. Wir exportieren die Tabellenkalkulation von Daten an Kaleidagraph (Synergy Software), wo wir Persönlichkeiten, darunter Kopien von Ereignisspuren von Axograph X. produzieren analysiert werden
Einer der schwierigsten Aspekte des Experiments ist die Bestimmung, ob die Aufzeichnung gut genug, um für sauberes geführt,zuverlässige Daten. Zum Beispiel kann platzKlemm Probleme bei der Aufnahme mPSCs von M-Zellen, die große und umfangreiche Axone dendritischen Prozesse entstehen. Wenn Spannungsklemm, kann man im allgemeinen die Spannung zu steuern, bei der die Pipettenspitze relativ gut (insbesondere, wenn der Eingangswiderstand (R a) niedrig ist), kann aber nicht die richtige Kontrolle des Membranpotentials in dendritischen Prozesse oder Axone, die weit weg von der Pipettenspitze. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob die Zelle war richtig Raum eingeklemmt ist, ein Streudiagramm der Anstiegszeit gegen die Amplitude der mPSCs, die aufgenommen wurden, zu produzieren. Eine Korrelation zwischen den Daten deutet auf unzureichende Klemmraum. In anderen Worten, wenn der Raum Klemme ist schlecht, dann mPSCs, die nahe an der Pipette auftreten müssen schneller Anstiegszeiten und größere Amplituden als Ereignisse von der Pipette auftretenden etwas Abstand. Wenn eine Korrelation vorhanden ist, werden die Daten ist problematisch und kann nicht verwendet werden.
Ein weiterer Aspektvon elektrophysiologischen Ableitungen, die angegangen werden muss, ist, dass der Leckströme. Dies gilt insbesondere, wenn eine Klemmspannung Zelle, um spannungsabhängigen Ströme, wie Na + oder K +-Ströme aufzunehmen. Wenn das Membranpotential aus der Ruhe abweicht, können Leckströme zusammen mit spannungsabhängigen Aktivität aufgezeichnet werden. Leckströme (I L), eine Kombination von Kalium (I K), Natrium (I Na) und Chlorid (Cl I) Strom durch nichtspannungsabhängigen Kanäle, die Aktivität von Interesse zu verschleiern und muß vom Aufzeichnungs subtrahiert werden. Der Verstärker ist in der Lage diese Funktion online während der Aufzeichnung durch Ausführen was typischerweise als ein P / N-Protokoll. Bei einem P / N Protokoll der Verstärker mehrere kleine Depolarisationen (oder Hyperpolarisationen) aus der Ruhe laufen und wird das resultierende Leckstrom, der auftritt, aufzuzeichnen. Es ist wichtig, die klein genug Impulse, die nicht spannungsgesteuerte Kanäle aktivieren verwenden. Die aktuelles, die während dieser Impulse auftreten, werden aufgezeichnet und gemittelt, so dass die Leckströme aus der spannungsgesteuerten Kanalaktivität subtrahiert werden.
Schließlich muss man, um der Übergangspotential, das an der Spitze der Elektrode zwischen der intrazellulären und extrazellulären Lösungen tritt nehmen. Intrazelluläre und extrazelluläre Lösungen sind typischerweise aus verschiedenen Ionen zusammengesetzt ist, mit unterschiedlichen Aktivitäten und Mobilitäten. Größere Ionen mit niedrigeren Mobilitäten eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber Ionenbewegung als kleinere bieten, und dies kann in einer kleinen, aber signifikanten Potentialdifferenz an dem Verbindungspunkt der Lösungen führen. Diese Übergangspotential muss bei der Bestimmung der geeigneten Spannungen von der Zelle erlebt genommen werden.
Das hier vorgestellte Verfahren ist durch unser Labor seit vielen Jahren verwendet. Es gibt jedoch alternative Methoden zur Aufzeichnung von M-Zellen. Vor allem Joseph Fetcho und Kollegen haben entwickelnED eine ausgezeichnete Vorbereitung, in dem man von den M-Zellen von älteren Larven (4-5 Tage alt) in einer weniger invasiven Weise als hier, wo das M-Zelle wird von der dorsalen Oberfläche 16 vorgefahren aufzuzeichnen. Wir hatten eine ähnliche Technik versucht, aber fand es einfacher, den M-Zellen aus der Bauchseite des Hinterhirn, in dem die Zelle näher an der Oberfläche des Gehirns, insbesondere bei jungen Fischen (dh 24 bis 72 HPF HPF) zu nähern. Weiterhin ist ein Ansatz aus dem dorsalen Oberfläche erfordert gewöhnlich die Verwendung einer transgenen Linie, die eine fluoreszierende Markierung in den M-Zellen, die das Potenzial haben zusätzliche Variablen in die Aufnahme einzuführen ist äußert. Dieses Problem ist nicht vorhanden, wenn mit Wildtyp-Fisch. Doch mit der hier vorgestellten Technik, sind wir auf das Studium jüngeren Tieren (24 hpf bis 72 hpf) begrenzt. Somit hat jeder Ansatz seine Vorteile und Einschränkungen.
Student-t-Test kann verwendet werden, um zwei Gruppen von Daten zu vergleichen, während eine Analyse der Variance (ANOVA) verwendet, um mehrere Gruppen zu vergleichen. Es muss darauf geachtet werden, um die entsprechenden Post-hoc-Test für die parametrische vs nicht-parametrische Daten zu wählen.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der kanadischen Stiftung für Innovation (CFI), um DWA unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
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