Summary
Парабиотического соединение двух организмов приводит к развитию общей системы кровообращения. В этом протоколе, мы описываем хирургические шаги по формированию парабиотического связь между мыши дикого типа и конститутивного GFP-экспрессирующих мыши.
Abstract
Парабиозе это хирургическая объединение двух организмов, позволяющих совместное использование кровообращения. Прикрепление кожу двух животных способствует формированию микрососудов в месте воспаления. Парабиотического партнеры поделиться своими циркулирующих антигенов и, следовательно, свободны от неблагоприятного иммунной реакции. Впервые описан Paul Bert в 1864 году 1, парабиозом операция была уточнена Бунстер и Мейера в 1933 для улучшения выживаемости животных 2. В текущем протокола, две мыши хирургически соединены следующие модификации Бунстер и Meyer техники. Животные подключены через локтевых и коленных суставов, после чего прикрепления кожи, позволяющей твердую поддержку, которая предотвращает нагрузку на ушивают кожи. Здесь мы подробно парабиотического присоединения вездесущий GFP, выражающей мыши дикого типа (WT) мыши. Через две недели после процедуры пара отделяется и GFP-положительных клеток могут быть обнаружены с помощью анализа проточной цитометрии в циркулирующей кровиион мыши мас. Химеризм крови позволяет изучить вклад циркулирующих клеток из одного животного в другой.
Introduction
Парабиозе, хирургическое соединение двух организмов, был впервые описан в 1864 году Полом Bert как способ разработки модель для изучения общих кровеносной систем и состоял из присоединение кожи и мышечных стенок двух крыс 1. Парабиозе способствует формированию микрососудов в месте воспаления 3 и имел несколько приложений в физиологических исследований, такие как гормональный связи между гипофизом и половыми железами, а также роли почек при гипертонической болезни 4. Кроме того, было использован для расследования вербовки и интеграции клеток-предшественников в неоваскуляризации 5, миграции гемопоэтических стволовых клеток 6 и торговли лимфоцитов 7, а также роли и кинетики циркулирующих воспалительных или стволовых клеток в метастазирования опухоли 8,9, и нейродегенеративные заболевания 10.
Одним из важных преимуществ парабиозе лжив том, что партнерские отношения животные имеют общие циркулирующие антигены, что позволяет миграцию клеток и образование новых сосудов, не вызывая иммунологическую реакцию. Важно отметить, что Вайсман и др.. Показали, что парабиозе между мужской и женской мышей не приводит к образованию анти HY антитела 11.
В оригинальной методике, описанной Полом Берт два животных были объединены через соединение кожи и мышечных стенок 1. Этот метод, однако, вызвало значительную нагрузку на животных и в результате высокой смертности из-за инфекции раны. С тех пор техника парабиозом был пересмотрен несколько групп с наиболее преобладающим является протокол, предложенный Бунстер и Мейера в 1933 2. Их метод включены присоединения лопатки суставов, полостей тела, и кожу, что позволяет более эффективную поддержку и меньше боли для животных. В то же время, новый метод привел к минимальной послеоперационного ухода и существенноственно снизилась смертность. Протокол, описанный здесь, является модификацией метода Бунстер и Meyer, что является менее инвазивным и позволяет тверже присоединения. А именно, мыши соединены через локтевых и коленных суставов, а также кожи. Это предотвращает присоединение расширение кожи и, следовательно, в меньшей степени вызывает боль и осложнений. Здесь мы опишем присоединение дикого типа (WT) взрослых мышей с конститутивным GFP, выражающей мыши. Мы показываем, что через две недели после операции мы можем достичь 50% химеризма крови демонстрируя эффективность этой хирургической процедуры, чтобы создать общую систему кровообращения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами уходу и использованию животных комитета Калифорнийского университета и Национального института Руководство здравоохранения для уходу и использованию лабораторных животных. Продолжительность процедуры, описанной ниже примерно 45-60 мин от начала до конца.
1. Подготовка операционного поля
- Выполните процедуру в чистом животных операционной.
- Оборудование: изофлюран испаритель, Gaymer Т насос с грелку.
- Стерильные инструменты: две изогнутые щипцы, тонкие ножницы, иглодержатель.
- Стерильные перчатки должны быть использованы в течение всей процедуры.
2. Подготовка животных
- Поместите два мужских или женских мышей, от же генетического фона, аналогичного веса и размера в одной клетке и контролировать по крайней мере две недели, чтобы обеспечить гармоничное сожительство. Самок мышей являются предпочтительными из-за их менее агрессивное поведение.
- Обезболить животных пос помощью ИФ испаритель. Место мышей в позитив-Seal индукции камеры соединен с изофлуран испаритель (4-5% об / об). После анестезии индуцируется, передавать животное в зоне бритья меха и поддерживать анестезию в течение всей процедуры через носового конуса, соединенного с изофлуран (1,5-2% об / об). Применить глазной мази с ватной палочкой, чтобы предотвратить сухость глаз.
- Место животное на положении лежа на спине. Тщательно брить левую сторону мыши Расположенные слева и справа от мыши, размещенной на право, начиная с примерно на 1 см выше локтя, чтобы 1 см ниже колена.
- Консерванта подготовить бритые области, тщательно вытирая (2-3x) бетадином пропитанной салфетки с последующим спиртовыми салфетками. Поместите мышей на нагретой подушки, покрытой стерильной площадку.
- Для обезболивания, администрирование Carprofen и бупренорфин внутрибрюшинно или подкожно в дозе 10 мг / кг и 0,1 мг / кг соответственно.
- Поместите животных на их стороне, спиной к спине, сdjacent бритые области вверх. Во избежание загрязнения хирургической области, покрыть мышей с стерильной драпировки подвергая только область работы. Создать небольшое отверстие драпировать остаться стерильным при выполнении операции. Мы сделали окно портьера большой, чтобы иметь лучшее осмотр во время видеозаписи.
3. Парабиоз
- Используя острый ножницы, выполнять продольные разрезы кожи с бритыми сторон каждого животного в 0,5 см над локтем всю дорогу до 0,5 см ниже коленного сустава (рис. 1). После разреза, осторожно отделить кожу от подкожной фасции, удерживая кожу с парой изогнутых щипцов и отделить панель со второй парой, чтобы создать 0,5 см свободного кожи. Выполните это разделение по всей разрез.
- Начало присоединения путем присоединения левого локтевого отростка одного животного в нужное отростка другого. Оба olecranons и коленные суставы ясно различимы следующие йэ кожи разрез. Для облегчения присоединения, согните локоть первого мыши и передать иглу нерассасывающегося 3-0 шва под локтевого отростка. Точно так же, согнуть локоть второй мыши и передать тот же шов под ним. Прикрепите суставы плотно двойной хирургического узла.
- Подключите коленные суставы в том же порядке.
- После прикрепления суставов, подключите кожу двух животных с непрерывным рассасывающиеся 5-0 Vicryl шов, начиная снизу от локтя к колену. Для предотвращения трещин кожи и разделение выполнить плотное закрытие шва кожи в области вокруг локтей и коленей. После того, как брюшной привязанность кожа была завершена, выполните двойной хирургического узел. Поместите мышей в положении лежа и продолжить шовный дорсально заканчивая двойной хирургического узла. Проверьте непрерывность шва и подтвердить отсутствие отверстий.
- Администрирование 0,5 мл 0,9% NaCl подкожно каждой мыши, чтобы предотвратить дегидратацииdration.
4. Послеоперационного восстановления
- Держать животных на нагретую площадку до выздоровления.
- После восстановления, обеспечить анальгетики карпрофена и бупренорфин. Повторите внутрибрюшинно или подкожно каждые 24 и 12 ч, соответственно, в течение 48 ч в тех же дозах, описанных выше (этап 2.5). Монитор животных на наличие признаков боли и страданий, таких как дрожь, вялость, жевательной хвоста, выгнутая спина, отсутствие ухода и т.д. в день в течение двух недель.
- Профилактически, лечения мышей с Сульфаметоксазол / Триметоприм пероральной суспензии в их бутылки с водой 2 мг серосодержащие / мл 0,4 мг отделкой / мл в течение 10 дней для предотвращения бактериальных инфекций.
- Дом друг парабиотического пара в чистом клетке с монолитной подстилки (например бумажных полотенец или абсорбент стерильной площадки), чтобы предотвратить стремление подстилки. Вернуться животных в постельных принадлежностей заполнено клетке, когда они в состоянии поддерживать грудины лежачее положение с их головы вверх. Чтобы свести к минимуму нагрузкудостижения в пищу во время настройки, чтобы парабиотического существования, место смоченные пищевые гранулы на полу клетки. Обеспечить вложенности материала. Через 1-2 недели парабиотического мыши имеют возможность передвигаться нормально на хирургическим парных передних и задних-конечностей.
- Кровь химеризм происходит через 10-14 дней после операции.
5. Подтверждение и обратную процедуру
- После двух недель нарисовать кровь из хвостовой вены каждой мыши для потока цитометрии анализа для подтверждения химеризм крови (рис. 3).
- Обработка крови для анализа проточной цитометрии: разбавить 2-3 капли крови в 500 мкл 10 мМ ЭДТА. Добавить 500 мкл 2%-декстрана (разведенного в PBS), тщательно перемешивают и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Передача супернатант в новую пробирку, спина при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин и ресуспендируют осажденные клетки в PBS (или другой буфер) для анализа проточной цитометрии.
- В зависимости от эксперимента, парабиотического пара могут быть разделеныт более поздние моменты времени. По нашему опыту, мы сохранили parabiosed пар до 9 месяцев без каких-либо осложнений.
- Производить обратную процедуру на стерильной хирургической поверхности. Обезболить мышей, помещая их в индукционной камере, соединенной с изофлуран испаритель (4-5%) и поддерживать анестезию с 1,5-2% изофлуран, как описано выше (этап 2.2).
- Удалить волосы из района, прилегающего первоначальный шов и асептически подготовить бритые области, как описано выше (шаги 2.3, 2.4).
- Для обезболивания, администрирование Carprofen и бупренорфин внутрибрюшинно или подкожно в дозе 10 мг / кг и 0,1 мг / кг, соответственно.
- Крышка хирургическую область стерильной драпировки, как описано выше (этап 2.6).
- Использование острыми ножницами, отделить мышей через продольного разреза вдоль боковых шва и осторожно отделить вновь образованных фасции между двумя мышей с парой изогнутых щипцов. Чтобы отделить суставы, вырезать узлы швасоединяя их. Аккуратный от кожу вдоль разреза для достижения гладкие края и прикрепить кожу абсорбируемого непрерывного 5-0 покрытием викрил шва.
- Чтобы предотвратить обезвоживание, администрирование 0,5 мл 0,9% NaCl подкожно каждой мыши. Держать животных на нагретую площадку до выздоровления.
- После выздоровления, повторите анальгетик администрирование, карпрофен (10 мг / кг) каждые 24 ч и бупренорфин (0,1 мг / кг) каждые 12 ч в течение 48 часов.
- Для предотвращения бактериальных инфекций лечения мышей с Сульфаметоксазол / Триметоприм пероральной суспензии (2 мг серосодержащие / мл 0,4 мг отделка / мл) в их бутылки с водой в течение 10 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ожидаемый результат парабиозе двух организмов равна вклад сосудистой системы каждого животного к общей кровообращения (рис. 2). Легко проверить, успешное уравновешивание кровью parabiosed WT и GFP положительного мышей по проточной цитометрии анализа. Здесь венозной крови получали из хвостов обоих parabionts через 2 недели после операции и фракционировали на клетках периферической крови (эритроцитов, чтобы исключить). Гемопоэтических полученные фракции фракционируют клеток затем анализировали с помощью проточной цитометрии на наличие положительной и GFP дикого типа клеток. В соответствии с предыдущими исследованиями, кровь из WT мыши показали наличие химеризма, как указано приблизительно половиной GFP положительных и половиной WT клеток крови (53% WT клеток и 47% GFP клетки) (рис. 3).
Рисунок 1. Parabioсестра хирургия:. сайт разрез Боковые стороны наркозом животных побрился и продольные разрезы кожи выполняются (пристрастилась область) от 0,5 см выше локтя до 0,5 см ниже коленного сустава.
Рисунок 2. Схематическое изображение способа парабиозе.) Соединение из WT мыши (левой) к положительному GFP мыши (справа). B) Примерно две недели после хирургического крепления, новый микрососудов образуется в месте, где две мыши соединены позволяет присоединение кровообращения.
Рисунок 3. Кровь химеризм из парабиотического партнеров. Цитометрический анализ образца крови, собранной из парабиотического партнера WT двух недель после хирургического присоединения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод парабиозом обсуждается здесь представляет минимальные технические трудности и приводит к низкой смертности. Крепление коленных и локтевых суставов является значительное улучшение Бунстер и Meyer техники. Тем не менее, процедура остается инвазивной таким образом поддержание стерильных условиях всей операции является обязательным условием. Для дальнейшего предотвращения инфицирования хирургического участка, важно, что parabiosed животные получают комбинацию антибиотиков и контролироваться на регулярной основе. Для обеспечения твердой поддержке и предотвратить боль, шов, соединяющий локти и колени должны окружать суставы, а не проходя через ткани.
В качестве альтернативы изофлуран ингаляции обезболивание может быть вызван с использованием внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина или других анестезирующих препаратов, одобренных институциональных комитетами. Преимущество использования изофлуран, что он может быстро анестезии и значительно уменьшить Recovery время. Кроме того, уровень анестезии можно точно контролировать.
Парабиозе, что позволяет кровеносной систем из двух животных, чтобы объединять и равновесие, является мощным экспериментальная процедура для физиологических исследований. Она представляет ряд преимуществ для других часто используемых методов, таких как трансплантация костного мозга или инъекции клеток. Процедуры поставки сотового, время от времени, обеспечивают короткое окно для изучения влияния трансплантированных клеток. Кроме того, подавление иммунитета увеличивает риск инфекции и последующей заболеваемости и смертности. Тем не менее, с парабиозе можно поддерживать химерный циркуляцию в течение длительных периодов времени и исследования циркулирующих факторов (клетки, цитокины и др.) независимо от их происхождения. Эта система может быть использована для определения роли циркулирующих клеток при заживлении ран, образование опухолей, старения, регенерации и воспалительной реакции, среди многих других.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Adriane Мосли и Libuše Jerabek (Stanford) за помощь в хирургической техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
