Summary
Parabiose Verbinden von zwei Organismen führt zu der Entwicklung einer gemeinsamen Kreislauf. In diesem Protokoll beschreiben wir die OP-Schritte, um eine Verbindung zwischen einem Parabiose Wildtyp-Maus und einem konstitutiven GFP-exprimierenden Maus bilden.
Abstract
Parabiose ist eine chirurgische Verbindung von zwei Organismen ermöglicht die gemeinsame Nutzung von den Blutkreislauf. Anbringen der Haut von zwei Tieren fördert die Bildung von Mikrogefäß am Ort der Entzündung. Parabiose Partner teilen ihre zirkulierende Antigene und sind somit frei von unerwünschten Immunreaktion. Zuerst von Paul Bert 1864 1 beschrieben, wurde die Operation durch Parabiose Bunster und Meyer im Jahr 1933 weiterentwickelt, um das Überleben der Tiere 2 zu verbessern. Im aktuellen Protokoll werden zwei Mäuse chirurgisch nach einer Modifikation der Bunster und Meyer Technik verbunden. Die Tiere werden durch die Ellbogen-und Kniegelenke, gefolgt von Befestigung der Haut ermöglicht feste Unterstützung, die Belastung der Haut vernäht verhindert verbunden. Hier beschreiben wir im Detail die Parabiose Verbindung von einer allgegenwärtigen GFP-exprimierenden Maus zu einer Wildtyp (WT)-Maus. Zwei Wochen nach dem Eingriff wird das Paar getrennt und im Blut zirkulierenden GFP-positive Zellen durch durchflusszytometrische Analyse nachgewiesen werdenIon der WT-Maus. Das Blut Chimärismus ermöglicht es, den Beitrag der zirkulierenden Zellen von einem Tier in dem anderen zu prüfen.
Introduction
Parabiose, die chirurgische Verbindung von zwei Organismen, wurde erstmals 1864 von Paul Bert als eine Möglichkeit, ein Modell zur gemeinsamen Kreislaufsystem entwickeln zu studieren beschrieben und bestand aus der Verbindung von der Haut und Muskelwände von zwei Ratten ein. Parabiose fördert die Bildung von Mikrogefäße an der Stelle der Entzündung und 3 hat mehrere Anwendungen in physiologischen Untersuchungen, wie die Hormonverbindung zwischen der Hypophyse und Gonaden sowie die Rolle der Niere bei Hypertonie 4 hatte. Es wurde weiter eingesetzt worden, um die Rekrutierung und Integration von Vorläuferzellen in Neovaskularisation 5, Migration von hämatopoetischen Stammzellen 6 und Lymphozyten-7, sowie die Rolle und die Kinetik der zirkulierenden Entzündungs oder Stammzellen bei der Tumormetastasierung 8,9 zu untersuchen, und neurodegenerativen Erkrankung 10.
Ein wesentlicher Vorteil liegt Parabiose, dass die Tiere eine Partnerschaft gemeinsame zirkulierenden Antigene, so dass die Zellmigration und Gefäßneubildung ohne Auslösung einer immunologischen Reaktion. Wichtig ist, Weissman et al. Haben, dass Parabiose zwischen männlichen und weiblichen Mäusen gezeigt, nicht zur Bildung von Anti-Antikörpern führen HY 11.
In dem von Paul Bert beschrieben Original-Protokoll wurden die beiden Tiere zusammen durch Anschluss der Haut-und Muskelwände 1 verbunden. Dieses Verfahren jedoch eine erhebliche Belastung für die Tiere und führte zu hoher Mortalität aufgrund einer Infektion der Wunde. Seitdem ist die Parabiose Technik wurde von mehreren Gruppen mit den meisten vorherrschende wobei der durch Bunster und Meyer 1933 2 vorgeschlagene Protokoll überarbeitet. Ihre Methode enthalten Verbinden der Schulterblatt Gelenken, Körperhöhlen, und die Haut und ermöglicht eine bessere Unterstützung und weniger Schmerzen für die Tiere. Zur gleichen Zeit führte die neue Methode in minimal post-operative Betreuung und der wesentlichenlich verringerte Sterblichkeit. Das hierin beschriebene Protokoll ist eine Abwandlung der Bunster und Meyer Technik, die weniger invasiv ist und ermöglicht festere Verbindung. Nämlich werden die Mäuse durch die Ellbogen-und Kniegelenke sowie der Haut verbunden. Diese Verbindung verhindert Verlängerung der Haut und verursacht daher weniger Schmerzen und Komplikationen. Hier beschreiben wir die Verbindung von einem Wildtyp (WT) erwachsenen Maus mit einem konstitutiven GFP-exprimierenden Maus. Wir zeigen, dass zwei Wochen nach der Operation können wir 50% der Blut Chimärismus zu erreichen, die die Wirksamkeit dieser chirurgischen Verfahren, um einen gemeinsamen Kreislauf-System zu erstellen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der UCLA Tierpflege und Verwendung Ausschuss und den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Dauer des nachstehend beschriebenen Verfahrens beträgt etwa 45-60 min von Anfang bis Ende.
1. Vorbereitung der OP-Feld
- Führen Sie das Verfahren in einem Reinraum Tierchirurgie.
- Ausstattung: Isofluran Vaporizer, Gaymer T Pumpe mit Heizkissen.
- Sterile Instrumente: zwei gebogenen Pinzette, feine Scheren, Nadelhalter.
- Sterile Handschuhe müssen während des gesamten Verfahrens verwendet werden.
2. Vorbereitung der Tiere
- Legen Sie zwei männlichen oder weiblichen Mäusen, aus der gleichen genetischen Hintergrund, der ähnlich wie Gewicht und Größe in den gleichen Käfig und Monitor für mindestens zwei Wochen zu einer harmonischen Zusammenleben zu gewährleisten. Weibliche Mäuse aufgrund ihrer weniger aggressives Verhalten bevorzugt.
- Anesthetize Tiere durchmit einem Isofluran-Verdampfer. Platz Mäuse in einer Posi-Seal Induktionskammer verbunden ist, um die Isofluran-Verdampfer (5.4% v / v). Sobald Anästhesie induziert, übertragen das Tier das Fell rasieren Bereich und pflegen die Narkose während des gesamten Verfahrens durch ein Nasenkegel zu Isofluran (1,5 bis 2% v / v) verbunden. Bewerben Augensalbe mit einem Q-Tip, um trockene Augen zu vermeiden.
- Legen Sie das Tier auf der Rückenlage. Gründlich rasieren die linke Seite der Maus auf der linken und der rechten Seite der Maus auf die rechte ab ca. 1 cm oberhalb des Ellenbogens bis 1 cm unter dem Knie platziert.
- Die rasierten Flächen durch gründliches Abwischen (2-3x) mit Betadine getränkten Tücher, gefolgt von Alkoholtupfer aseptisch vorbereiten. Legen Sie die Maus auf einer beheizten Unterlage von einer sterilen Auflage abgedeckt.
- Für Analgesie zu verabreichen Carprofen und Buprenorphin intraperitoneal oder subkutan in einer Dosis von 10 mg / kg und 0,1 mg / kg.
- Zeigen Tiere auf ihrer Seite, Rücken an Rücken, mit einemdjacent rasiert Bereichen nach oben. Um eine Kontamination des chirurgischen Bereich zu vermeiden, umfassen die Mäuse mit einem sterilen Tuch Belichten nur den Arbeitsbereich. Erstellen Sie eine kleine Öffnung sterilen Tuch zu bleiben, wenn die Durchführung der Operation. Wir haben das Tuch Fenster groß, um eine bessere Sicht während der Videoaufnahmen zu haben.
3. Parabiose
- Mit einem scharfen Scheren, führen Längshautschnitte zu den rasierten Seiten von jedem Tier ab 0,5 cm über dem Ellbogen bis hin zu 0,5 cm unterhalb des Kniegelenks (Abbildung 1). Nach dem Schnitt vorsichtig lösen, die Haut aus dem subkutanen Faszie, indem Sie die Haut mit einem Paar von gebogenen Pinzette und trennen Sie die Blende mit einem zweiten Paar zu 0,5 cm Frei Haut. Führen Sie diese Trennung entlang der gesamten Einschnitt.
- Beginnen Sie die Verbindung durch Anbringen der linken Olecranon von einem Tier auf der rechten Olecranon des anderen. Beide olecranons-und Kniegelenke sind klar unterscheidbar folgenden the Hautschnitt. Zur Erleichterung der Füge-, biegen Sie die Ellbogen der ersten Maus und übergeben Sie die Nadel des nicht resorbierbaren Nahtmaterial 3-0 unter der Olecranon. Ebenso biegen Sie die Ellbogen der zweiten Maus und übergeben die gleiche Naht unter ihm. Bringen Gelenke fest mit einem Doppel chirurgischen Knoten.
- Schließen Sie die Kniegelenke nach dem gleichen Verfahren.
- Nach der Befestigung der Gelenke, verbinden die Haut der beiden Tiere mit einem kontinuierlichen resorbierbaren 5-0 Vicrylnaht ab ventral vom Ellenbogen zum Knie. Um Haut Bruch und Trennung zu verhindern führen eine enge Nahtverschluss der Haut in der Gegend um den Ellenbogen und Knien. Sobald die Bauchhaut Anlage abgeschlossen ist, führen Sie einen Doppelklick chirurgischen Knoten. Legen Sie die Mäuse in der Bauchlage und setzen Sie die Naht dorsal endet mit einem Doppel chirurgischen Knoten. Überprüfen Sie, ob die Kontinuität der Naht und bestätigen das Fehlen von Öffnungen.
- Verabreichen 0,5 ml 0,9% NaCl subkutan jeder Maus zu verhindern Dehydration.
4. Postoperative Erholung
- Halten Sie Tiere auf Pad erhitzt bis zur Genesung.
- Nach der Erholung bieten Analgetika Carprofen und Buprenorphin. Wiederholen, intraperitoneal oder subkutan alle 24 bis 12 h, jeweils für 48 Stunden bei den gleichen, oben (Schritt 2.5) beschriebene Dosen. Überwachung der Tiere auf Anzeichen von Schmerzen und Leiden wie Schütteln, Lethargie, Kauen der Schwanz, zurück gewölbt, mangelnde Pflege, usw. täglich für zwei Wochen.
- Prophylaktisch, Behandlung von Mäusen mit Sulfamethoxazol / Trimethoprim orale Suspension in ihre Wasserflasche 2 mg Sulfa / ml 0,4 mg trimmen / ml für 10 Tage, um bakterielle Infektionen zu verhindern.
- Haus jeweils Parabiose Paar in einem sauberen Käfig mit monolithischen Bettwäsche Material (z. B. Papiertuch oder saugfähigen sterilen Tupfer) Aspiration von Bettmaterial zu verhindern. Bringen Sie die Tiere zu einem Käfig Bettwäsche gefüllt, wenn sie in der Lage, Brustlage mit dem Kopf nach oben zu halten sind. Um die Belastung zu minimierender greift nach Nahrung, während die Anpassung an Parabiose Existenz, legen Sie die angefeuchtetes Futter-Pellets auf dem Käfigboden. Geben Nistmaterial. 1-2 Wochen Parabiose Mäusen haben die Fähigkeit, in der Regel auf operativ gekoppelten vorderen und hinteren Extremitäten zubewegen.
- Blut tritt Chimärismus 10-14 Tage nach der Operation.
5. Bestätigung und Reverse-Verfahren
- Nach zwei Wochen ziehen Blut aus den Schwanzvenen von jeder Maus für durchflusszytometrische Analyse, um den Blut Chimärismus (Abbildung 3) zu bestätigen.
- Blutverarbeitungs für die durchflusszytometrische Analyse: 2-3 Tropfen verdünnte Blut in 500 ul 10 mM EDTA. In 500 ul von 2% Dextran (verdünnt in PBS), gut mischen und bei 37 ° C für 30 min. Den Überstand in ein neues Röhrchen, Spin bei 1.200 rpm für 5 min und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS (oder andere Puffer) für die Durchflusszytometrie.
- Je nach Versuchsaufbau kann die Parabiose Paar getrennt werden, einet späteren Zeitpunkten. Nach unserer Erfahrung haben wir parabiosed Paare für bis zu 9 Monate ohne Komplikationen gehalten.
- Führen Sie in umgekehrter Reihenfolge auf einem sterilen OP-Oberfläche. Mäuse anästhesiert, indem sie in einer Induktionskammer zu einem Verdampfer Isofluran (4-5%) angeschlossen und Aufrechterhaltung einer Narkose mit Isofluran 1,5-2%, wie oben beschrieben (Schritt 2.2) beschriebene.
- Entfernen Sie Haare aus der Umgebung des ersten Naht und aseptisch bereiten die rasierten Bereichen, wie oben beschrieben (Schritte 2.3, 2.4).
- Für Analgesie zu verabreichen Carprofen und Buprenorphin intraperitoneal oder subkutan in einer Dosis von 10 mg / kg und 0,1 mg / kg.
- Decken OP-Bereich mit einem sterilen Tuch wie oben (Schritt 2.6) beschrieben.
- Mit einer scharfen Schere, trennen Sie die Maus über einen Längsschnitt entlang der Seitennaht und sanft lösen die neu gebildete Faszie zwischen den beiden Mäusen mit einem Paar von gebogenen Pinzette. Um die Gelenke zu trennen, schneiden Sie die Knoten der Nahtverbindet. Schneiden Sie die Haut entlang der Schnitt zu erreichen, glatte Kanten und bringen Sie die Haut mit einem resorbierbaren kontinuierliche 5-0 beschichteten Vicrylnaht.
- Um Austrocknung zu vermeiden, zu verabreichen 0,5 ml 0,9% NaCl subkutan jeder Maus. Halten Sie Tiere auf Pad erhitzt bis zur Genesung.
- Nach der Wiederherstellung wiederholen Analgetikum Verwaltung, Carprofen (10 mg / kg) alle 24 h und Buprenorphin (0,1 mg / kg) alle 12 h für 48 Stunden.
- Um zu verhindern, bakterielle Infektionen zu behandeln Mäuse mit Sulfamethoxazol / Trimethoprim orale Suspension (2 mg Sulfa / ml 0,4 mg trimmen / ml) in ihre Wasserflasche für 10 Tage.
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Representative Results
Die voraussichtliche Ergebnis der Parabiose von zwei Organismen ist die gleiche Beitrag der Kreislauf-System eines jeden Tieres auf einen gemeinsamen Blutkreislauf (Abbildung 2). Man kann leicht überprüfen, die erfolgreiche Gleichgewichtseinstellung des Blut des parabiosed WT und GFP-positiven Mäusen durch durchflusszytometrische Analyse. Hier wurde venöses Blut aus den Schwänzen der beiden parabionts bei 2 Wochen nach der Operation erhalten und wurde für periphere Blutzellen fraktioniert (Erythrozyten auszuschließen). Das fraktionierte hämatopoetischen abgeleiteten Zellfraktion wurde anschließend mittels Durchflusszytometrie auf die Gegenwart von GFP-positiven und WT-Zellen analysiert. In Übereinstimmung mit früheren Studien, Blut aus der WT-Maus zeigte Präsenz des Chimärismus, wie etwa um die Hälfte und die Hälfte GFP positive WT Blutzellen (53% WT-Zellen und 47% GFP-Zellen) (Abbildung 3) angegeben.
Fig. 1 ist. Parabiosis Chirurgie:. Incision Website Die seitlichen Seiten des narkotisierten Tiere werden rasiert und Längshautschnitte von 0,5 cm über dem Ellbogen bis 0,5 cm unterhalb des Kniegelenks durchgeführt (vernarrt Bereich).
2. Schematische Darstellung der Parabiose-Methode. A) Der Beitritt eines WT-Maus (links) zu einem positiven GFP-Maus (rechts). B) Rund zwei Wochen nach der OP-Anlage wird neue Mikrogefäße an der Stelle, wo die zwei Mäuse angeschlossen sind so gebildet Beitritt der Blutzirkulation.
3. Blut Chimärismus der Parabiose Partnern. Durchflusszytometrische Analyse der Blutprobe aus der WT Parabiose Partner zwei Wochen nach OP-Beitritt gesammelt.
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Discussion
Die hier diskutierten Parabiose Verfahren stellt minimale technische Schwierigkeiten und führt zu einer geringen Sterblichkeit. Die Befestigung der Knie-und Ellbogengelenke ist eine signifikante Verbesserung des Bunster und Meyer Technik. Allerdings bleibt die invasive Verfahren somit wartungs von sterilen Bedingungen in der gesamten Operation ist zwingend erforderlich. Um weiter zu verhindern, Infektion der Operationsstelle ist es wichtig, dass die parabiosed Tiere erhalten eine Kombination von Antibiotika und regelmäßig überwacht werden. Um festen Halt zu gewährleisten und zu verhindern, Schmerzen, sollte die Naht, welche die Ellbogen und Knien die Gelenke nicht durch das Gewebe umgeben.
Als Alternative zu Isofluran Inhalation kann Betäubung mit der Verwendung intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin oder anderen institutionellen Kommissionen genehmigt Anästhetika induziert werden. Der Vorteil der Verwendung von Isofluran ist, dass es schnell zu induzieren Anästhesie und reduzieren die rINZIEHUNG Zeit. Weiterhin kann die Narkosetiefe genau gesteuert werden.
Parabiose, das Kreislaufsystem aus zwei Tiere zu vermischen und ins Gleichgewicht ermöglicht, ist ein leistungsfähiges experimentelles Verfahren für physiologische Studien. Es stellt einige Vorteile gegenüber anderen üblicherweise verwendeten Verfahren, wie Knochenmarktransplantation oder Zellinjektion. Zellabgabeverfahren manchmal eine kurze Fenster, um die Wirkung von transplantierten Zellen zu untersuchen. Zusätzlich erhöht Immunsuppression das Risiko einer Infektion und anschließende Morbidität und Mortalität. Jedoch mit Parabiose kann ein chimäres Zirkulation für lange Zeiträume und Studien zirkulierende Faktoren (Zellen, Cytokine usw.), unabhängig von ihrer Herkunft zu halten. Dieses System kann verwendet werden, um die Rolle von zirkulierenden Zellen, die in der Wundheilung, Tumorentstehung, Alterung, Regeneration und Entzündungsreaktion, unter vielen anderen zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Adriane Mosley und Libuse Jerabek (Stanford) für die Unterstützung bei der chirurgischen Technik zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
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