Summary
दो जीवों के शामिल होने Parabiotic एक साझा संचार प्रणाली का विकास होता है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक जंगली प्रकार माउस और एक विधान GFP-व्यक्त माउस के बीच एक parabiotic कनेक्शन के लिए फार्म शल्य कदम का वर्णन.
Abstract
Parabiosis रक्त परिसंचरण के बंटवारे की अनुमति दो जीवों की एक शल्य चिकित्सा संघ है. दो जानवरों की त्वचा संलग्न सूजन के स्थल पर microvasculature के गठन को बढ़ावा देता है. Parabiotic भागीदारों उनके परिसंचारी एंटीजन का हिस्सा है और इस प्रकार प्रतिकूल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए स्वतंत्र हैं. सबसे पहले 1864 1 में पॉल बर्ट द्वारा वर्णित, parabiosis सर्जरी पशु अस्तित्व 2 में सुधार के लिए 1933 में Bunster और मेयेर द्वारा परिष्कृत किया गया. वर्तमान प्रोटोकॉल में, दो चूहों शल्य चिकित्सा Bunster और मेयर तकनीक की एक संशोधन के बाद शामिल हो गए हैं. पशु sutured त्वचा पर तनाव को रोकता है कि फर्म समर्थन की अनुमति त्वचा की कुर्की द्वारा पीछा कोहनी और घुटने के जोड़ों के माध्यम से जुड़े हुए हैं. इस के साथ साथ, हम विस्तार में एक जंगली प्रकार (WT) माउस के लिए माउस को व्यक्त करने के लिए एक देशव्यापी GFP के शामिल होने parabiotic वर्णन. रक्त circulat में दो हफ्ते की प्रक्रिया के बाद, इस जोड़ी को अलग किया जाता है और GFP सकारात्मक कोशिकाओं प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता लगाया जा सकता हैWT माउस के आयन. रक्त काइमेरावाद एक अन्य में एक पशु से परिसंचारी कोशिकाओं के योगदान की जांच करने के लिए अनुमति देता है.
Introduction
Parabiosis, शल्य दो जीवों के शामिल होने, पहली साझा संचार प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल विकसित करने के लिए एक रास्ते के रूप में पॉल बर्ट द्वारा 1864 में वर्णित है और दो चूहों 1 की त्वचा और मांसपेशियों की दीवारों के शामिल होने के शामिल किया गया था. Parabiosis सूजन 3 के स्थल पर microvasculature के गठन को बढ़ावा देता है और इस तरह के पिट्यूटरी ग्रंथि और gonads के साथ ही उच्च रक्तचाप 4 में गुर्दे की भूमिका के बीच हार्मोनल संचार के रूप में शारीरिक पढ़ाई में कई आवेदन किया गया है. यह आगे, neovascularization 5, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं 6 के प्रवास, और लिम्फोसाइट तस्करी 7, साथ ही ट्यूमर मेटास्टेसिस 8,9 में सूजन या स्टेम कोशिकाओं परिसंचारी की भूमिका और कैनेटीक्स में पूर्वज कोशिकाओं की भर्ती और एकीकरण की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है और neurodegenerative रोग 10.
Parabiosis झूठ का एक महत्वपूर्ण लाभउस में भागीदारी जानवरों एक प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया ट्रिगर के बिना सेल प्रवास और neovascularization की अनुमति, आम परिसंचारी एंटीजन साझा. महत्वपूर्ण बात है, Weissman एट अल. पुरुष और महिला चूहों के बीच कि parabiosis से पता चला है 11 एंटीबॉडी विरोधी हरियाणा के गठन के लिए नेतृत्व नहीं करता है.
पॉल बर्ट द्वारा वर्णित मूल प्रोटोकॉल में दो जानवरों की त्वचा और मांसपेशियों की दीवारों 1 के कनेक्शन के माध्यम से एक साथ जुड़े हुए थे. इस विधि हालांकि, पशुओं के लिए महत्वपूर्ण तनाव के कारण होता है और कारण घाव के संक्रमण के लिए उच्च मृत्यु दर में हुई. तब से parabiosis तकनीक सबसे प्रमुख 1933 में 2 Bunster और मेयेर द्वारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल होने के साथ कई समूहों द्वारा संशोधित किया गया है. उनकी पद्धति जानवरों के लिए बेहतर समर्थन और कम दर्द की अनुमति, कंधे की हड्डी के जोड़ों, शारीरिक गुहा, और त्वचा के शामिल होने शामिल थे. एक ही समय में, नई विधि न्यूनतम पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल और महत्वपूर्ण विषय के परिणामस्वरूपcantly मृत्यु दर में कमी हुई. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल कम आक्रामक है और मजबूत शामिल होने की अनुमति देता है कि Bunster और मेयर तकनीक का एक संशोधन है. अर्थात्, चूहों कोहनी और घुटने के जोड़ों के साथ ही त्वचा के माध्यम से जुड़े हुए हैं. इसलिए इस में शामिल होने को रोकता है त्वचा के विस्तार और कम दर्द और जटिलताओं का कारण बनता है. यहाँ हम माउस व्यक्त विधान GFP के लिए एक जंगली प्रकार (WT) वयस्क माउस के शामिल होने का वर्णन है. हम सर्जरी के बाद दो सप्ताह में हम एक साझा संचार प्रणाली बनाने के लिए इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की प्रभावकारिता का प्रदर्शन रक्त काइमेरावाद का 50% प्राप्त कर सकते हैं.
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Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए यूसीएलए के पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों और स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार प्रदर्शन किया गया. नीचे वर्णित प्रक्रिया की अवधि शुरू से अंत तक लगभग 45-60 मिनट है.
1. शल्य चिकित्सा क्षेत्र की तैयारी
- एक साफ पशु शल्य चिकित्सा कक्ष में प्रक्रिया करते हैं.
- उपकरण: isoflurane Vaporizer, हीटिंग पैड के साथ Gaymer टी पम्प.
- बाँझ उपकरण: दो घुमावदार संदंश, ठीक कैंची, सुई धारक.
- बाँझ दस्ताने पूरी प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
2. पशु की तैयारी
- एक ही पिंजरे में समान वजन और आकार का एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि से दो पुरुष या महिला चूहों, जगह और सामंजस्यपूर्ण सहवास सुनिश्चित करने के लिए कम से कम दो सप्ताह के लिए निगरानी. मादा चूहों के कारण उनके कम आक्रामक व्यवहार को पसंद कर रहे हैं.
- द्वारा पशुओं चतनाशून्यएक isoflurane vaporizer का उपयोग. एक स्थिति सील प्रेरण कक्ष में जगह चूहों isoflurane vaporizer (4-5% v / v) से जुड़े. संज्ञाहरण प्रेरित है, एक बार isoflurane (1.5-2% v / v) से जुड़े एक नाक शंकु के माध्यम से प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण फर शेविंग क्षेत्र के लिए पशु हस्तांतरण और बनाए रखें. सूखी आँखों को रोकने के लिए एक क्यू की नोक के साथ नेत्र मरहम लागू करें.
- लापरवाह स्थिति पर पशु रखें. अच्छी तरह से सही पर लगभग 1 सेमी 1 सेमी घुटने के नीचे कोहनी से ऊपर शुरू करने पर रखा छोड़ दिया और माउस के राइट साइड पर रखा माउस के बाईं ओर दाढ़ी.
- Aseptically अच्छी तरह से शराब पोंछे द्वारा पीछा Betadine से लथपथ पोंछे के साथ (2-3X) पोंछते द्वारा मुंडा क्षेत्रों तैयार करते हैं. एक बाँझ पैड द्वारा कवर एक गर्म पैड पर चूहों रखें.
- Analgesia के लिए क्रमश: 10 मिलीग्राम / किग्रा और 0.1 मिलीग्राम / किलो की एक खुराक पर intraperitoneally या subcutaneously Carprofen और Buprenorphine प्रशासन.
- एक साथ, वापस वापस करने के लिए, उनके पक्ष में जानवरों रखेंऊपर का सामना करना पड़ मुंडा क्षेत्रों djacent. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र के किसी भी संक्रमण से बचने के लिए, केवल आपरेशन क्षेत्र उजागर एक बाँझ कपड़ा के साथ चूहों को कवर किया. सर्जरी प्रदर्शन जब बाँझ रहने के लिए एक छोटा सा कपड़ा खोलने बनाने. हम videotaping दौरान एक बेहतर देखने के लिए है टांगना खिड़की बड़ा बना दिया.
3. Parabiosis
- एक तेज कैंची का प्रयोग, कोहनी से ऊपर 0.5 सेमी पर प्रत्येक जानवर प्रारंभ की मुंडा पक्षों को संयुक्त घुटने से नीचे 0.5 सेमी (चित्रा 1) के लिए सभी तरह अनुदैर्ध्य त्वचा चीरों प्रदर्शन करते हैं. चीरा के बाद, धीरे घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ त्वचा को धारण करके चमड़े के नीचे प्रावरणी से त्वचा को अलग कर मुक्त त्वचा की 0.5 सेमी बनाने के लिए एक दूसरी जोड़ी के साथ प्रावरणी अलग. पूरे चीरा साथ इस जुदाई प्रदर्शन करना.
- अन्य की सही कूर्पर से एक पशु की बाईं कूर्पर संलग्न द्वारा शामिल होने शुरू करो. Olecranons और घुटने के जोड़ों दोनों स्पष्ट रूप से पहचाने निम्नलिखित वें रहे हैंई त्वचा चीरा. शामिल होने की सुविधा के लिए, पहले माउस की कोहनी मोड़ और कूर्पर तहत गैर absorbable 3-0 सीवन की सुई गुजरती हैं. इसी तरह, दूसरी माउस की कोहनी मोड़ और इसके तहत एक ही सिवनी गुजरती हैं. एक डबल शल्य गाँठ से कसकर जोड़ों देते हैं.
- एक ही प्रक्रिया के बाद घुटने के जोड़ों से कनेक्ट करें.
- जोड़ों की कुर्की के बाद एक निरंतर absorbable 5-0 Vicryl सिवनी घुटने की ओर कोहनी से पेट के बल शुरू करने के साथ दो जानवरों की त्वचा से कनेक्ट. त्वचा टूटना और जुदाई रोकने के लिए कोहनी और घुटनों के आसपास के क्षेत्र में त्वचा की एक तंग सिवनी बंद करने के लिए प्रदर्शन. उदर त्वचा लगाव पूरा हो चुका है एक बार, एक डबल शल्य गाँठ करते हैं. प्रवण स्थिति में चूहों प्लेस और एक डबल शल्य गाँठ के साथ समाप्त सिवनी पीछे की ओर जारी है. सिवनी की निरंतरता को सत्यापित करने और उद्घाटन की कमी की पुष्टि करें.
- Dehy को रोकने के लिए subcutaneously प्रत्येक माउस को 0.9% NaCl के 0.5 मिलीलीटर प्रशासनdration.
4. पश्चात की वसूली
- वसूली तक गर्म पैड पर जानवरों को रखने के.
- वसूली के बाद, दर्दनाशक दवाओं Carprofen और buprenorphine प्रदान करते हैं. (2.5 कदम) ऊपर वर्णित एक ही खुराक पर 48 घंटे के लिए, क्रमशः, intraperitoneally या subcutaneously हर 24 और 12 घंटा दोहराएँ. इस तरह के झटकों के रूप में दर्द और संकट के संकेत के लिए जानवरों पर नजर रखने, पूंछ की सुस्ती, चबाने, आदि संवारने की कमी है, दो सप्ताह के लिए दैनिक, पीठ धनुषाकार.
- Prophylactically, 2 मिलीग्राम सल्फा / एमएल 0.4 मिलीग्राम जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए 10 दिनों के लिए / एमएल ट्रिम उनकी पानी की बोतल में sulfamethoxazole / Trimethoprim मौखिक निलंबन के साथ चूहों का इलाज.
- हाउस बिस्तर सामग्री की आकांक्षा को रोकने के लिए अखंड बिस्तर सामग्री (जैसे कागज तौलिया या शोषक बाँझ पैड) के साथ एक साफ पिंजरे में प्रत्येक parabiotic जोड़ी. वे उनके सिर के ऊपर से sternal अवलंबन बनाए रखने में सक्षम हैं जब एक बिस्तर भरे पिंजरे में जानवरों लौटें. तनाव कम करने के लिएparabiotic अस्तित्व को समायोजित करते हुए भोजन के लिए पहुंचने की, पिंजरे मंजिल पर सिक्त भोजन छर्रों जगह है. घोंसले के शिकार सामग्री प्रदान करें. 1-2 हफ्तों में parabiotic चूहों शल्य चिकित्सा बनती सामने और हिंद अंगों पर सामान्य रूप से ambulate करने की क्षमता है.
- रक्त काइमेरावाद सर्जरी के बाद 10-14 दिन होता है.
5. पुष्टिकरण और रिवर्स प्रक्रिया
- दो सप्ताह के रक्त काइमेरावाद (चित्रा 3) की पुष्टि करने के लिए प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए प्रत्येक माउस की पूंछ नसों से खून आकर्षित करने के बाद.
- प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए रक्त प्रसंस्करण: 10 मिमी EDTA के 500 μl में रक्त की 2-3 बूंदें पतला. (पीबीएस में पतला) 2% dextran के 500 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर एक नया ट्यूब, स्पिन में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए पीबीएस में pelleted कोशिकाओं (या अन्य बफर) resuspend.
- प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, parabiotic जोड़ी अलग किया जा सकता है एकबाद में समय अंक टी. हमारे अनुभव में, हम किसी भी जटिलताओं के बिना अप करने के लिए 9 महीनों के लिए parabiosed जोड़े को बनाए रखा है.
- एक बाँझ शल्य सतह पर रिवर्स प्रक्रिया करते हैं. (2.2 कदम) ऊपर वर्णित के रूप में, एक isoflurane vaporizer (4-5%) से जुड़ा है और 1.5-2% isoflurane के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने के एक प्रेरण कक्ष में उन्हें रखने के द्वारा चूहों anesthetize.
- (2.3, 2.4 कदम) के प्रारंभिक सिवनी आसपास के क्षेत्र से बालों को हटाने और aseptically ऊपर वर्णित के रूप में मुंडा क्षेत्रों तैयार करते हैं.
- Analgesia के लिए, क्रमशः, 10 मिलीग्राम / किग्रा और 0.1 मिलीग्राम / किलो की एक खुराक पर intraperitoneally या subcutaneously Carprofen और Buprenorphine प्रशासन.
- (कदम 2.6) ऊपर वर्णित के रूप में एक बाँझ कपड़ा के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर किया.
- तेज कैंची का प्रयोग, पार्श्व सिवनी साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा के माध्यम से चूहों को अलग किया और धीरे घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ दो चूहों के बीच नवगठित प्रावरणी अलग. जोड़ों को अलग करने के लिए, सीवन की समुद्री मील कटौतीउन्हें जोड़ने. चिकनी किनारों को प्राप्त करने और एक absorbable निरंतर 5-0 लेपित Vicryl सीवन के साथ त्वचा पुनः अनुलग्न चीरा साथ त्वचा बंद ट्रिम.
- निर्जलीकरण को रोकने के लिए, प्रत्येक माउस को 0.9% NaCl subcutaneously के 0.5 मिलीलीटर प्रशासन. वसूली तक गर्म पैड पर जानवरों को रखने के.
- वसूली के बाद 48 घंटे के लिए हर 12 घंटा एनाल्जेसिक प्रशासन, Carprofen (10 मिलीग्राम / किग्रा) हर 24 घंटे और buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) को दोहराएँ.
- जीवाणु संक्रमण 10 दिनों के लिए अपनी पानी की बोतल में sulfamethoxazole / Trimethoprim ओरल सस्पेंशन (2 मिलीग्राम सल्फा / एमएल 0.4 मिलीग्राम / एमएल ट्रिम) के साथ चूहों के इलाज को रोकने के लिए.
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Representative Results
दो जीवों की parabiosis के प्रत्याशित परिणाम एक सामान्य रक्त परिसंचरण को प्रत्येक जानवर की संचार प्रणाली के बराबर योगदान (चित्रा 2) है. एक आसानी से प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा parabiosed गुम्मट और GFP सकारात्मक चूहों के रक्त के सफल संतुलन सत्यापित कर सकते हैं. इधर, शिरापरक रक्त सर्जरी के बाद 2 सप्ताह में दोनों parabionts की पूंछ से प्राप्त किया गया था और (एरिथ्रोसाइट्स बाहर करने के लिए) परिधीय रक्त कोशिकाओं के लिए fractionated गया था. fractionated hematopoietic व्युत्पन्न सेल अंश बाद में सकारात्मक GFP और गुम्मट कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था. लगभग आधा GFP सकारात्मक और आधा गुम्मट रक्त कोशिकाओं (53% WT कोशिकाओं और 47% GFP कोशिकाओं) (चित्रा 3) के रूप में संकेत द्वारा पिछले अध्ययनों के अनुरूप, WT माउस से रक्त, काइमेरावाद की उपस्थिति का पता चला.
चित्रा 1. Parabioबहन सर्जरी:. चीरा साइट anesthetized जानवरों के पार्श्व पक्षों काटे और अनुदैर्ध्य त्वचा चीरों संयुक्त घुटने से नीचे 0.5 सेमी तक कोहनी से ऊपर 0.5 सेमी से (doted क्षेत्र) प्रदर्शन कर रहे हैं.
चित्रा 2. Parabiosis विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ए) एक GFP सकारात्मक माउस (दाएं). बी) शल्य लगाव निम्नलिखित लगभग दो सप्ताह, नई microvasculature दो चूहों में शामिल होने की इजाजत दी जुड़े हैं जहां स्थान पर ही बना है एक WT माउस (बाएं) के शामिल होने रक्त परिसंचरण की.
चित्रा 3. Parabiotic भागीदारों के रक्त काइमेरावाद. शल्य चिकित्सा में शामिल होने निम्न गुम्मट parabiotic साथी दो सप्ताह से एकत्र रक्त के नमूने की cytometric विश्लेषण प्रवाह.
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Discussion
यहाँ पर चर्चा parabiosis विधि कम मृत्यु दर में कम से कम तकनीकी कठिनाइयों और परिणाम प्रस्तुत करता है. घुटने और कोहनी जोड़ों की कुर्की Bunster और मेयर तकनीक का एक महत्वपूर्ण सुधार है. हालांकि, प्रक्रिया इस प्रकार की सर्जरी के दौरान बाँझ शर्तों के रखरखाव जरूरी है आक्रामक रहता है. आगे शल्य साइट के संक्रमण को रोकने के लिए, यह parabiosed जानवरों एंटीबायोटिक दवाओं का एक संयोजन प्राप्त है और नियमित रूप से निगरानी की जानी जरूरी है. फर्म का समर्थन सुनिश्चित करने और दर्द को रोकने के लिए, कोहनी और घुटनों को जोड़ने सिवनी बल्कि ऊतकों के माध्यम से गुजर से जोड़ों के चारों ओर जाना चाहिए.
Isoflurane साँस लेना के लिए एक विकल्प के रूप में, संज्ञाहरण ketamine / xylazine या संस्थागत समितियों द्वारा अनुमोदित अन्य संवेदनाहारी दवाओं की intraperitoneal इंजेक्शन के उपयोग के साथ प्रेरित किया जा सकता है. isoflurane का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह तेजी से संज्ञाहरण प्रेरित और काफी आर को कम कर सकते हैंecovery समय. इसके अलावा, संज्ञाहरण का स्तर ठीक नियंत्रित किया जा सकता है.
दो जानवरों से संचार प्रणालियों मिलना और संतुलित करने के लिए अनुमति देता है जो Parabiosis,, शारीरिक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक प्रक्रिया है. यह ऐसे अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण या सेल इंजेक्शन के रूप में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक को कई लाभ प्रस्तुत करता है. सेल वितरण प्रक्रियाओं, समय पर, प्रतिरोपित कोशिकाओं के प्रभाव की जांच के लिए एक छोटी खिड़की प्रदान करते हैं. इसके अलावा, प्रतिरक्षादमन संक्रमण और बाद में रुग्णता और मृत्यु दर का खतरा बढ़ जाता है. हालांकि, parabiosis साथ एक अपने मूल के स्वतंत्र कारकों (कोशिकाओं, साइटोकिन्स, आदि) परिसंचारी समय और अध्ययन की लंबी अवधि के लिए एक chimeric परिसंचरण बनाए रख सकते हैं. इस प्रणाली के कई अन्य लोगों के अलावा घाव भरने, ट्यूमर गठन, उम्र बढ़ने, उत्थान, और भड़काऊ प्रतिक्रिया में कोशिकाओं परिसंचारी की भूमिका निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
लेखकों सर्जिकल तकनीक के साथ सहायता के लिए Adriane मोस्ले और Libuse Jerabek (स्टैनफोर्ड) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
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