Summary
Parabiotic sammenføjning af to organismer fører til udvikling af en fælles kredsløbssygdomme. I denne protokol, beskriver vi de kirurgiske trin at danne en parabiotic forbindelse mellem en vildtype-mus og en konstitutiv GFP-udtrykkende mus.
Abstract
Parabiosis er en kirurgisk forening af to organismer muliggør deling af blodcirkulationen. Montering af huden af to dyr fremmer dannelsen af mikrokar ved inflammationsstedet. Parabiotic partnere deler deres cirkulerende antigener og dermed er fri for skadelig immunreaktion. Først beskrevet af Paul Bert i 1864 1 blev parabiosis kirurgi raffineret af Bunster og Meyer i 1933 for at forbedre dyrs overlevelse 2. I den nuværende protokol, der er to mus kirurgisk sluttede efter en ændring af Bunster og Meyer teknik. Dyrene er tilsluttet via albue og knæled efterfulgt af fastgørelse af huden giver fast støtte, der forhindrer pres på sutureres hud. Heri beskriver vi i detaljer parabiotic sammenføjning af en allestedsnærværende GFP udtrykke musen til en vildtype (WT) mus. To uger efter den procedure, der er parret separeret, og GFP-positive celler kan påvises ved flowcytometrisk analyse i blodet circulation WT mus. Blodet kimærisme tillader en at undersøge bidraget fra de cirkulerende celler fra et dyr i den anden.
Introduction
Parabiosis, kirurgisk sammenføjning af to organismer, blev første gang beskrevet i 1864 af Paul Bert som en måde at udvikle en model til at studere delte kredsløbssystemet og bestod af sammenføjning af huden og muskulære vægge af to rotter 1. Parabiosis fremmer dannelsen af mikrokar ved inflammationsstedet 3 og har haft adskillige anvendelser i fysiologiske studier, såsom hormonale kommunikation mellem hypofysen og kønskirtler samt rolle i nyren hypertension 4. Det er desuden blevet anvendt til at undersøge rekruttering og integration af stamceller i neovaskularisering 5, migration af hæmatopoietiske stamceller 6 og lymfocyttrafik 7 samt rolle og kinetik af cirkulerende inflammatoriske eller stamceller i tumormetastase 8,9, og neurodegenerativ sygdom 10.
En væsentlig fordel ved parabiosis liggeri, at de indgået partnerskab dyr deler fælles cirkulerende antigener, så celle migration og neovaskularisering uden at udløse en immunologisk reaktion. Vigtigere er det, Weissman et al. Har vist, at parabiosis mellem mandlige og kvindelige mus ikke fører til dannelse af anti HY antistoffer 11.
I den oprindelige protokol, der er beskrevet af Paul Bert de to dyr blev sammenføjet gennem tilslutning af hud og muskel vægge 1. Denne metode imidlertid forårsaget betydelig belastning af dyrene og resulterede i høj dødelighed på grund af infektion af såret. Siden da parabiosis teknikken er blevet revideret af flere grupper med de mest fremherskende er den af Bunster og Meyer foreslog i 1933 2 protokol. Deres metode omfattede sammenføjning af skulderbladshovederne leddene, legemshuler og hud, hvilket tillader bedre støtte og mindre smerte for dyrene. Samtidig den nye metode resulterede i minimal post-operativ pleje og betydeligtligt nedsat dødelighed. Den heri beskrevne protokol er en modifikation af Bunster og Meyer teknik, der er mindre invasiv og tillader fastere sammenføjning. Nemlig mus forbundet gennem albuen og knæled samt huden. Denne sammenføjning forhindrer udvidelse af hud og derfor forårsager mindre smerte og komplikationer. Her beskriver vi sammenføjning af en vildtype (WT) voksen mus til en konstitutiv GFP udtrykker mus. Vi viser, at to uger efter operationen kan vi opnå demonstrere effektiviteten af denne kirurgiske procedure for at skabe en delt kredsløbssygdomme 50% af blod kimærisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske undersøgelser blev udført i henhold til retningslinjerne i UCLA Dyrepleje og brug udvalg og National Institutes of Health Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Varigheden af den procedure, der er beskrevet nedenfor, er ca 45-60 min fra start til slut.
1.. Fremstilling af kirurgiske område
- Proceduren skal udføres i et rent Dyrekirurgien værelse.
- Udstyr: isofluran fordamper, Gaymer T Pumpe med varmepude.
- Sterile værktøjer: to buede pincet, fine saks, nål indehaver.
- Sterile handsker skal anvendes under hele proceduren.
2. Fremstilling af Dyr
- Placer to mandlige eller kvindelige mus fra samme genetiske baggrund, af samme vægt og størrelse i samme bur og overvåge i mindst to uger for at sikre en harmonisk samliv. Hunmus foretrækkes på grund af deres mindre aggressiv adfærd.
- Bedøver dyr vedved hjælp af en isofluran fordamper. Place mus i en Posi-Seal Induktion Afdeling tilsluttet isofluran fordamper (4-5% v / v). Når anæstesi fremkaldes overføres dyret for pels barbering område og opretholde anæstesi under hele proceduren ved hjælp af en næse kegle forbundet med isofluran (1,5-2% v / v). Påfør oftalmologiske salve med en Q-tip til at forhindre tørre øjne.
- Placer dyret på liggende stilling. Grundigt barbere venstre side af musen placeret på højre og venstre side af musen placeret på højre begyndende ved 1 cm over albuen til 1 cm under knæet.
- Aseptisk forberede den barberede områder ved grundigt at tørre (2-3x) med betadin-gennemblødt klude efterfulgt af spritservietter. Placer mus på en opvarmet pude er dækket af en steril pad.
- Analgetika, administrere Carprofen og Buprenorphin intraperitonealt eller subkutant i en dosis på 10 mg / kg og 0,1 mg / kg.
- Placer dyr på deres side, ryg mod ryg, med endjacent barberet områder, der står op. For at undgå enhver forurening af det kirurgiske område, dække mus med et sterilt afdækningsstykke udsætter kun operationsområdet. Opret en lille drapere åbning til at blive steril, når du udfører operationen. Vi gjorde drapere vinduet store at have en bedre visning under videooptagelser.
3. Parabiosis
- Ved hjælp af en skarp saks, udfører langsgående snit i huden på den barberede side af hvert dyr fra 0,5 cm over albuen hele vejen til 0,5 cm under knæleddet (Figur 1). Efter indsnit forsigtigt løsne skindet fra subkutan fascia ved at holde huden med et par krumme pincet og adskil fascia med et andet par til at skabe 0,5 cm fri hud. Udfør denne adskillelse langs hele snittet.
- Begynd sammenføjningen ved at fastgøre venstre olecranon af ét dyr til højre olecranon af den anden. Både olecranons og knæled klart adskiller følgende the hudincision. For at lette sammenføjningen at bøje albuen af den første mus og videregive nålen i den ikke-absorberbare 3-0 sutur under olecranon. Tilsvarende bøje albuen af den anden mus og videregive den samme sutur under det. Vedhæft leddene tæt ved en dobbelt kirurgisk knude.
- Tilslut knæleddene efter samme procedure.
- Efter fastgørelse af leddene, tilslut huden på de to dyr med en kontinuerlig resorberbare 5-0 Vicryl sutur starter ventralt fra albuen mod knæet. For at forhindre huden brud og adskillelse udføre en stram sutur lukning af huden i området omkring albuer og knæ. Når den ventrale fastgørelse huden er blevet afsluttet, udføres en dobbelt kirurgiske knude. Placer musene i bugleje og fortsætte suturen dorsalt slutter med en dobbelt kirurgisk knude. Kontroller kontinuiteten i suturen og bekræft manglen på åbninger.
- Administrere 0,5 ml 0,9% NaCI subkutant til hver mus for at forhindre dehydration.
4.. Postoperativ Recovery
- Hold dyr på opvarmet pad indtil bedring.
- Efter nyttiggørelse, anføres analgetika carprofen og buprenorphin. Gentag intraperitonealt eller subkutant hver 24 og 12 timer, henholdsvis for 48 timer ved de samme doser som beskrevet ovenfor (trin 2.5). Overvåg dyr for tegn på smerte og lidelse, såsom rysten, sløvhed, tygning af hale, buet ryg, mangel på grooming osv. dagligt i to uger.
- Profylaktisk behandling af mus med sulfamethoxazol / trimethoprim oral suspension i deres vandflaske 2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml i 10 dage for at forhindre bakterieinfektioner.
- Hus hver parabiotic par i en ren bur med monolitisk strøelse (f.eks køkkenrulle eller absorberende steril pude) for at forhindre aspiration af strøelse. Tilbagesende dyrene til en strøelse fyldt bur, når de er i stand til at opretholde brystleje med deres hoved op. For at minimere belastningenfor at nå til mad, mens du justerer til parabiotic eksistens, skal du placere den fugtede foderpiller på buret gulvet. Giv redemateriale. I 1-2 uger parabiotic mus har evnen til at ambulate normalt på kirurgisk parrede for-og bagben-lemmer.
- Blood kimærisme sker 10-14 dage efter operationen.
5.. Bekræftelse og omvendt rækkefølge
- Efter to ugers trække blod fra halevenerne af hver mus for flowcytometrisk analyse for at bekræfte blod kimærisme (figur 3).
- Blood behandling til flowcytometrisk analyse fortyndes 2-3 dråber blod i 500 pi af 10 mM EDTA. Tilsæt 500 pi 2% dextran (fortyndet i PBS), blandes og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Supernatanten overføres i et nyt rør, centrifugering ved 1.200 rpm i 5 min og resuspenderes de pelleterede celler i PBS (eller en anden puffer) til flowcytometrisk analyse.
- Afhængig af eksperimentelle design, kan den parabiotic par adskilles ett senere tidspunkter. Det er vores erfaring, har vi fastholdt parabiosed par for op til 9 måneder uden nogen komplikationer.
- Udfør omvendt procedure på en steril kirurgisk overflade. Bedøve musene ved at placere dem i en induktion kammer forbundet til en isofluran fordamper (4-5%) og opretholde anæstesi med 1,5-2% isofluran, som beskrevet ovenfor (trin 2.2).
- Fjerne hår fra området omkring den indledende sutur og aseptisk forberede den barberede områder som beskrevet ovenfor (trin 2.3, 2.4).
- Analgetika, administrere Carprofen og Buprenorphin intraperitonealt eller subkutant i en dosis på 10 mg / kg og 0,1 mg / kg.
- Dæk kirurgiske område med et sterilt afdækningsstykke som beskrevet ovenfor (trin 2.6).
- Ved hjælp af en skarp saks, adskille mus gennem et langsgående snit langs den laterale sutur og forsigtigt afmontere nydannede fascia mellem de to mus med et par buede pincet. For at adskille leddene, klippe knuderne af suturforbinder dem. Skær huden langs snit til at opnå glatte kanter og vedhæfte huden med en absorberbar kontinuerlig 5-0 coated Vicryl sutur.
- For at undgå dehydrering, administrere 0,5 ml 0,9% NaCI subkutant til hver mus. Hold dyr på opvarmet pad indtil bedring.
- Efter inddrivelsen, gentag smertestillende administration, carprofen (10 mg / kg) hver 24 timer og buprenorphin (0,1 mg / kg) hver 12 timer til 48 timer.
- At forebygge bakterielle infektioner behandle mus med sulfamethoxazol / trimethoprim oral suspension (2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml) i deres vandflaske i 10 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det forventede resultat af parabiosis af to organismer er lige bidrag for hvert dyr kredsløbssygdomme til en fælles blodcirkulation (figur 2). Man kan nemt bekræfte vellykket ligevægt af blod parabiosed WT og GFP positive mus ved flowcytometrisk analyse. Her blev venøst blod fra halerne af begge parabionts ved 2 uger efter kirurgi og blev fraktioneret til perifere blodceller (for at udelukke erytrocytter). Den fraktionerede cellefraktion hæmatopoietisk afledte blev efterfølgende analyseret ved flowcytometri for tilstedeværelsen af GFP positive og WT-celler. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, blod fra WT mus afslørede tilstedeværelse af kimærisme, som indikeret ved cirka halvdelen GFP-positive og halvdelen WT blodlegemer (53 vægt% celler og 47% GFP-celler) (figur 3).
Figur 1. Parabiosis kirurgi:. incisionsstedet De laterale sider af bedøvede dyr barberet og langsgående snit i huden udføres (forgudedeRobin område) fra 0,5 cm over albuen til 0,5 cm under knæleddet.
Figur 2. Skematisk repræsentation af parabiosis metoden. A) Samling af en WT mus (venstre) til et GFP positive mus (til højre). B) Cirka to uger efter kirurgisk fastgørelse er ny mikrovaskulatur dannet på det sted, hvor de to mus er forbundet tillader sammenføjning af blodcirkulationen.
Figur 3. Blood kimærisme af parabiotic partnere Flowcytometrisk analyse af blodprøve opsamlet fra WT parabiotic partner to uger efter kirurgisk sammenføjning..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den parabiosis metode diskuteres her præsenterer minimal tekniske vanskeligheder og resultater i lav dødelighed. Udlæg i knæene og albuerne er en væsentlig forbedring af Bunster og Meyer teknik. Men den procedure forbliver invasive dermed vedligeholdelse af sterile forhold i hele operationen er bydende nødvendigt. For yderligere at forebygge infektion af det kirurgiske websted, er det vigtigt, at parabiosed dyrene får en kombination af antibiotika og kontrolleres regelmæssigt. For at sikre en fast støtte og forhindre smerte, bør suturen forbinder albuer og knæ omgiver leddene i stedet passerer igennem vævet.
Som et alternativ til isofluran inhalering kan anæstesi induceres med anvendelse af intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin eller andre anæstetika, der er godkendt af institutionelle udvalg. Fordelen ved anvendelse af isofluran er, at det hurtigt kan inducere anæstesi og reducere recovery tid. Endvidere kan niveauet af anæstesi styres præcist.
Parabiosis, som giver kredsløbssystemet fra to dyr commingle og tempereres, er en kraftig eksperimentel procedure for fysiologiske studier. Det præsenterer adskillige fordele til andre almindeligt anvendte teknikker, såsom knoglemarvstransplantation eller celle injektion. Cell levering procedurer, til tider give en kort vindue for at undersøge effekten af transplanterede celler. Desuden immunosuppression øger risikoen for infektion og efterfølgende morbiditet og mortalitet. Men med parabiosis man kan opretholde en kimære cirkulation i lange perioder og studere cirkulerende faktorer (celler, cytokiner, osv.), uanset disses oprindelse. Dette system kan anvendes til at bestemme den rolle af cirkulerende celler i sårheling, tumordannelse, aldring, regenerering og inflammatorisk respons, blandt mange andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Adriane Mosley og Libuse Jerabek (Stanford) for at få hjælp med den kirurgiske teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
