Summary
私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。
Abstract
マウスナー細胞（M細胞）は、硬骨魚の後脳に位置する大きな網様体ニューロンである。彼らは生物が脅威を感じる場合に発生するC-起動するか、エスケープ応答として知られている特徴的な挙動に関与する重要なニューロンである。 M細胞は、広範には、興奮性、抑制性神経調節信号1の広い範囲を受けることが示されている成人金魚で研究されている。我々は、脊椎動物の調製におけるシナプス発生の局面を研究するために、ゼブラフィッシュ胚におけるM細胞活性について調べてきた。 1990年代後半にアリと同僚は、CNSがほとんど無傷2,3,4れたゼブラフィッシュ胚におけるM細胞からの記録パッチクランプのための準備を、開発しました。そのときの目的は、無傷の脳脊髄調製物内の官能シナプス結合を維持しながら、後脳のニューロン、脊髄ニューロンおよび幹骨格筋からのシナプス活動を記録することであった。この調製物は依然として今日の我々の研究室で使用される。メカニズム根本的発達、シナプス可塑性を調べるために、我々は興奮（AMPAおよびNMDA媒介）5,6およびM細胞の開発から抑制性（GABAおよびグリシン）シナプス電流を記録します。重要なのは、このユニークな準備は、私たちは慎重に胚性生物におけるシナプス可塑性と神経発達を調べるために準備するための準備から、同じ細胞（M細胞）に戻ることができます。同じ細胞型に戻すには、この調製により提供される利点1を含む）には、M細胞への完全な、機能的なシナプス結合、2）比較的安価な準備、容易に利用可能な胚4の3）大量供給）能力（ すなわち 、M-すべての準備のセル）、個々の細胞のレベルでのシナプスの開発は、魚から魚を検査できるようにして、胚の透明の性質のため、全体の製剤の5）画像。
Introduction
発生神経生物で顕著な問題の一つは、シナプスの成熟の間のシナプス可塑性現象の役割に関するものである。我々の研究は、シナプス開発のコンテキストで動物の行動を理解することの全体的な目標とシナプスの開発の基礎となる可塑性のメカニズムを理解することに焦点を当てています。これを実行するために、我々は1990年代後半に発達研究のために、かなりの注目を集めている生物において、ほとんど無傷の準備（ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ ） を開発した。
ゼブラフィッシュは、神経発達の研究のために、いくつかの明確な利点を提供しています。例えば、そのゲノムの配列を決定し、1は、遺伝子活性およびタンパク質発現を沈黙させるモルホリノノックダウンとジンクフィンガーヌクレアーゼノックアウトを行うことができます。 Oneはまた、過剰発現の研究を行うことができるトランスジェニックラインは7-9を構築することができる。胚を取得することが比較的容易で豊富であり、そして胚の透明な性質はよくイメージングと光遺伝学的研究に適しています。さらに、行動解析を行うことができ、電気生理学的実験はいずれかのin vivoでの細胞機能を調べることができ、ほとんど無傷の生物において筋線維、脊髄ニューロンおよび後脳ニューロンに行うことができる。重要なのは、我々が、神経細胞の非常に同じペアでは、製剤からの調製するには、セルだけではなく、同じクラスにシナプス活性を調べることができます。言い換えれば、これは一つの発達を研究するために、 その場で 、同じニューロンに戻すことができる稀な脊椎動物製剤の一つである。
可能な限り生存可能な神経回路を維持するために、我々は、後脳および脊髄の無傷のままされた製剤を開発したM-細胞からのパッチクランプつつ。この準備では、脳をオーバーレイ目、顎、皮膚を優しく取り除き、後脳はピールです離れて脊索からD、後脳の腹側表面へのアクセスを可能にする。網様体ニューロンは、数マイクロメートルの深い位置しており、比較的容易にアクセスできます。 48時間後に受精（HPF;いくつかの略語を表1に示します）で細胞を電気的にコンパクトであり、1は忠実に彼らから電位依存性電流と活動電位、シナプス活性（興奮性と抑制性電流の両方）を記録することができます。
我々の調査結果は、シナプスの発生および成熟の多くの側面が孵化前に24時間で起こることが示唆されているので、我々の注意の多くは24 HPFから72 HPFに、年齢の範囲の生物に焦点を当てています。しかしながら、72 HPF、M細胞によって電気的に少ないコンパクトであり、適切に空間クランプするのが困難である。技術は、M細胞からだけでなく、そのホモログ、MID2センチとMID3センチからだけでなく、記録するために使用することができる。理論的には、1にもSPから、ダブル録画を実行することができるinalコードなどの一次運動ニューロンなどとM細胞からニューロンが、これは困難であり、そのような困難な技術から得られる利益が必要とされている異常な努力の価値がないかもしれないと主張している可能性があります。
Protocol
1。準備と解剖
- シルガードが並ん解剖料理を準備します。 WPIから記録チャンバー（サラソタ、フロリダ、USAと、サプライヤーは、 表2に記載されている）は、皿（ 図1）解剖として使用される。チャンバは、ガラススライドを収容するように設計されており、小さなプラスチックワッシャシルガードための鋳型として使用される。ワッシャーは、第グリース、液体シルガードワッシャの中心に添加すると、スライドに固定されている。シルガード一晩硬化され、それがそうするように、解剖皿のベースとなるガラススライド上に小さな円形の床を形成する。スライドは、記録チャンバーに入れ、準備が貼付されたチャンバーのベース（ 図1）として機能する。
- 表3に記載された溶液を調製する。細胞内のソリューションは、無菌保つ必要があり、一方、細胞外のソリューションは、室温で放置する必要があります。一つは、また呂を追加することができます細胞内溶液（0.1％）を黄色cifer M-細胞形態の視覚化は、実験の最後に行うことができるようにする。これは、セルアイデンティティ（ 図2）を確認するのに役立つ。
- キンメルら 10によると28.5℃の卵水に、野生型ゼブラフィッシュ胚を高め、収集し、舞台。解剖のために、また、記録室となる解剖皿に胚を移す。密接に生理食塩水を近似し、麻酔塩溶液（溶液1、 表3 0.02％トリカイン）中で7〜10分間麻酔。彼らは十分に穏やかなテールピンチへの応答を調べることによって、麻酔をかけている場合に一つが決定することができます。
- 脊索を通って、0.001」は、解剖顕微鏡（ 図1）上で25X倍率を用いて、タングステン線（科学機器·サービス。社、Ringoes、ニュージャージー州、米国）。タングステン線が容易に切断されたとのSylgardが並ぶ皿に胚を固定するで細かい解剖ハサミで小さなセグメントに。
- 解剖を実行するために40-50Xに解剖スコープに倍率を調整します。胚は皿にピン止めされた後、あご、目と脳は、鉗子（デュモン＃5）の罰金のペアを使用して除去される。
- 後脳を静かに慎重に脊索と脳の間に鉗子を加工して離れて根本的な脊索から剥離する。腹面が上を向くように後脳をゆっくり裏返し。この位置決めは、古い幼虫20〜50ミクロン（ 図2A）の若い胚腹面の5〜10ミクロン以内に通常であり、〜M細胞への良好なアクセスを提供します。
- 慎重にパッチクランプ実験を行うことができる記録のセットアップへの準備を移動します。 M細胞は、ノマルスキー微分干渉コントラスト（DIC）で可視化されていますが画像の他のモード（ つまり、ホフマンモジュレーションコントラストやDodtグラデーションコントラストイメージングからLuigsとノイマン、ドイツ）を用いてもよい。
2。パッチクランプ記録（全細胞モード）
- 全ての記録は、全細胞パッチクランプモード11で行われる。録音室は、電気生理学のセットアップで顕微鏡のステージ上に配置されます。私たちのステージは固定されており、直立パッチクランプ顕微鏡は可動顕微鏡プラットフォームや顕微鏡トランスレータにボルトで固定されている。
- WPIから入手した薄壁、ホウケイ酸ガラスから、パッチクランプピペットは、水平プラー（サッター·インスツルメンツ（株）P-97）に引っ張られる。ピペット先端の直径は、滑らかなエッジに火仕上げした後に0.2〜0.4程度であり、シャンクテーパーは、長さが約4 mmである。
- 電気生理学のセットアップで、アンプヘッドステージにピペットを取り付けます。これは、高抵抗シールの形成に適しているピペットのエントリ角を確実にするように水平軸に対して略45°の角度でヘッド段を維持することが重要であるマウスナーセルにS。
- ちょうど浴溶液に入る前に、チップを汚す可能性を低減するために、ピペットに正圧の少量を適用する。 mEPSCsを記録する場合、浴溶液は、GABA A受容体をブロックするグリシン受容体および10μMビククリンまたは100μMのピクロトキシンをブロックするために活動電位を遮断するために、1μMのTTX、5μMのストリキニーネを含む。 mIPSCsを記録する場合、浴溶液は、対象とする受容体活性に応じて、1μMのTTX、キヌレン酸およびビククリンまたはストリキニーネのいずれかを含む。
- ピペット内の正圧少量のM細胞にアプローチ。正圧を穏やかに左右にセルを押し、セルの上に配置されたときにすぐに、細胞膜上の小さなディンプルを形成する。ピペットと膜との間に強力なシールが形成されるように穏やかに細胞表面を洗浄するために数秒間適所にピペットを残す。ピペット内の正圧を解放するシールが開始されることを可能にし、数秒以内に形成GigaΩシールにおける負ピペット電位の結果と結合された負圧の少量。
- -60 mVまでアンプの保持電位を変更します。吸引の短パルスの系列を有する細胞膜を破裂させる。すぐに膜電位を記録し、静電容量のアーティファクトを最小限に抑えることができます。 70から85パーセントによってセル容量（C m）のアクセス（直列）抵抗（R A）を補償する。 Rは、日常的に分、30秒毎にモニターし、そして20％以上の変化があった場合、実験を中止すべきである。
- 実験が終了し、十分なデータが取得されたら、製剤は、ピンセットで後脳を除去することによって犠牲にされる。この時点で、データ分析を開始することができる。
Representative Results
本稿では、我々は特に、M細胞に焦点を当て、ゼブラフィッシュにおける網様体ニューロンからホールセルモードでパッチクランプ記録のための手法を提案する。もちろん、そのような細胞外アウト付き、インサイドアウトなどの他のパッチクランプモードで記録することも可能である。一つは入手できるデータの種類は、ここで提示してきたが、我々は電流クランプで電圧固定モードで両方のシナプス活性（興奮性および抑制性）の例と同様に、活動電位を提供しようとするものに限定されない。生物の年齢とM細胞は、より広範かつ複雑な樹状突起を開発する際、十分に細胞をクランプクランプとスペースを電圧能力が損なわおよび電流クランプモードが選択の記録となっている。
図3（1μM）および薬理学的薬剤へのTTXの存在下で48 HPFの胚から得た興奮性AMPAおよびNMDA受容体電流の代表的な録音を示していますGABAおよびグリシン受容体を遮断する。 M細胞は-60mVに電圧クランプされたときに、シナプス電流は、AMPA受容体（ 図3A）の活性化によるものである。取得及びこれらの事象の分析は、一方が、立ち上がり時間、減衰時間、振幅、周波数などのパラメータを記録することを可能にする。 AMPA受容イベントは通常、高速立ち上がり時間（〜0.1ミリ秒の20から80パーセントの立ち上がり時間）と減衰時間（〜0.5ミリ）を持っており、約25 pAの平均振幅を示す。 M-細胞を+40 mVにクランプされる場合、得られる外向き電流は、AMPAおよびNMDA受容体活性（ 図3Cおよび3D）によるものである。 NMDA受容体電流がAMPA受容体電流よりも長い時間経過を示し、NMDA受容体2,6のMgのブロックを除去するために正の電位でまたはMgを含まない溶液に記録される必要がある。 図3Dに示す平均mEPSCは+40 mVに記録された混合AMPAおよびNMDA電流を表す。
Fiのマウスナー細胞からmIPSCsを記録する場合グレ4は、代表的な結果を示している。これらのイベントは、AMPAおよびNMDA受容体をブロックするために、TTXの存在（1μM）とキヌレン酸（1 mM）の中で発生しました。これらのイベントは、48 HPFによる合理的に高速な立ち上がりと減衰動態を示し、3を記録し 、2〜3分かけて、それらの多くを獲得するのに十分頻繁にある。細胞内に脱分極電流を注入した結果、記録された図5に示す活動電位図 。閾値上刺激（ 図5A）を注射したとき、彼らは時々 、複数のAPを発射ものの、48 HPF胚のM細胞は通常、単一の活動電位（ 図5B）を発射する。
| 略語 | フルネーム | |
| 1。 | MPSC | ミニチュアシナプス後電流の |
| 2。 | mEPSC | ミニチュア興奮性シナプス後電流の |
| 2 | mIPSC | ミニチュア抑制性シナプス後電流の |
| 3。 | MΩ | メガオーム（抵抗の単位; 10 6オーム） |
| 4。 | GΩ | ギガオーム（抵抗の単位; 10 9Ω） |
| 4。 | ミリオスモル | ミリ浸透圧（浸透圧ユニットと、10 -3オスモル） |
| 4。 | TTX | テトロドトキシン |
| 5。 | ATP | アデノシン三リン酸 |
| 6。 | GTP | グアノシン三リン酸 |
| 7。 | GFP | 緑色蛍光タンパク質 |
表1。
| 会社 | カタログ番号 | | |
| 1。 | 皿を解剖 | ワーナー·インスツルメンツ | 64から0291 |
| 2。 | 0.001 "タングステン線 | 科学機器サービス株式会社 | W406 |
| 2 | 解剖顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | MZ9.5 |
| 3。 | ピペットプラー | サターインスツルメンツ株式会社 | P-97 |
| 4。 | マイクロフォージ | ナリシゲグループ | MF-900 |
| 5。 | 直立パッチクランプ顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | DMLFSA |
| 6。 | 極微操作装置 | シスキュー株式会社 | MX7500 |
| 7。 | Digidata | 分子デバイス | 1322A |
| 8。 | アンプ | 分子デバイス | 200B |
| 9。 | 収集ソフトウェア | 分子デバイス | pClamp9 |
| 10。 | Axograph X | Axograph | Axograph X |
表2。
| ソリューション名 | 試薬および濃度（MM） | |
| 1。 | 解剖ソリューション | 134のNaCl、2.9のKCl、2.1のCaCl 2、1.2のMgCl 2、10 HEPES、10グルコースおよび0.02％トリカイン |
| 2。 | MPSC細胞外液 | 134のNaCl、2.9のKCl、2.1のCaCl 2、1.2のMgCl 2、10 HEPES、10グルコース、および0.001 TTX |
| 3。 | MPSC細胞内ソリューションのTiON | 134塩化セシウム、2のMgCl 2、10 HEPES、10 EGTA、 硫酸ナトリウム-ATP、0.4のLi-GTP |
| 4。 | 活動電位外溶液 | 137のNaCl、2.9のKCl、2.1のCaCl 2、1.2のMgCl 2、10 HEPESおよび（10μMのD-ツボクラリン付き）10グルコース |
| 5。 | 活動電位細胞内液 | 130のKCl、2のNaCl、10 EGTA、10 HEPES、4mgの-ATPおよび0.4のLi-GTP。 |
表3。すべての細胞外液は290 mOsmで、pHを7.8に調整している。すべての細胞内の溶液は280 mOsmで、pHを7.4に調整する。
図1。料理や完全な後脳·脊髄の準備を解剖。 （A）WPIから入手したお料理を解剖して記録。薄いワッシャーを慎重トンに封入されている彼皿の底にガラススライド及びシルガードは当。（B）48ゼブラ後脳·脊髄調製物に適用される。後脳の腹面が上を向いているとM細胞は、矢じりのレベルでだけで組織の表面の下に位置しています。
図2。ダウンロードが孵化後2のdpf胚から得られたM-細胞の（A）ノマルスキー微分干渉コントラスト画像の画像は、M-細胞からの自発的興奮性シナプス活性を記録した後に採取した。（B）セルが中に黄色ルシファーを充填した実験。許可を得て12から適応。
図3。 （A）自発的AMPA受容mEPSCsは、M-細胞から記録された -60 mVの保持電位で。 （B）（A）で記録から得られた平均mEPSCs。（C）自発AMPAおよびNMDA（矢印）+40 mVの保持電位でのM細胞から記録mEPSCs。（D）で記録から得られた平均mEPSCs （C）。グルタミン酸mEPSCsは、グリシンとGABA電流を遮断するために、活動電位を遮断するために、TTX（1μM）の存在下で記録ストリキニーネ（5μM）およびピクロトキシン（100μM）であった。
図4。 （A）-60 80mVの保持電位でのM細胞から記録された自発的mIPSCs。 （B）（A）で記録から得られた平均mEPSCs。 mIPSCsは、GABA電流をブロックするグルタミン酸受容体活性及びビククリン（10μM）をブロックするキヌレン酸（1mM）を、活動電位を遮断するためTTXの存在下（1μM）で記録した。
図5。活動電位は、この特定のセルでは閾値上刺激（0.48 NA）は、いくつかの活動電位（A）を誘発した。のM細胞から記録されますが、しきい値への刺激は、単一活動電位（B）の生成をもたらす。 AとBに示すトレースの（C）はカレント·プロトコル。
Discussion
上記のプロトコルは、1は、M細胞とその同族体からクランプ記録にパッチを適用することができます。テクニックは困難であるとケアは、プロシージャ全体でいくつかの重要な地域で注意が必要です。我々は今、これらの領域のいくつかを議論し、成功を確実にするために役立つヒントを提供します。
解剖/記録チャンバーの構築実験の重要な側面です。 M細胞は、微分干渉コントラストを使用しない限り、参照することは困難である。微分干渉は、清浄なガラス製カバースリップで最適に動作しますが、我々はシルガード（約1〜2 mm）での非常に薄い層は、それがM細胞の同定を妨害する程度に、DICを歪めないことを発見した。したがって、我々は、小さなプラスチックワッシャ（〜5mmの直径）が配置されている際に底部の薄いガラスカバースリップを有する記録チャンバーを使用。私たちは、ペトリ皿にシルガード184をミックスし、慎重にパスツールピペットで座金の内側に液体シルガードを追加します。サイlgardは、数日間にわたって室温で硬化することができ、または急速硬化のために加熱することができる。これは必要ではないが、ワッシャは、シルガードが硬化した後に除去されてもよい。切開/記録チャンバーが行われた後、新鮮なシルガードライニングスライドガラスが必要とされるまでに数週間のために使用することができる。
手順の次のステップは、実験（ 表3）の日に関連するすべてのソリューションを構成することです。 ATPとGTP以外のすべてを含む、細胞内のソリューションは、事前に作られ、-20℃で5ミリリットルのアリコートで保存されているアリコートを記録の日に室温に解凍し、新鮮なATPし、GTPを添加する。溶液を280ミリオスモル、pHを7.4に調整する。私たちの手では、我々は良い録音で日常的結果について、新鮮な、ATPとGTPの添加を見つける。すべてのソリューションは、成功の最善の機会のために無菌に保たれる必要がある。
細胞内のソリューションは、をthrougフィルタリングされなければならないHA0.22μmのフィルター（シグマ）は、記録に影響を与える可能性のある小さな粒子や破片を除去する。これを行うためには、まず、1mlシリンジ内に細胞内液を描く注射器の端部にフィルタを貼付し、加熱して、フィルタの端部に、微細先端部に引っ張らプラスチックピペットチップを追加する。これは、私たちはガラスパッチピペットの内側に直接フィルタリング細胞内液を適用することができます。
溶液が調製されると、胚を麻酔し、解剖することができる。解剖する前に、ケアは十分に生物の年齢を評価するために注意する必要があります。わずかに異なるレートでクラッチの年齢内の各胚。生物の年齢を評価する際にそのため、このような体節の数、体の全体的な形状や卵の受精時などの表現型のキューを使用することにより、確立された手順10,13に従ってそうすることが重要です。すべての解剖はデュモン＃5罰金ペアを用いて行われる鉗子。これらは、それ以外の場合は、後脳と後脳の腹側表面上の任意の結合組織をオーバレイ皮膚を除去することは非常に困難になり、シャープで良好な状態にある必要があります。私たちは、頻繁に使用するのは数週間後に鉗子をシャープにし、シャープの石で、この自分自身を行う必要があります。
SYLGARDの薄い層に魚をピンに、我々は、直径0.001インチ細いタングステン線から作らピンを使用しています。ピンは、解剖顕微鏡下で、古い、顕微解剖はさみで切断し、右脊索を通じて収まるほど小さいですしている。他のどの時点で胚を確保すると、それらを固定化し、実行するために解剖がほとんど不可能になりません。最初の録音を行うことを学ぶと、その同族体（ - rhombomere 5隣接rhombomereに位置しており、特にMID2センチ）から、M細胞のアイデンティティが困難な場合があります。いくつかの胚では、細胞のこれらの2ペアは同じサイズで表示されます。耳石のプロM細胞の同定を支援するために便利なランドマークを見よ。 48でM細胞はすぐ隣の耳石に位置し、HPF、および耳石を解剖中に削除されていても、彼らは元の位置のためのマーカーとして役立つ後脳のわずかに損傷を受けた側方領域を残す。 M-細胞におけるGFPまたはいくつかの他の蛍光マーカーを発現するトランスジェニック魚は、新しい実験者のための優れた製剤を提供。小さいホモログはpFの12月14日に近いながら、私たちの手でM細胞は、48 HPFで約18〜24 pF程度の膜容量を持っている。より大きな表面積を有する細胞は小さい細胞と比較して（ピコファラッド（pFの）で測定される）大きな膜キャパシタンス値を有する。従って、膜容量が大きい細胞は大きな容量値を有するセルサイズの大まかな指標として使用することができる。この電気生理学的特性は、M細胞がその同族体から識別することのできる別のプロパティとして機能します。最後に、我々は多くの場合、LUを使用録音が完了したら、私たちは蛍光イメージングを使用して調査中の細胞型のしっかりした識別を行うことができます私たちの記録（細胞内）ソリューション、黄色cifer。
3.5〜4.5MΩの範囲のピペットチップ抵抗は、通常、8〜15MΩの範囲で、チップサイズと低アクセス抵抗、間の最良の妥協点である。 〜0.1ミリ秒（20から80パーセント）が倍に上昇し、約0.5秒の指数は、12,14,15の減衰（ 図3Aおよび図3B）、これは、高速動態のイベントのために特に重要である。データは50〜100 kHzでデジタル化レートで取得された5〜10キロヘルツの低域通過周波数でフィルタリングされます。パッチピペットに関しては、我々は、彼らが記録を取得するためにファイアーポリッシュする必要がないことを発見したが、逸話的に、それは玄米ピペットと比較して良好なシールを得るためのわずかに良い機会を提供するために表示されます。ピペットチップが比較的大きいので、verを追加しないでくださいソリューションに入る前に、ピペットにYずっと正圧。これは、圧力が過剰にあまりにも多くのセルを移動し、シール形成を防ぐことができますように適用される正圧の適正量に決定する練習が必要です。細胞を穏やかに、元の位置からずれているように、それはまた、シナプスの接点を損傷することがあります。一方、少なすぎる圧力汚れのヒントをもたらし、優れたシールを形成するのに十分細胞の表面をきれいにしません。幸せな媒体は、唯一の重要な実践と経験によって達成される。シール形成は、ピペットに負電圧を印加したアプリケーションとを向上させることができる。私たちは通常、全細胞モードにブレークスルーのための優れている1.2-2GΩのシールを持っています。
薬理学的薬剤は、細胞の細胞質に適用する必要があるとき、私たちは前にピペットを充填する細胞内液に含める。薬剤の損失を回避するために、ピペット溶液を調製する際には注意すべきであるそれは0.22μmのフィルターに結合したことで。したがって、我々はまず、細胞内の媒体をフィルタリングしてから、慎重に濾過した溶液に薬剤を追加します。細胞内コンパートメントへの化合物の適用は課題の独自のセットを持っています。例えば、細胞内の媒体への薬物の追加は、通常、GΩシールを形成する可能性を減少しますが、ポイントには、実験への主要な障害となっていないところ。
一つは、薬剤が細胞全体の構成を開始してからセルへの即時アクセスを持っているので、このように薬理学的薬剤の適用は実験者が最も適切な制御を記録することはできませんことを認識すべきである。我々はこの種の実験全体のデータを記録しつつ、1は次善の制御は、エージェントの不活性型の細胞内アプリケーションであることを認識する必要があります。多くの場合において、これは、熱不活性化化合物の形態、スクランブルペプチドoをを取り供給業者から入手した非アクティブな異性R。
私たちは、シナプス電流（用いるMPSC）、電位依存性電流と活動電位の形式でデータを取得する。我々は、Axograph X（ジョン·クレメンツ）を使用することを好むが、ミニチュア電流は、いくつかの優れたプログラム（PCLAMP、Axographなど）によって分析することができる。 Axograph Xは、WindowsとMacintoshの両方のプラットフォーム上で動作し、電気生理学的データの収集と分析の両方に使用することができます。 mEPCs記録自体から得た実験者が選択したテンプレートを用いて取得される。個々のイベントは、我々はAxograph Xからのイベントトレースのコピーを含む、数字を生成することができますカレイダグラフ（シナジーソフトウェア）へのデータのスプレッドシートをエクスポートするなど、立ち上がり時間、振幅、半値幅および減衰時間などの特性について分析することができる
実験のより困難な側面の一つは、記録がクリーンを提供するのに十分行われたか否かを決定することである信頼性の高いデータ。例えば、スペースのクランプの問題は、大規模な軸索と豊富な樹状突起を持つM細胞からの記録用いるMPSCを生じることがある。電圧クランプは、1は、一般的に（アクセス抵抗（R A）が低い場合は特に）合理的にピペットの先端に電圧を制御することができますが、遠く離れている樹状突起や軸索における膜電位を適切に制御することはできませれる場合があります離れてピペットチップから。細胞が適切にクランプスペースであったかどうかを決定する一つの方法は、記録された振幅対用いるMPSC立ち上がり時間の散布図を生成することである。データ間の相関性が不十分なスペースクランプを示唆する。宇宙クランプが悪いと言い換えると、ピペットに近い発生用いるMPSCイベントが離れてピペットからある程度の距離を発生するよりも立ち上がり時間と大きな振幅が迅速になります。相関が存在する場合、データは問題があり、使用することができない。
別の側面アドレス指定される必要がある電気生理学的記録のリーク電流のことである。電圧は、例えば、Na +又はK +電流のような電位依存性電流を記録するために、細胞をクランプする場合に特に当てはまる。膜電位は、他の部分からずれた場合、リーク電流は、電位依存性活性と一緒に記録することができる。リーク電流（I Lが）、カリウムの組み合わせ（I、K）、ナトリウム（I Na）の非電位依存性チャネルを介した塩化物（I Cl）の電流は、関心のある活動を不明瞭にし、レコーディングから差し引かなければならない。増幅器は、典型的には、P / Nプロトコルと呼ばれるものを実行することにより、記録中にオンラインで、この機能を実行することができる。 P / Nプロトコルの間にアンプが他の部分からいくつかの小さな脱分極（または過分極）を実行し、発生した結果、リーク電流を記録します。これは、電位依存性チャネルを活性化しない、十分に小さいパルスを使用することが重要です。現在のこれらのパルス中に発生するのを記録し、これらのリーク電流は、電位依存性チャネル活性から減算することができるように平均化される。
最後に、1を考慮に細胞内および細胞外のソリューション間の電極の先端に発生する接合電位を取る必要があります。細胞内および細胞外液は、通常、異なる活動や移動度を有する、異なるイオンで構成されています。低移動度を有する大きなイオンは小さいものよりもイオンの移動に大きな抵抗率を提供し、これは解決策の接合部に小さいが重要な電位差になることがあります。セルによって経験される適切な電圧を決定するときに、この接合部電位を考慮しなければならない。
ここで紹介するテクニックは、長年にわたって私たちの研究室で使用されるものです。しかし、M細胞からの記録の代替方法があります。最も顕著なのは、ジョセフFetchoらが開発している1は、M-細胞は背側表面16からアプローチされているここで紹介するよりも、低侵襲的に（4-5日齢）の古い幼虫のM細胞から録音することが可能な優れた準備編私たちは、同様の手法を試みたが、それが簡単に、細胞が特に稚魚（ すなわち 24 HPF HPF〜72）で、脳の表面に近い後脳の腹側からのM細胞に近づくことがわかった。さらに、背側表面からのアプローチは、通常、記録に追加の変数を導入する可能性を秘めているのM細胞に蛍光タグを発現するトランスジェニックラインを使用する必要があります。野生型の魚を使用した場合、この問題は存在しない。しかし、ここで紹介する手法では、我々は、若い動物（72 HPFに24 HPF）を勉強しに限定されている。このように、各アプローチには利点と制限があります。
スチューデントのt検定分析は、Varianの間にデータの2つのグループを比較するために使用することができるCEの（ANOVA）は、複数の群を比較するために使用することができる。ケアはノンパラメトリック·データVSパラメトリックのための適切な事後検定を選択するように注意する必要があります。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）とDWAへのイノベーションのためのカナダの財団（CFI）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 | |
| 0.001" Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 | |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, 5, University of oregon Press. (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
