Summary
Parabiótico junção dos dois organismos conduz ao desenvolvimento de um sistema circulatório compartilhado. Neste protocolo, descrevemos os passos cirúrgicos para formar uma conexão parabiótico entre um rato do tipo selvagem e um rato expressando GFP constitutiva.
Abstract
Parabiose é uma união cirúrgica de dois organismos, permitindo a partilha da circulação sanguínea. Colocar a pele de dois animais promove a formação de microvasos no local da inflamação. Parceiros parabiótico compartilhar seus antígenos circulantes e, portanto, estão livres de reação imune adversa. Descrita pela primeira vez por Paul Bert, em 1864 1, a cirurgia parabiose foi refinado por Bunster e Meyer em 1933 para melhorar a sobrevivência de animais 2. No protocolo de corrente, dois ratinhos são unidas cirurgicamente na sequência de uma alteração da técnica de Bunster e Meyer. Os animais são conectadas através das articulações do cotovelo e joelho seguido por uma ligação da pele permitindo um apoio firme que impede pressão sobre a pele suturada. Relata-se em detalhe a parabiótico união de um GFP onipresente expressar mouse para um tipo selvagem (WT) mouse. Duas semanas após o procedimento, o par é separada e as células positivas para GFP pode ser detectada por meio de análise de citometria de fluxo no sangue circulanteíon do camundongo WT. O quimerismo sanguíneo permite examinar a contribuição das células circulantes de um animal no outro.
Introduction
Parabiose, juntando-se a cirurgia de dois organismos, foi descrita pela primeira vez em 1864 por Paul Bert, como forma de desenvolver um modelo para o estudo de sistemas circulatórios compartilhados e consistiu na junção da pele e paredes musculares de dois ratos 1. Parabiose promove a formação de microvasos no local de inflamação 3 e tem tido várias aplicações em estudos fisiológicos, tais como a comunicação hormonal entre a glândula pituitária e gónadas, bem como o papel da hipertensão renal em 4. Foi ainda utilizado para investigar o recrutamento ea integração de células progenitoras na neovascularização 5, migração de células-tronco hematopoéticas 6 e tráfico de linfócitos 7, bem como o papel ea cinética de circular células inflamatórias ou resultam em metástase do tumor 8,9, e doenças neurodegenerativas 10.
Uma vantagem significativa de mentiras Parabioseem que os animais parceria compartilham antígenos circulantes comuns, permitindo a migração de células e neovascularização, sem desencadear uma reação imunológica. Importante, Weissman et al. Demonstraram que parabiose entre ratinhos macho e fêmea não conduz à formação de anticorpos anti HY 11.
No protocolo original descrito por Paul Bert os dois animais foram unidos por meio de ligação da pele e do músculo paredes 1. Este método, contudo, provocou pressão significativa para os animais e resultou na elevada taxa de mortalidade devido à infecção da ferida. Desde então, a técnica parabiose foi revisto por vários grupos, sendo os mais predominante o protocolo proposto por Bunster e Meyer em 1933 2. Seu método incluído união das articulações escápula, cavidades do corpo e da pele, permitindo um melhor apoio e menos dor para os animais. Ao mesmo tempo, o novo método resultou em cuidados pós-operatórios mínimos e signifisignificativamente diminuído as taxas de mortalidade. O protocolo aqui descrito é uma modificação da técnica de Bunster e Meyer, que é menos invasivo e permite juntar mais firme. Nomeadamente, os ratinhos são ligados através do cotovelo e do joelho, assim como a pele. Esta união impede a extensão da pele e, por conseguinte, provoca menos dor e as complicações. Aqui nós descrevemos a união de um tipo selvagem (WT) rato adulto com uma GFP constitutivo expressar mouse. Nós mostramos que duas semanas após a cirurgia que podemos alcançar 50% de quimerismo sangue que demonstra a eficácia deste procedimento cirúrgico para criar um sistema circulatório compartilhado.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com os animais e uso comitê da UCLA e os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A duração do procedimento descrito abaixo é cerca de 45-60 minutos do começo ao fim.
1. Preparação de campo cirúrgico
- Realize o procedimento em uma sala de cirurgia animal limpo.
- Equipamento: isoflurano vaporizador, Gaymer T Bomba com almofada de aquecimento.
- Ferramentas estéreis: duas pinças, tesouras curvas finas, porta-agulha.
- Luvas estéreis deve ser usado durante todo o procedimento.
2. Preparação de Animais
- Colocar dois ratos machos ou fêmeas, do mesmo fundo genético, de peso e de tamanho semelhante na mesma gaiola e para monitorizar, pelo menos, duas semanas, para assegurar convivência harmoniosa. Ratinhos fêmeas são preferidos devido ao seu comportamento menos agressivo.
- Anestesiar animais porutilizando um vaporizador de isoflurano. Ratinhos lugar em uma indução Secção Posi-Seal ligado ao vaporizador de isoflurano (4-5% v / v). Uma vez que a anestesia é induzida, transferir o animal para a área de raspar a pele e manter a anestesia ao longo do processo por meio de um cone de nariz ligada ao isoflurano (1,5-2% v / v). Aplicar pomada oftálmica com um Q-ponta para evitar os olhos secos.
- Colocar o animal em decúbito dorsal. Absolutamente raspar o lado esquerdo do rato colocado no lado esquerdo e do lado direito do rato colocado no lado direito a partir de cerca de 1 cm acima do cotovelo de 1 cm abaixo do joelho.
- Assepticamente preparar as áreas raspadas através de uma profunda limpeza (2-3x) com panos encharcados de Betadine seguidos de algodão embebido em álcool. Colocar os ratos numa almofada aquecida coberto por uma compressa estéril.
- Para analgesia, administrar carprofeno e buprenorfina por via intraperitoneal ou por via subcutânea na dose de 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, respectivamente.
- Coloque os animais do seu lado, de costas, com umdjacent áreas raspadas viradas para cima. Para evitar a contaminação da zona cirúrgica, cobrir os ratos com um campo estéril expondo somente a área de operação. Criar uma pequena abertura cortina de ficar estéril ao realizar a cirurgia. Fizemos janela a cortina grande para ter uma visão melhor durante a filmagem.
3. Parabiose
- Usando uma tesoura afiada, faça incisões cutâneas longitudinais nas laterais raspadas de cada partida animais a 0,5 cm acima do cotovelo todo o caminho até 0,5 cm abaixo da articulação do joelho (Figura 1). Após a incisão, retirar suavemente a pele da fáscia subcutânea, mantendo a pele com um par de fórceps curvos e separar a fáscia com um segundo par para criar 0,5 centímetro de pele livre. Realize esta separação ao longo de toda a incisão.
- Comece a juntar, anexando o olécrano esquerda um animal para o olécrano direito do outro. Ambos olecranons e articulações do joelho são claramente distinguíveis seguinte ªe incisão na pele. Para facilitar a adesão, dobrar o cotovelo do primeiro mouse e passar a agulha da não-absorvível 3-0 sutura sob o olécrano. Do mesmo modo, dobrar o cotovelo do segundo rato e passar o mesmo por baixo da sutura. Fixe firmemente juntas por um nó cirúrgico casal.
- Ligar as articulações do joelho, seguindo o mesmo procedimento.
- Após a fixação das articulações, ligar a pele dos dois animais com um absorvível 5-0 Vicryl contínuo iniciando ventral do cotovelo para o joelho. Para evitar a ruptura da pele e de separação realizar uma sutura de encerramento hermético da pele, na área em torno dos cotovelos e joelhos. Uma vez que a fixação da pele ventral foi concluída, execute um nó cirúrgico casal. Coloque os ratos na posição prona e continuar a sutura dorsal terminando com um nó cirúrgico casal. Verificar a continuidade do fio de sutura e confirmar a falta de aberturas.
- Administrar 0,5 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea a cada rato para evitar desidrataçãodration.
4. Recuperação pós-operatória
- Manter os animais em pad aquecido até a recuperação.
- Após a recuperação, fornecer analgésicos carprofen e buprenorfina. Repetir intraperitoneal ou por via subcutânea em 24 e 12 horas, respectivamente, durante 48 horas nas mesmas doses descritas acima (passo 2.5). Monitorar os animais para os sinais de dor e angústia, como tremores, letargia, mastigação de cauda, costas arqueadas, a falta de higiene, etc diariamente durante duas semanas.
- Profilaticamente, tratar ratos com sulfametoxazol / trimetoprima suspensão oral em sua garrafa de água 2 mg sulfa / ml 0,4 mg / ml aparar por 10 dias para evitar infecções bacterianas.
- Casa cada par parabiótica em uma gaiola limpa de material de cama monolítico (por exemplo, papel toalha ou almofada absorvente estéril) para evitar a aspiração de material de cama. Retornar os animais para uma gaiola cheia de cama quando eles são capazes de manter decúbito esternal com a cabeça erguida. Para minimizar a tensãode pegar comida enquanto ajusta a existência parabiótica, coloque os grãos de ração umedecida no chão da gaiola. Fornecer material de nidificação. Em 1-2 semanas camundongos parabiótico têm a capacidade de deambular normalmente em pares cirurgicamente frente-e membros pélvicos.
- Quimerismo sanguíneo ocorre 10-14 dias após a cirurgia.
5. Confirmação e procedimento inverso
- Depois de duas semanas extrair o sangue das veias da cauda de cada rato para análise por citometria de fluxo para confirmar quimerismo sanguíneo (Figura 3).
- Processamento de sangue para análise de citometria de fluxo: diluir 2-3 gotas de sangue de 500 ul de EDTA 10 mM. Adicionar 500 ul de 2% de dextrano (diluído em PBS), homogeneizar e incubar a 37 ° C durante 30 min. Transferir o sobrenadante num novo tubo, centrifugação a 1.200 rpm durante 5 minutos e voltar a suspender as células peletizadas em PBS (ou outro tampão) para a análise de citometria de fluxo.
- Dependendo delineamento experimental, o par parabiótico podem ser separados umt pontos de tempo posteriores. Em nossa experiência, temos mantido pares parabiosed para até 9 meses, sem quaisquer complicações.
- Realizar procedimento inverso sobre uma superfície cirúrgico estéril. Anestesiar os ratos colocando-os em uma câmara de indução ligada a um vaporizador de isoflurano (4-5%) e manter a anestesia com 1,5-2% de isoflurano, conforme descrito acima (passo 2.2).
- Remover os pêlos da área em torno da sutura inicial e assepticamente preparar as áreas raspadas, como descrito acima (passos 2.3, 2.4).
- Para analgesia, administrar carprofeno e buprenorfina por via intraperitoneal ou por via subcutânea na dose de 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, respectivamente.
- Cobrir a área cirúrgica com um campo estéril, tal como descrito acima (passo 2.6).
- Utilizando uma tesoura afiada, separar os ratos por meio de uma incisão longitudinal ao longo da sutura lateral e separar cuidadosamente a fáscia recém formado entre os dois ratinhos com um par de pinças curvas. Para separar as articulações, cortar os nós de suturaconectá-los. Apare a pele ao longo da incisão para alcançar as bordas lisas e recolocar a pele com um contínuo 5-0 revestido sutura Vicryl absorvível.
- Para prevenir a desidratação, administrar 0,5 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea, a cada murganho. Manter os animais em pad aquecido até a recuperação.
- Após a recuperação, repetir administração de analgésicos, carprofeno (10 mg / kg) a cada 24 horas e buprenorfina (0,1 mg / kg) a cada 12 horas por 48 horas.
- Para evitar infecções bacterianas tratar ratos com sulfametoxazol / trimetoprima suspensão oral (2 mg sulfa / ml 0,4 mg aparar / ml) em sua garrafa de água durante 10 dias.
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Representative Results
O resultado esperado de parabiose de dois organismos é a contribuição igual de sistema circulatório do animal para cada uma circulação de sangue comum (Figura 2). Pode-se facilmente verificar o equilíbrio bem sucedido do sangue dos ratinhos WT positivo e GFP parabiosed por análise de citometria de fluxo. Aqui, o sangue venoso foi obtida a partir das caudas de ambos parabionts às 2 semanas após a cirurgia e foi fraccionado por células sanguíneas periféricas (para excluir eritrócitos). A fracção de células hematopoiéticas derivadas de fraccionado foi subsequentemente analisada por citometria de fluxo para detectar a presença de células positivas para GFP e WT. Consistente com os estudos anteriores, o sangue do ratinho WT revelou a presença de quimerismo, como indicado por cerca de metade de células positivas para GFP e meia WT sangue (53% de células WT e 47% de células GFP) (Figura 3).
Figura 1. Parabiocirurgia sis:. no local da incisão As faces laterais de animais anestesiados são raspadas e incisões cutâneas longitudinais são executadas (área adorava) de 0,5 cm acima do cotovelo até 0,5 cm abaixo da articulação do joelho.
Figura 2. Representação esquemática do método parabiose. A) união de um rato WT (esquerda) a um rato GFP positivo (direita). B) cerca de duas semanas a seguir à fixação cirúrgica, novo microvasculatura é formada no local em que os dois ratos estão ligados permitindo juntar da circulação sanguínea.
Figura 3. Quimerismo Sangue de parceiros parabiótica. Análise por citometria de fluxo da amostra de sangue coletada do parceiro parabiótico WT duas semanas após se juntar cirúrgico.
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Discussion
O método parabiose discutido aqui apresenta dificuldades e resultados técnicos mínimos em baixas taxas de mortalidade. A fixação do joelho e cotovelo é uma melhoria significativa da Bunster e técnica Meyer. No entanto, o procedimento invasivo permanece, assim, a manutenção de condições estéreis durante toda a cirurgia é imperativo. Para prevenir novas infecções do sítio cirúrgico, é importante que os animais parabiosed receber uma combinação de antibióticos e ser monitorizados regularmente. Para assegurar um suporte firme e evitar a dor, o fio de sutura que liga os cotovelos e joelhos devem colocar as juntas, em vez de passar através do tecido.
Como uma alternativa para a inalação de isoflurano, a anestesia pode ser induzida com o uso da injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina ou outras drogas anestésicas aprovados pelas comissões institucionais. A vantagem do uso de isoflurano é que ela pode induzir rapidamente a anestesia e reduzir significativamente o rECUPERAÇÃO tempo. Além disso, o nível de anestesia pode ser controlada com precisão.
Parabiose, que permite aos sistemas circulatórios de dois animais, fundir-se e equilibrar, é um procedimento experimental poderosa para estudos fisiológicos. Ele apresenta várias vantagens para outras técnicas vulgarmente utilizadas, tais como o transplante de medula óssea ou de células de injecção. Procedimentos de entrega celular, por vezes, proporcionar uma pequena janela para examinar o efeito de células transplantadas. Além disso, a imunossupressão aumenta o risco de infecção e de morbidade e mortalidade subsequentes. No entanto, com parabiose pode-se manter uma circulação quimérico por longos períodos de tempo e estudo de factores (células, citoquinas, etc), independentemente da sua origem em circulação. Este sistema pode ser usado para determinar o papel das células circulantes na cicatrização de feridas, a formação de tumores, o envelhecimento, a regeneração, e resposta inflamatória, entre muitos outros.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Adriane Mosley e Libuse Jerabek (Stanford) para obter assistência com a técnica cirúrgica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
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