Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

وصفنا استخدام الأصباغ styryl FM لإعادة تدوير الصورة حويصلة متشابك في النهايات العصبية الوظيفية. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها ليس فقط إلى أثار، ولكن أيضا عفوية والأنشطة متشابك مصغرة. بروتوكول يوسع متنوعة من الأحداث متشابك التي يمكن تقييمها على نحو فعال.

Abstract

حويصلات متشابك في النهايات العصبية الوظيفية الخضوع إيماس الإلتقام و. هذا التدوير حويصلة متشابك يمكن تحليلها على نحو فعال باستخدام الأصباغ styryl FM، والتي تكشف عن دوران الغشاء. وقد صممت بروتوكولات التقليدية لاستخدام الأصباغ FM لتحليل الخلايا العصبية التالية حفز (أثار) النشاط متشابك. في الآونة الأخيرة، أصبحت البروتوكولات المتوفرة لتحليل إشارات FM التي تصاحب أنشطة متشابك أضعف، مثل الأحداث متشابك عفوية أو مصغرة. تحليل هذه التغييرات الصغيرة في إشارات FM يتطلب أن نظام التصوير حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن تغيرات صغيرة في كثافة، ولكن يتم منعها أن التغييرات مصطنعة من السعة الكبيرة. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يمكن تطبيقه على أثار، عفوية، والأنشطة متشابك مصغرة، واستخدام الخلايا العصبية الحصين مثقف كمثال على ذلك. يشتمل هذا البروتوكول أيضا وسيلة لتقييم معدل photobleaching من الأصباغ وزير الخارجية، وهذا هو كبيرمصدر القطع الأثرية عند التصوير تغييرات طفيفة في كثافة.

Introduction

وظيفة الحويصلات متشابك هو من العوامل الهامة للانتقال متشابك. هذه الحويصلات الإفراج عن الناقلات العصبية عندما تندمج مع الغشاء البلازمي قبل المشبكي (إيماس)، وتصبح جاهزة للدورة أخرى للإفراج عنهم بعد أن جددت من غشاء البلازما (الإلتقام) وإعادة تحميل مع الناقل العصبي. البحث في ديناميات والآليات الكامنة وراء إعادة تدوير حويصلة متشابك تم تسريعها من خلال إدخال الأصباغ styryl FM 1. ويمكن لهذه الجزيئات متقابلة الزمر، التي موجبة الشحنة مجموعات الرأس ماء وذيول مسعور (الأصباغ متعددة في الشكل 1A، stereoview من FM1-43 في الشكل 1B)، أدخل عكسية وخروج الأغشية الدهنية دون تتخلل لهم. مجموعات من الأصباغ FM بسمات مماثلة التي تؤثر على مجموعة من الضوء الذي تنبعث. على سبيل المثال، FM2-10، FM1-43، وFM1-84 لها رابطة ثنائية واحدة بين اثنين من المركبات الحلقية وشوالانبعاثات الأخضر ث. الفرق بينهما هو طول الذيل مسعور، والذي يحدد للا مائية، وبالتالي معدل الخروج من غشاء (departitioning). في حالات FM5-95-64 وFM4، ربط ثلاثة سندات ضعف المركبات الحلقية، وأنها تظهر الانبعاثات الحمراء. هذه الأصباغ تختلف فيما يتعلق أجزائها ماء. في جميع الأصباغ وزير الخارجية، ويزيد من كثافة مضان عندما يتم إدراجها في الأغشية البيولوجية، ويرجع ذلك إلى زيادة في العائد الكمي في البيئة المتعلقة مسعور على البيئة المائية. وبالتالي فإن التغيرات في كثافة FM تمثل التغييرات في دوران الغشاء. ألوان مختلفة (أطياف الانبعاث) وhydrophobicities جعل FM الأصباغ أداة بحث تنوعا في إعادة تدوير حويصلة متشابك.

استنادا إلى هذه الميزات، وتستخدم الأصباغ FM معظمها وفقا للمخطط التالي عند تحليل إعادة تدوير حويصلة متشابك (الشكل 2). الخلايا العصبيةواستحم ق في حل خارج الخلية التي تحتوي على صبغة FM، مما مكنها من أن تؤخذ يصل الى الحويصلات متشابك (مركبة فضاء) لأنها تشكل عبر الإلتقام (تلطيخ). ثم يتم غسل الصبغة من خلال تطبيق حل خالية من الصبغة خارج الخلية، وهذا يكشف عن المحطات العصبية الوظيفية، أي فقط تلك التي تمر بنشاط الإلتقام سوف تحتوي على مجموعة من الحويصلات متشابك التي يتم تحميلها مع الصبغة (الشكل 2 القاع). إيماس اللاحقة يؤدي إلى فقدان الصبغة وزير الخارجية إلى الفضاء خارج الخلية وفقدان ما يصاحب ذلك من مضان (destaining؛ بسبب كل من departitioning إلى البيئة المائية ونشرها بعيدا عن موقع إيماس). وبالتالي فإن التغيرات في كثافة مضان FM هي مؤشرات حويصلة متشابك إكسو والإلتقام.

وقد استخدمت الأصباغ وزير الخارجية إلى وصمة عار ويزيل اللون الحويصلات متشابك في مختلف الكائنات الحية والاستعدادات 2،3. وتشمل الأمثلة رجل أعمال الثديياتالثقافات اونال 4-9، شرائح الدماغ في الثدييات 10،11، 12،13 التقاطعات العصبية والعضلية، الخلايا العصبية بين القطبين الشبكية 14،15، وخلايا الشعر من القوقعة 16.

عادة في مثل هذه التجارب، يتم تشغيل كل من تلطيخ وdestaining على نطاق واسع من خلال تحفيز الخلايا العصبية (النشاط أثار). في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، كما تم تحليلها إعادة تدوير حويصلة متشابك ردا على التحفيز ضعيفة، وكذلك إعادة التدوير في حالة عدم وجود حافز خارجي (النشاط متشابك عفوية ومصغرة) 9،17-19. يتم تعريف الأنشطة متشابك عفوية ومصغرة عن تلك التي تحدث في حالة عدم وجود مؤثرات الخارجية، مع السابق تنطوي على اطلاق عفوية من إمكانات العمل (الشكل 3). وترتبط هذه الأنشطة متشابك ضعيفة مع تغييرات صغيرة في إشارات FM من تلك التي نجمت عن التحفيز واسعة النطاق. يتطلب القياس أن التغييرات في fluoresc FMكثافة سينعقد تعكس بدقة متشابك إيماس حويصلة أو الإلتقام ولكن التغييرات لم مصطنعة في شدة. أحد الأسباب من القطع الأثرية هو وجود تلطيخ غير محددة من غشاء البلازما بواسطة الأصباغ FM. سوف تبييض التدريجي لهذا العنصر يؤدي إلى تغيير تدريجي في كثافة مضان قياس، والتي سيتم خطأ وأرجع إلى الأنشطة متشابك. ويمكن تخفيض هذا العامل بالطرق المناسبة (انظر البروتوكول). السبب الأبرز من القطع الأثرية هو photobleaching من صبغة FM الاحتفاظ داخل الحويصلات متشابك. يجب أن تكون التغييرات ذات الصلة في photobleaching من شدة FM صغيرة بالمقارنة مع البيولوجية (متشابك) التغييرات التي يتم قياسها. التطور الأخير من الكاميرات الحساسة، على سبيل المثال، بضرب الإلكترون إلى جانب المسؤول عن الجهاز (EMCCD) الكاميرا، ويجعل من الممكن للحد من photobleaching من خلال تقصير فترة التعرض وإضعاف شدة الضوء تستخدم لإثارة fluorophore. سبب آخر لهذا الأثر هو ط الانجرافن مستوى تركيز المجهر الخفيفة. الانجراف التركيز أثناء جلسة التصوير يمكن أن يكون سبب التأثيرات الميكانيكية أو الحرارية، وسوف يؤدي خطأ إلى تغير في كثافة مضان قياسها.

نحن هنا تصف البروتوكولات والمعدات التي تجعل من الممكن استخدام الأصباغ FM لتحليل إعادة تدوير حويصلة متشابك حتى في سياق التحفيز ضعيفة أو معدومة، على وجه الخصوص، النشاط متشابك مصغرة. وتبين لنا أمثلة من تلطيخ وdestaining من الحويصلات متشابك خلال الأحداث منبهات المسموعة وعفوية، وذلك باستخدام الخلايا العصبية مثقف القوارض الحصين، والتصوير المرحلة destaining. علينا أن نبرهن أيضا كيفية تقييم درجة FM صبغ photobleaching من، في غياب أي خسارة FM صبغ بسبب أنشطة متشابك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافة الأولية من الخلايا العصبية من الدماغ الثدييات

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوان أجريت في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ولاية ايوا.

  1. إعداد خلية ثقافة فصلها من المناطق CA3-CA1 من الحصين من الفئران أو الجرذان في أيام ما بعد الولادة 0-1 19،20. لوحة الخلايا الحصين coverslips على 12 ملم (سمك الرقم 0) preseeded مع الطبقة المغذية الدبقية الفئران، في أطباق 24 أيضا، وعلى كثافة 12،000 خلية / جيدا.
  2. ثقافة الخلايا العصبية قرن آمون لمدة 8 أيام على الأقل لمحطات العصبية وظيفية لتطوير 21. نستخدم الخلايا العصبية على 11-14 أيام في المختبر عند النهايات العصبية الفردية المعزولة نسبيا دون الكثير من المجموعات. الخلايا العصبية يمكن أن تستخدم للتجارب تصل إلى حوالي 21-28 أيام في المختبر مثل WILLIG وآخرون 22 وNosyreva وKavalali 23.
  3. إلىالدراسات الفنية، وتقييم coverslips (قبل تلطيخ) لمؤشرات صحية الخلايا العصبية باستخدام المجهر الضوئي المنقولة (مثل المرحلة البصريات النقيض في التكبير من 20X 10). مؤشرات الصحة الجيدة وتشمل: طبقة موحدة الدبقية الخلية، بهامش الخلوية واضحة حول الخلايا العصبية، التشعبات تمديد دون هياكل مطرز، والافتقار إلى somata متفاوت المسافات، وعدم وجود neurites التي المجمعة.

2. تحميل الحويصلات متشابك مع صبغ FM (تلطيخ)

  1. تلطيخ بسبب النشاط متشابك التي حركها التحفيز مجال كهربائي (ينطوي على إمكانات العمل)
    1. إعداد تلطيخ الحل 1 بإضافة صبغة FM إلى حل خالية من صبغ أساس HEPES، مثل حل تايرود (انظر SOLUTIONS للحصول على التفاصيل). تركيز صبغة FM هو 10 ميكرومتر FM1-43 و 2.5 ميكرومتر FM4-64. نطاقات تركيز النموذجية هي: 2-15 ميكرومتر FM1-43، أو 2.5-20 ميكرومتر FM4-64 3،6. للتجارب التي تتطلب قمع المتكررةالنشاط متشابك الجلوتاميرجي وتحريض اللدونة متشابك، تضيف المزيد من مضادات مستقبلات الغلوتامات ionotropic: مستقبلات أمبا (على سبيل المثال 10 ميكرومتر CNQX) ومستقبلات NMDA (على سبيل المثال 50 ميكرومتر AP5).
    2. نقل ساترة مع الخلايا من مستنبت لغرفة التصوير مملوءة مسبقا مع حل سهل لتايرود. نستخدم غرفة التصوير مع أقطاب التحفيز التي تعلق على الجدران الجانبية (أسلاك البلاتين مفصولة 6.3 مم، RC-21BRFS). تم تصميم هذه الغرفة كغرفة مغلقة التصوير، لكننا استخدامه بمثابة غرفة مفتوحة (أي دون ساترة أعلى)، مع حجم حمام من ~ 200 ميكرولتر. أثناء النقل، لا تعرض الخلايا المستزرعة في الهواء، وتجنب معسر الخلايا المستزرعة مع ملاقط (اختيار ما يصل ساترة من المحيط بدلا من قرب وسط).
    3. يروي غرفة التصوير مع حل سهل لتايرود في درجة حرارة الغرفة (23-25 ​​درجة مئوية).
    4. تطبيق حل تلطيخ 1 من قبل المشتركنضح nstant.
    5. استحضار النشاط متشابك من خلال تطبيق نبضات كهربائية. لتلطيخ القصوى من إجمالي بركة إعادة تدوير الحويصلات متشابك في الخلايا العصبية قرن آمون، وتحفيز الثقافات في 10 هرتز لمدة 60-120 ثانية 24. عند محاولة تحقيق الكفاءة القصوى لتحفيز الحقل، والحفاظ على العديد من الميزات في الاعتبار. 1) يجب أن يكون ارتفاع الحل حمام أدنى مستوى ممكن، مع الحفاظ على الخلايا العصبية وتحفيز أقطاب مغمورة تماما في طبقة رقيقة من الحل تايرود (من اجل الحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة والحصول على مجال كهربائي متجانسة). 2) يجب أن يكون الأمثل كثافة الحالي ومدة استخدام مؤشرا على استثارة الخلايا العصبية، مثل الفلورسنت كا 2 + التصوير؛ في حالتنا، وهو تيار مستمر من 30 مللي أمبير كثافة ومدة 1 ميللي ثانية يعطي نتائج موثوقة. 3) ينبغي تطبيق حل حمام في تدفق مستمر خلال التحفيز، والتحفيز الكهربائي يؤدي إلى التحليل الكهربائي، مما تسبب البروتونات (H (مثل هانكس "محلول ملحي متوازن مع أحمر الفينول).
    6. ترك الخلايا العصبية في تلطيخ الحل 1 ل60 ثانية إضافية بعد إنهاء التحفيز المجال، بحيث سيتم الانتهاء الإلتقام آخر التحفيز-25.
    7. غسل الحل تلطيخ للخروج من غرفة التصوير بواسطة perfusing مع الشطف حل 1 حل لتايرود خالية من الصبغة زائد مضادات مستقبلات أمبا ومستقبلات NMDA (انظر القسم 2.1.1)، ومانع من التي تعتمد على الجهد نا قنوات + ( على سبيل المثال 0.5-1 ميكرومتر سم الأسماك الرباعية الأسنان، TTX). سوف مزيج من حاصرات قمع فقدان الصبغة FM من خلال النشاط متشابك عفوية. لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة والغسيل، وزيادة معدل التروية (<م> على سبيل المثال تصل إلى 5-6 مل / دقيقة) لمدة 1-2 دقيقة، وإضافة بلعة (على سبيل المثال 1 مل) من الشطف حل 1 مباشرة إلى غرفة التصوير المفتوحة يدويا، وذلك باستخدام ماصة. السيطرة على قوة واتجاه التسريب اليدوي، حتى لا تعكر صفو الخلايا العصبية مثقف.
  2. تلطيخ بسبب النشاط متشابك التي حركها عالية K + الحل (لا تنطوي على إمكانات العمل).
    1. إعداد تلطيخ الحل 2 بإضافة الصبغة FM إلى حل عالية K + تايرود. على وجه التحديد، وإعداد حل تايرود تعديل مع 45 ملي بوكل، من خلال استبدال متساوي المولية من بوكل لكلوريد الصوديوم. إذا لزم الأمر، إضافة مضادات للأمبا وNMDA المستقبلات. وهذا الحل العالية K + يزيل الاستقطاب الخلايا العصبية باستمرار، وتمكين كا 2 + تدفق في النهايات العصبية، والشروع في حويصلة متشابك إيماس إلى الحد الأقصى 26. واستخدمت تركيزات أعلى (70-90 ملم) أيضا في تقارير أخرى مثل Klingauf آخرون 27 ود ريتشاردز وآخرون 28
    2. نقل ساترة مع الخلايا العصبية مثقف من مستنبت لغرفة التصوير مملوءة مسبقا مع حل سهل لتايرود.
    3. وصمة عار على الخلايا العصبية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة من خلال تطبيق حل تلطيخ 2 في نضح ثابتة أو باستخدام 26،28 ماصة. في الحالة الأخيرة، يجب أن تسيطر على تركيز الصبغة النهائية بإضافة حجم معروفة من حل تلطيخ 2 إلى وحدة تخزين معروفة من محلول خالية من الصبغة.
    4. غسل الحل تلطيخ للخروج من غرفة التصوير، كما هو موضح في القسم 2.1.7.
  3. تلطيخ بسبب النشاط متشابك عفوية ومصغرة.
    1. Prewarm الحل القائم على بيكربونات (على سبيل المثال متوسطة الأساسية الدنيا، MEM) إلى 37 درجة مئوية عن طريق وضع في حاضنة الثقافة لأكثر من 60 دقيقة.
    2. لتلطيخ على أساس النشاط متشابك عفوية، وإعداد حل تلطيخ 3 بإضافة صبغة FM إلى MEM. لتلطيخ على أساس مiniature النشاط متشابك، وإعداد حل تلطيخ 4 بإضافة TTX إلى حل تلطيخ 3.
    3. الخلايا العصبية وصمة عار طريق نقل ساترة مع الخلايا العصبية مثقف من مستنبت لتلطيخ الحل 3 أو 4، وتركهم في حل تلطيخ نفسه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    4. شطف ساترة لفترة وجيزة في الشطف حل 1.
    5. نقل ساترة لالشطف الحل 1 في غرفة التصوير. نأخذ في الاعتبار ما يلي. 1) لا ينبغي أن تتعرض الخلايا إلى الهواء، وإذا لزم الأمر، نقل ساترة مباشرة إلى غرفة التصوير دون الشطف. 2) الخلايا العصبية يمكن أن تكون ملطخة في درجة حرارة الغرفة عن طريق استبدال الحل تلطيخ 3 أو 4 مع حل يستند HEPES. 3) يمكن ملطخة الخلايا العصبية للنشاط متشابك منبهات المسموعة في سياق ارتفاع-K + الحل باستخدام هذا الأسلوب، من خلال استبدال حل تلطيخ 3 أو 4 مع حل تلطيخ 2 وتنفيذ الخطوات المتبقية في درجة حرارة الغرفة.
    6. غسل الحل تلطيخ من التصويرالغرفة كما هو موضح في القسم 2.1.7.

3. غسل خارج صبغ FM

  1. بعد تلطيخ الخلايا العصبية وغسل الأولية من قبل أي من الأساليب المذكورة أعلاه (القسم 2.1.7)، ومواصلة يروي غرفة التصوير مع الشطف حل 1 لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سيؤدي هذا إلى إزالة الصبغة FM من غشاء البلازما والحل خارج الخلية. في حالة غرفة التصوير لدينا، فإن معدل حمام نضح هو 600-1،200 ميكرولتر / دقيقة. ويمكن أيضا أن يتم الغسيل في غياب خارج الخلية كا 2 + لقمع FM فقدان الصبغة نتيجة لأنشطة متشابك 17. ويمكن تعزيز يغسل من قبل تطبيق موجز للAdvasep-7، وهو تعديل cyclodextrin التي هي بمثابة زبال الأصباغ FM من غشاء البلازما 29-31. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على أي Advasep-7 التعرض القصير (على سبيل المثال 5 ثانية في حالة الثقافة أحادي الطبقة) لتجنب كل من خفض كثافة نقاط وFM 31 والمساس هيئة التعليم العاليLTH من الخلايا. ويمكن أيضا مضان من FM1-43 في غشاء البلازما يمكن منعها عن طريق تطبيق sulforhodamine فاكهه تقضي 101 (50-100 ميكرومتر) التي لا يدخل الحويصلات متشابك 32.

4. البحث عن حقل صورة الأمثل أثناء الغسل

  1. تحقق من أن الخلايا في الميدان ليمكن تصوير يتمتعون بصحة جيدة، وذلك باستخدام المجهر الضوئي المنقولة مع ارتفاع التكبير وعالية العددية الفتحة عدسة الهدف (على سبيل المثال 40X). من هذا الباب، فإننا نواصل استخدام المجهر (الكسوف تي، نيكون) مقلوب مجهزة مرحلة التباين أو البصريات النقيض تدخل الفرق. وقد تم تجهيز هذا المجهر أيضا مع الكمال نظام التركيز (PFS) التي تمكن المستمر، في الوقت الحقيقي التصحيح التركيز، الذي يتغلب على الانجراف المجهر التركيز. هذه الميزة الأساسية للالوقت الفاصل بين التصوير خلال destaining مع نفس الطائرة مع التركيز.
  2. تحقق هو أن تلطيخ فعالة، باستخدام البصريات مضان. مركباتالمجاميع OID من نقاط وزير الخارجية إلا إذا كانوا هم الهدف من البحث، لأن حبات الفردية سوف يكون من الصعب تمييز. إيلاء الاهتمام لأشكال من نقاط وزير الخارجية: إذا كان معظم من حبات الملون تظهر كسلاسل من الخرز دائرية، فإنها يمكن أن تمثل المحطات العصبية غير صحية. تقليل تعرض الخلايا العصبية إلى الإثارة مضان قوية من أجل تجنب photobleaching من.

5. تفريغ FM صبغ من الحويصلات متشابك (Destaining)

  1. Destaining بسبب النشاط متشابك التي حركها التحفيز مجال كهربائي.
    1. غسل TTX بها perfusing الخلايا العصبية على نطاق واسع مع حل الشطف 2 (نفس الشطف حل 1 ولكن من دون TTX). تأكيد فعالية TTX فشل في تجارب منفصلة، ​​وذلك باستخدام المعلمات نفس الغسيل (معدل نضح والمدة)، مثلا عن طريق الفلورسنت كا 2 + التصوير من حشوية كا 2 + العابرين الناجم عن تحفيز الميدان، أو عن طريق تسجيل التصحيح، المشبك من فولتنا + التيارات التي تعتمد على العمر.
    2. بدء تصوير الأصباغ FM. لتصوير FM1-43-64 أو FM4، استخدم 520 نانومتر أو 650 مرشحات الانبعاثات تمريرة طويلة نانومتر، على التوالي، ومرشح الإثارة 490 نانومتر. الحصول على صور كل 1-2 ثانية، وذلك باستخدام وقت قصير التعرض (مثل 10-20 ميللي ثانية)، وضعف شدة الإثارة (مثل 5-10٪ من الطاقة LED)، وحساسية عالية (على سبيل المثال مع زيادة EM). تقليل photobleaching من الأصباغ من وزير الخارجية عن طريق تقليل زمن التعرض وكثافة مضان الإثارة. تقليل المجهر التركيز الانجراف عن طريق تشغيل نظام التركيز الكمال.
    3. تحفيز الخلايا العصبية في حل الشطف 2، وذلك باستخدام مجال التحفيز (على سبيل المثال عند 10 هرتز لمدة 120 ثانية) 20.
    4. تطبيق جولات متعددة من التحفيز، مع التدخل فترات الراحة من 1-2 دقائق، لتستنزف كل الحويصلات متشابك إعادة التدوير من الصبغة FM. هذا هو المهم عند تقييم حجم إجمالي بركة إعادة تدوير الحويصلات متشابك التي كانت ملطخة بالأصباغ في ال FMه الدولة قبل 20،33.
  2. Destaining بسبب أنشطة متشابك أثار في غياب إمكانات العمل.
    1. بدء تصوير صبغ FM.
    2. تطبيق الكواشف محفزة المذاب في محلول الشطف 1 أو 2. وتشمل مثل هذه الكواشف: بوكل (عالية K + الحل، على سبيل المثال 45 ملم) 26، ionomycin (أ كا 2 + حامل الأيون، وترفع من الكالسيوم داخل الخلايا 2 + تركيز من خلال السماح كا 2 + تدفق في الخلية من حل خارج الخلية، على سبيل المثال تستخدم في 5 ميكرومتر) 20،34، والسكروز (حل التوتر الذي يحفز الافراج عن حويصلات متشابك من تجمع نشره بسهولة، على سبيل المثال تستخدم عند 500 ملي) 35،36. استخدام نظام نضح المحلية سريع لعنصر تحكم الزمانية موثوق بها في تطبيق الكواشف، مثل نظام SF-77B من الآلات وارنر من 37، أو نظام Y-أنبوب 38-40.
  3. Destaining بسبب عفوية ودقيقةiature النشاط متشابك.
    1. لdestaining بسبب النشاط متشابك عفوية، تغسل TTX على النحو الوارد أعلاه (القسم 5.1.1)، وذلك باستخدام الشطف حل 2. بدء تصوير الأصباغ FM حين perfusing الخلايا العصبية مع الشطف حل 2. لdestaining بسبب أنشطة متشابك مصغرة، بدء التصوير الأصباغ وزير الخارجية، مع الاستمرار في يروي الخلايا العصبية مع الشطف حل 1 (مع TTX).
    2. بعد destaining على أساس النشاط إما عفوية أو مصغرة، وتحديد المحطات العصبية الوظيفية التي destaining عبر أثار النشاط متشابك. النشاط يمكن أثار من قبل أي من الإجراءات المذكورة أعلاه. هذه عملية تحديد الهوية أمر ضروري لأن هياكل ملطخة يمكن أن تكون تلك الأخرى من النهايات العصبية وظيفية (مثل إعادة التدوير ببطء الإندوسومات أو الحويصلات نجمي) وكمية كبيرة من destaining من الوسائل المسموعة النشاط في هذه العملية.

6. تقييم قيم photobleaching من الأصباغ FM

  1. وصمة عار على النهايات العصبية مع ألدهيد يمكن حلها FM صبغ (على سبيل المثال FM1-43FX، FM4-64FX). يمكن أن يتم ذلك باستخدام أثار، عفوية، أو مصغرة طريقة تلوين المذكورة أعلاه، وبالاستعاضة صبغ FM مع صبغة FM يمكن حلها.
  2. تغسل الصبغة FM يمكن حلها كما هو موضح في القسم 2.1.7.
  3. كيميائيا إصلاح الخلايا العصبية عن طريق نقل ساترة إلى حل تثبيتي: بارافورمالدهيد 4٪ و 4٪ سكروز في محلول تايرود لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. سيتم الاحتفاظ كثافة مضان من صبغ FM قابل للتثبيت بعد التثبيت الكيميائية.
  4. تغسل تثبيتي لمدة 10 دقيقة في محلول تايرود، من خلال نقل ساترة إلى حل تايرود الطازج مرتين.
  5. نقل ساترة إلى حل تايرود الطازجة في غرفة التصوير.
  6. بدء تصوير صبغ FM يمكن حلها باستخدام نفس مجموعة من المعلمات التصوير بالنسبة للخلايا العصبية الحية. فمن المهم لشطف غرفة التصوير جيدا بعد استخدام أية عينة ثابتة كيميائيا، لأي تثبيتي المتبقية يمكن أن تؤثر اللاحقة تجارب التصوير الخلية الحية التي نفذت في الغرفة نفسها. بدلا من ذلك إلى التصوير الخلية ثابتة، قد يمكن تصوير الخلايا الحية الملون لتقييم معدل photobleaching من. ومع ذلك، يجدر الأخذ في الاعتبار أنه من الصعب لمنع النشاط متشابك مصغرة تماما، على سبيل المثال، وتواتر النشاط مصغرة يمكن خفضها الى 50٪ ~ عن طريق إزالة الكالسيوم خارج الخلية 2 + 23، ولكنها ليست كاملة الحصار.
  7. في نهاية كل دورة التصوير، والحصول على صورة خلفية لتقييم القيمة المطلقة للكثافة مضان FM. كثافة نقاط وزير الخارجية لا يمثل إشارة الحقيقية من الأصباغ FM في النهايات العصبية، ولكن أيضا من الضوضاء في الخلفية من 1) الخلايا الدبقية التي تشكل أساس ثقافة أحادي الطبقة العصبية، 2) ساترة والمكونات البصرية (عدسة على سبيل المثال الهدف والفلاتر و المرايا)، و 3) كاشف (الكاميرا EMCCD). الضوضاء في الخلفية هو ASSEssed في المناطق nonstained الحقل المصورة. عندما تكون هذه المناطق محدودة في الفضاء أو غير متجانسة في شدة، استبدالها صورة مع مصراع الكاميرا مغلقة واكتساب الضوضاء من كاشف، على الرغم من أنها ليست الأسلوب الأمثل. الحصول على ما يقرب من 10 صور باستخدام المعلمات التصوير نفسها.

7. تحليل صورة

  1. استيراد البيانات المكتسبة في البرنامج تحليل الصورة كما كومة من السلاسل الزمنية الصور. نستخدم يماغيج (WS Rasband، NIH) ويرتبط المكونات الإضافية، مثل مثبت الصورة في المكونات (كانغ لى) لتصحيح درجة صغيرة من الحركة بين نقاط وزير الخارجية، والسلاسل الزمنية محلل V2.0 (بالاجي جايابراكاش) لتحليل السلسلة الزمنية.
  2. حساب التغيرات في كثافة FM في بداية ونهاية المسلسل (ΔFM). تحقيقا لهذه الغاية، متوسط ​​الصور قبل بداية destaining وبعد انتهاء destaining (مثل إطارات الصور 5 لكل منهما)، وتوليد صورة الفرق التي كتبها subtractinز لهم.
  3. تحديد المحطات العصبية يحتمل الوظيفية من خلال تطبيق عتبة كثافة للصورة الفرق، وكشف بكسل الذي كثافات أعلى من العتبة. أسلوب واحد من تحديد عتبة هو اختيار الانحراف المعياري من شدة الخلفية التي تم الحصول عليها من منطقة ساترة العارية.
  4. تحديد معزولة، والمحطات العصبية الوظيفية كما بكسل متجاورة التي تم الكشف عنها والتي تلبي معيار حجم (أرقام الحد الأدنى والحد الأقصى من وحدات البكسل في التواصل). هذه العملية يزيل الضوضاء الخلفية والمحطات العصبية مجمعة من التحليل.
  5. تعيين مناطق المصالح (رويس) على مجموعات بكسل الكشف (مع مجموعات فردية المقابلة لمحطات العصبية الفردية). التغيير الكلي في كثافة خلال destaining (ΔFM) معلمة نموذجية من التحليل. يمثل هذا المبلغ التراكمي للمنبهات المسموعة، عفوية أو مصغرة النشاط متشابك. استبعاد رويس إذا ظهرت عليها أي من الإجراءات التاليةالتغيرات في كثافة اعتمادا على أغراض التجارب: زيادة أثناء التسجيل، انخفاض مفاجئ قبل التحفيز، أو الكمون بعد فترة طويلة من التحفيز.
  6. تقييم معدل photobleaching من طريق استيراد بيانات السلاسل الزمنية المكتسبة في البرنامج صورة التحليل. متوسط ​​الصور الخلفية (على سبيل المثال مع مصراع المغلقة)، وتطرحه من الصور الفردية. تعيين رويس لنقاط وFM التي تتوافق مزعومة لمحطات العصبية، وقياس التغيرات في كثافة العائد على الاستثمار مع مرور الوقت.

حلول

  1. الحل تايرود
    • تكوين (مم): 125 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، 2 و CaCl 2، 2 MgCl 2، 30 الجلوكوز، 25 HEPES، 310 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. تلطيخ الحل 1
    • الحل بالإضافة إلى صبغ FM في تايرود.
    • ويستخدم هذا الحل لتلطيخ، على أساس أثار النشاط متشابك بواسطة التحفيز الكهربائي.
    • إضافة مضادات مستقبلات أمبا وNMDA receptoالتمرير إذا لزم الأمر.
  3. حل تلطيخ 2
    • حل عالية + K-تايرود بالإضافة إلى صبغ FM.
    • ويتم إعداد هذا الحل تايرود تعديل عن طريق زيادة تركيز إلى 45 ملي بوكل، من خلال استبدال متساوي المولية من بوكل لكلوريد الصوديوم.
    • ويستخدم هذا الحل لتلطيخ، على أساس أثار النشاط متشابك عن طريق الاستقطاب المستمر.
    • إضافة مضادات مستقبلات أمبا ومستقبلات NMDA إذا لزم الأمر.
  4. حل تلطيخ 3
    • الحل MEM بالإضافة إلى صبغ FM.
    • ويستخدم هذا الحل لتلطيخ، على أساس النشاط متشابك عفوية.
  5. حل تلطيخ 4
    • الحل MEM بالإضافة إلى صبغ FM وTTX.
    • ويستخدم هذا الحل لتلطيخ، على أساس النشاط متشابك مصغرة.
  6. الشطف حل 1
    • الحل بالإضافة إلى مضادات مستقبلات أمبا ومستقبلات NMDA في تايرود، وTTX.
  7. الشطف حل 2
    • الحل بالإضافة إلى مضادات مستقبلات أمبا ومستقبلات NMDA في تايرود، ولكن من دون TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كمثال على ذلك، وتبين لنا نتائج ممثل للدورة الوقت destaining من الحويصلات متشابك (الشكل 4). كانت ملطخة الخلايا العصبية الحصين مثقف مع FM4-64 باستخدام النشاط متشابك عفوية (الخطوة 2.3) وغسلها بمحلول خالية من الصبغة (الشطف حل 2). يظهر التصوير في destaining بالطبع الوقت الأولي باستخدام النشاط العفوي (الخطوة 5.3) (الجزء الأول من خط متواصل، الشكل 4A). ويعقب ذلك من خلال مسار الوقت destaining باستخدام ثلاث جولات من النشاط منبهات المسموعة مع 10 هرتز التحفيز المجال ل120 ثانية كل (الخطوة 5.1). ويتضح طريقة واحدة لقياس كمية destaining منبهات المسموعة مع سهم مزدوج العضوية (ΔFM مستدعى) الذي يتوافق مع حجم إجمالي بركة إعادة تدوير الحويصلات.

قبل أن تعطى التحفيز الأولى، كان هناك انخفاض تدريجي في كثافة FM (الموسع في الشكل 4B). كان يتألف هذا الانخفاض من destainingبسبب النشاط متشابك عفوية (ΔFM مذكورة عفويا) وphotobleaching من (ΔFM PB). عندما مساهمة photobleaching من هو صغير، والتغيير من خط الأساس preimaging (ΔFM مذكورة عفويا + ΔFM PB) يمكن استخدام تقريبي لكمية destaining من النشاط العفوي.

الشكل 1
الشكل 1. هياكل الأصباغ FM. الأصباغ A. FM أسهم بعض السمات الهيكلية المشتركة. المجموعات ماء البقاء في محلول مائي وذيول مسعور تسمح الأصباغ FM لتكون مقسمة إلى الغشاء. FM2-10، FM1-43-84 وFM1 المعرض الانبعاثات الخضراء، في حين FM5-95-64 FM4 وتظهر حمراء تحول الانبعاثات. B. Stereoview من FM1-43، وصبغ FM الأكثر شيوعا. تواجه مجموعة ماء صعودا وتواجه ذيول مسعور أسفل. Nitrيتم تلوين ذرات ogen الأزرق. لعرض آخر من FM1-43، انظر Schote وSeelig 63.

الرقم 2
الشكل 2. المخطط الأساسي من استخدام صبغة FM. بعد تطبيق الخلايا العصبية، وصبغ FM إدراجها في غشاء البلازما يصبح الفلورية (الخضراء)، في حين أنه في محلول مائي هو أقل بكثير الفلورسنت (الرمادي). يتم تحميل حويصلة متشابك (SV) (الملون) من قبل صبغ FM، عندما يخضع الإلتقام، وعادة التالية إيماس. غسل خارج الصبغة FM في حل خارج الخلية تمكن فقط الحويصلات الملون لتكون الفلورسنت. بعد ذلك، يتم تفريغ حويصلة متشابك (destained) عندما يخضع إيماس، وبالتالي يطلق الصبغة FM. يوضح صورة أدناه تلطيخ نموذج من الخلايا العصبية الحصين مثقف مع FM1-43 (تراكب ومضان المرحلة على النقيض من الصور). ومن الجدير بالملاحظة أنه في البروتوكول وصفها في هذه الورقة، ونقاط والفلورسنت تمثل محطات قبل المشبكي العصبية (بأقطار ~ 1 ميكرون في الخلايا العصبية المركزية نموذجي) مع مجموعات من الحويصلات متشابك الملون، وليس الحويصلات متشابك الفردية (بأقطار ~ 40 نانومتر). للبساطة، يمثل هذا المخطط فكرة عامة عن إكسو الإلتقام من الحويصلات متشابك. ويمكن أن تشمل أشكالا متعددة من EXO-الإلتقام، مثل اندماج كامل انهيار تليها بوساطة بالكلاذرين الإلتقام، وقبلة عابرة والفر إكسو الإلتقام، والجزء الأكبر الإلتقام 64. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. ثلاثة أنواع من الأنشطة متشابك يدرسها التصوير FM. أثار النشاط متشابك يتطلب عادة، المحفزات الكهربائية الخارجية. يحدث النشاط متشابك عفوية في غياب المحفزات الكهربائية. يحدث النشاط متشابك مصغرة عفويا دون المحفزات الكهربائية ودون إمكانات العمل: عادة ما يتم قمعها عمل الجيل المحتملة التي كتبها مانع من التي تعتمد على الجهد قناة + نا، سم الأسماك الرباعية الأسنان. وتشمل الأنشطة الإضافية النشاط منبهات المسموعة عندما يتم تحفيز إيماس من ارتفاع-K + الحل (الاستقطاب المستمر)، ionomycin (الزيادة المستمرة في هيولي كا 2 + تركيز)، وتحتوي على محلول مفرط التوتر السكروز (انتزاع إيماس من الحويصلات في تجمع نشره بسهولة)، وجميعها لا تتطلب إمكانات العمل لإطلاق حويصلات متشابك للخضوع إيماس. نلاحظ أنه، في بعض الدراسات، يتم تعريف النشاط العفوي على نطاق واسع ليشمل النشاط مصغرة كذلك.

igure 4 "FO: محتوى العرض =" 5IN "سرك =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 4. نتيجة ممثل destaining. كانت ملطخة A. الخلايا العصبية الحصين مثقف حسب النشاط العفوي مع 2.5 ميكرومتر FM4-64 لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية (الخطوة 2.3)، وغسلها (بروتوكول 3). تم تصوير الخلايا العصبية خلال destaining مع النشاط العفوي (الخطوة 5.3)، وثلاث جولات من الأنشطة أثار (الخطوة 5.1) (منحنى مستمر، متوسطه ن = 25 النهايات العصبية). أشرطة عمودية تمثل SEM. يمثل Y-المحور كثافة FM المطلقة و"0" يمثل كثافة عند إغلاق مصراع الكاميرا. يشار إلى المبلغ الإجمالي للdestaining منبهات المسموعة (ΔFM مستدعى). توسيع B. وجهة نظر من المرحلة الأولى من destaining في لوحة A (منحنى مستمر والحانات SEM حذف لوضوح). خلال الملاحظة ثانية 60، وكان الحاجزة يرجع ذلك أساسا إلى فعل عفويةivity (ΔFM مذكورة عفويا) ولكن كان جزئيا بسبب photobleaching من (ΔFM PB). تم تحديد دوام photobleaching من من FM4-64 (منحنى منقط سميكة) في تجربة منفصلة عن طريق التصوير يمكن حلها FM4-64 (البروتوكول 6). كان معدل 2-3٪ أكثر من 2 دقيقة (وظيفة واحدة مع الأسي ثابت وقت 5،736 ثانية، والتي تحددها منحنى المناسب أكثر من 9 دقيقة) 19. ولفت منحنى photobleaching من بوصفها الدالة الأسية مع ما يعادل القيمة الأولية إلى أن من كثافة يقاس من FM4-64. انظر الشكل S5 التكميلية في Kakazu وآخرون (19) لphotobleaching من خلال فترة أطول (9 دقائق)، ومتغير مع شدة الإثارة والتعرض الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفناها بروتوكولات لتلطيخ وdestaining الحويصلات متشابك استجابة للأثار، والنشاط متشابك عفوية ومصغرة، وللتصوير خلال المرحلة destaining. بالإضافة إلى البروتوكولات القائمة، أدرجنا بروتوكول جديد لمراقبة destaining FM على أساس النشاط متشابك مصغرة. باستخدام هذه البروتوكولات، حددنا سابقا شذوذ في الخلايا العصبية مثقف من نموذج الفأر من خلل التوتر اضطراب الحركة. بالمقارنة مع نظرائهم في البرية من نوع الفئران، خضع تلك الخلايا العصبية تسارع متشابك إيماس حويصلة في كا 2 + التي تعتمد على الطريقة عندما يحفزه ارتفاع النشاط 20. كما أظهرت تلك الخلايا العصبية أكثر تواترا النشاط متشابك مصغرة، وهو ما أكدته التصحيح المشبك التسجيلات الكهربية من الافراج عن العصبي 19.

على الجانب الحاسم من بروتوكول لاستخدام الأصباغ وزير الخارجية في مثل هذه التحليلات هو نكتق ق وتقليل photobleaching من. التغييرات الطفيفة في كثافة مضان FM يمكن تقييمها بشكل موثوق إذا كانت التغييرات التي تسببها photobleaching من هي صغيرة بالمقارنة مع تلك الناجمة عن النشاط متشابك. لديه انخفاض photobleaching من أيضا القدرة على قمع أو القضاء السمسة. ويمكن تخفيض photobleaching من طريق التقليل من التعرض للضوء fluorophores إلى الإثارة، وهناك ما لا يقل عن اثنين من مكونات المعدات للقيام بذلك في التجارب الحية التصوير. أحد المكونات الهامة هو كاشف الحساسة من الفوتونات، مثل كاميرا EMCCD. هذا يجعل من الممكن للحد من مدة وشدة التعرض دون أن يؤثر ذلك سلبا على الكشف عن الانبعاثات مضان. عنصر يرتبط هو نظام مصدر الضوء الذي يحد من التعرض للعينة للضوء الإثارة فقط عندما يكتسب كاشف الصور. ويتحقق هذا بسهولة عن طريق ضوء LED 41 التي تسمح للسيطرة فعالة توقيت التعرض للضوء (ON / OFF راكيس أقل بكثير من 1 ميللي ثانية). يمكن أن تسبب التعرض فقط أثناء التقاط الصور، من خلال الإخراج الرقمي من الكاميرا (على سبيل المثال "النار" في محطة الكاميرا أندور). مزايا إضافية من استخدام LED تشمل: القدرة على التحكم في شدة الضوء من دون استخدام مرشحات الكثافة محايدة، والاستقرار على المدى الطويل من شدة الضوء، وغياب الاهتزازات الميكانيكية التي من شأنها أن تتداخل مع دقة المناولة من الماصات الزجاج كما هو الحال في تسجيل التصحيح، المشبك .

بشكل عام، والأصباغ المختلفة هيكليا photobleach بمعدلات مختلفة في ظل ظروف التصوير نفسها. وبالتالي سيكون من المثالي لتقييم مدى photobleaching من من fluorophore المستخدمة في تجربة معينة. أصباغ FM في النهايات العصبية الحية، فإنه يمثل تحديا تقنيا لتقييم مستقلة معدل photobleaching من النشاط متشابك، وذلك بسبب النشاط متشابك عفوية أو مصغرة. وحدث انخفاض في كثافة مضان خلال هذه activitذ يمكن أن يكون بسبب فقدان البيولوجية الأصباغ FM (إيماس)، photobleaching من الأصباغ وزير الخارجية، أو كليهما. لحسن الحظ، فقد تم تصميم هياكل الأصباغ FM يمكن حلها لتكون مماثلة تقريبا لتلك التي من الأصباغ FM nonfixable. في البروتوكول وصفها هنا، تم تحميل الأصباغ FM يمكن حلها في الحويصلات متشابك من الأساليب نفسها الأصباغ FM nonfixable، في حين تم حظر النشاط متشابك بعد ذلك من قبل التثبيت الكيميائية للعينة. أبرزها، كان معدل photobleaching من قياسها باستخدام هذا النظام منخفضة تصل إلى 2-3٪ أكثر من 2 دقيقة عندما كانت ظروف التصوير نفس تلك لتصوير الخلايا الحية 19.

الأصباغ FM يمكن استخدامها مع بروتوكولات مختلفة لاستكشاف الجوانب المختلفة لإعادة تدوير حويصلة متشابك. أنشطة مختلفة خلال تلطيخ متشابك وdestaining يمكن الجمع بطرق مختلفة، اعتمادا على أهداف تجريبية وميزات معينة لإعادة تدوير حويصلة متشابك على أن يقسم. اختيار antagonيعتمد ISTS أيضا على الغرض من التجارب. وعلاوة على ذلك، والتصوير FM يمكن القيام بها خلال المرحلة تلطيخ وكذلك خلال المرحلة destaining 9،18،42. وينبغي أيضا أن يؤخذ في الاعتبار، ومع ذلك، يمكن أن يكون لها آثار الأصباغ FM غير متوقعة، مثل منع المستقبلات أستيل المسكارينية 43، وتتخلل القنوات mechanotransducer 44، التي تديرها متجر كا 2 + قنوات 45، ومستقبلات ATP 46. تركيزات عالية من الأصباغ FM يحتمل يمكن تعديل كفاءة متشابك الحويصلة إيماس نفسها 47. وبالتالي فإننا نوصي الحذر في تصميم التجارب وتفسير النتائج المتعلقة إعادة تدوير حويصلة متشابك. وسوف تشمل وسائل مكملة للنظر في الحويصلات متشابك امتصاص الأجسام المضادة التي الحواتم هي المجالات داخل lumenal من البروتينات حويصلة 22،48. وهي تشمل أيضا معربا عن GFP حساسة للدرجة الحموضة المتغيرات التي تستهدف التجويف حويصلة 49-51، وامتصاصمن حساسة لدرجة الحموضة تقارن الضد 52-54 كلاهما الكشف عن التغييرات درجة الحموضة داخل حويصلي المرافق إكسو الإلتقام.

مرة واحدة يتم استبعاد هذه الآثار غير المرغوب فيها، والأصباغ FM لها تطبيقات واسعة. على سبيل المثال، يمكن استخدامها لمعالجة ما إذا كان يتم تقاسمها نفس برك حويصلة متشابك للعفوية وأثار إطلاق حويصلة 17،55، إلى أي مدى كفاءة إعادة تدوير حويصلة متشابك يمكن تنظيم 56،57، وماذا يفعل الآثار دولة قبل (الراحة أو حفز) بذل على الدولة في وقت لاحق لإعادة تدوير حويصلة على أساس، مثل العفوية والنشاط متشابك مصغرة. ويمكن أيضا الأصباغ FM استخدامها لتقييم إعادة تدوير حويصلة متشابك على مستوى التركيبية، عن طريق الربط بين الملاحظات عن الضوء والمجهر الإلكتروني من خلال طريقة FM photoconversion 30،58-62. صبغ FM يمكن استخدامها لمراقبة وظائف في وقت واحد متشابك والكالسيوم داخل الخلايا 2 + يخدعحدانية 5. بالإضافة إلى وضع العلامات من الحويصلات متشابك، والأصباغ وزير الخارجية وغيرها من علامات السائل المرحلة الفلورسنت مثل ديكستران الفلورسنت 7 يمكن استخدامها لمراقبة الإلتقام السائبة التي يتم تشغيلها بواسطة نشاط الخلايا العصبية الشديدة. في الختام، تطبيقات الأصباغ FM توفر مصدرا قيما للمعلومات بشأن إعادة تدوير حويصلة متشابك متشابك ووظائف إضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر أعضاء المختبر Harata لإجراء مناقشات مفيدة في جميع أنحاء تنفيذ هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية القلب الأمريكية، ومؤسسة البحوث الطبية خلل التوتر، وإدوارد مالينكرودت، ومؤسسة الابن، المؤسسة الوطنية للعلوم، ومؤسسة وايت هول لNCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

علم الأعصاب، العدد 85، محطات قبل المشبكي، متشابك الحويصلات، المجهري، الفحص البيولوجي، والجهاز العصبي، الإلتقام، إيماس، والتصوير مضان، صبغ FM، الخلايا العصبية، photobleaching من
فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter