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Neuroscience

पैदा की, सहज, और लघु Synaptic गतिविधियों के दौरान एफएम रंगों का उपयोग synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के परीक्षा

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

हम कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों में छवि synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए styryl एफएम रंगों के उपयोग का वर्णन. इस प्रोटोकॉल न केवल पैदा करने के लिए, लेकिन यह भी सहज और लघु synaptic गतिविधियों लागू किया जा सकता है. प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से मूल्यांकन किया जा सकता है कि synaptic घटनाओं की विविधता बढ़ती है.

Abstract

कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों में synaptic vesicles एक्सोसाइटोसिस और endocytosis गुजरना. इस synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग प्रभावी ढंग से झिल्ली कारोबार प्रकट जो styryl एफएम रंजक, उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. एफएम रंगों के उपयोग के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल उत्तेजित (पैदा) synaptic गतिविधि निम्नलिखित न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किए गए थे. हाल ही में, प्रोटोकॉल ऐसे सहज या लघु synaptic घटनाओं के रूप में कमजोर synaptic गतिविधियों, के साथ कि एफएम संकेतों का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध हो गए हैं. एफएम संकेतों में इन छोटे परिवर्तन का विश्लेषण इमेजिंग प्रणाली तीव्रता में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है, अभी तक बड़े आयाम की कि artifactual परिवर्तन दबा रहे हैं कि आवश्यकता है. यहाँ हम पैदा की सहज, और लघु synaptic गतिविधियों, और एक उदाहरण के रूप में संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स उपयोग करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह एक महत्वपूर्ण है के रूप में इस प्रोटोकॉल, एफएम रंगों की photobleaching की दर का आकलन करने का एक साधन शामिलतीव्रता में छोटे परिवर्तन जब इमेजिंग कलाकृतियों का स्रोत.

Introduction

synaptic vesicles के कार्यक्षमता synaptic प्रसारण का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है. वे presynaptic प्लाज्मा झिल्ली (एक्सोसाइटोसिस) के साथ फ्यूज जब इन vesicles न्यूरोट्रांसमीटर जारी है, और वे प्लाज्मा झिल्ली (endocytosis) से पुनर्जीवित और neurotransmitter के साथ पुनः लोड होने के बाद रिहाई का एक और चक्र के लिए तैयार हो जाते हैं. की गतिशीलता और synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग अंतर्निहित तंत्र में अनुसंधान काफी styryl एफएम रंजक 1 के लागू होने से त्वरित किया गया है. सकारात्मक (चित्रा 1 ए, चित्रा 1 बी में FM1-43 के stereoview में कई रंगों) हाइड्रोफिलिक सिर समूहों और हाइड्रोफोबिक पूंछ का आरोप लगाया है, जो इन amphipathic अणु, reversibly भरिये और उन्हें permeating बिना लिपिड झिल्ली बाहर कर सकते हैं. एफएम रंगों के समूह कि वे उत्सर्जन प्रकाश की सीमा को प्रभावित है कि इसी तरह की सुविधाओं को साझा करें. उदाहरण के लिए, FM2-10, FM1-43, और FM1-84 दो चक्रीय यौगिकों और थानेदार के बीच एक डबल बांड हैडब्ल्यू हरी उत्सर्जन. उन दोनों के बीच का अंतर अपने hydrophobicity निर्धारित करता है और इसलिए झिल्ली से बाहर निकलने की दर (departitioning) जो हाइड्रोफोबिक पूंछ की लंबाई है. FM5 -95 और FM4-64 के मामलों में, तीन डबल बांड चक्रीय यौगिकों लिंक, और वे लाल उत्सर्जन दिखा. इन रंगों को अपने हाइड्रोफिलिक भागों के संबंध में मतभेद है. वे कारण हाइड्रोफिलिक पर्यावरण के लिए हाइड्रोफोबिक पर्यावरण सापेक्ष में क्वांटम उपज में वृद्धि करने के लिए, जैविक झिल्ली में डाला जाता है जब सभी एफएम रंगों में, प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है. इस प्रकार एफएम तीव्रता में परिवर्तन झिल्ली कारोबार में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं. अलग अलग रंग (उत्सर्जन स्पेक्ट्रा) और hydrophobicities एफएम synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग में एक बहुमुखी अनुसंधान उपकरण रंजक बनाने.

इन सुविधाओं के आधार पर, एफएम रंगों ज्यादातर synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग विश्लेषण करते समय निम्न योजना (चित्रा 2) के अनुसार किया जाता है. न्यूरॉनवे endocytosis (धुंधला) के माध्यम से फार्म के रूप में है synaptic vesicles (SVs) में शुरू किए जाने वाले इसे सक्रिय करने, एफएम डाई युक्त एक कोशिकी समाधान में स्नान कर रहे हैं. डाई तो एक डाई मुक्त कोशिकी समाधान को लागू करने से बाहर धोया जाता है, इस यानी केवल उन सक्रिय रूप से दौर से गुजर endocytosis डाई (चित्रा 2 नीचे) के साथ लोड कर रहे हैं कि synaptic vesicles के एक क्लस्टर में शामिल होंगे कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों, पता चलता है. इसके बाद एक्सोसाइटोसिस बाह्य अंतरिक्ष के लिए एफएम डाई की हानि और प्रतिदीप्ति की एक सहवर्ती नुकसान होता है (destaining; कारण एक हाइड्रोफिलिक पर्यावरण के लिए departitioning और दूर एक्सोसाइटोसिस की साइट से प्रसार करने के लिए दोनों). इसलिए एफएम प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन synaptic पुटिका Exo और endocytosis के संकेतक हैं.

एफएम रंजक विभिन्न जीवों और तैयारी 2,3 में synaptic vesicles दाग ​​और destain के लिए इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण स्तनधारी neur शामिलonal संस्कृतियों 4-9, स्तनधारी मस्तिष्क स्लाइसें 10,11, neuromuscular जंक्शनों 12,13, रेटिना द्विध्रुवी न्यूरॉन्स 14,15, और कोक्लीअ 16 के बालों की कोशिकाओं.

आमतौर पर इस तरह के प्रयोगों में, धुंधला और destaining दोनों बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स (पैदा की गतिविधि) उत्तेजक से शुरू हो रहे. एक बाह्य प्रेरणा (सहज और लघु synaptic गतिविधि) 9,17-19 के अभाव में पुनर्चक्रण के रूप में हाल ही में, हालांकि, कमजोर उत्तेजना के जवाब में synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग भी, विश्लेषण किया गया है. सहज और लघु synaptic गतिविधियों कार्रवाई क्षमता का सहज फायरिंग (चित्रा 3) से जुड़े पूर्व के साथ, बाहरी उत्तेजनाओं के अभाव में होते हैं कि उन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. इन कमजोर synaptic गतिविधियों व्यापक उत्तेजना से चालू होने वाले लोगों की तुलना में एफएम संकेतों में छोटे परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं. माप की आवश्यकता है कि एफएम fluoresc में परिवर्तनखिलाडि़यों तीव्रता सही synaptic पुटिका एक्सोसाइटोसिस या endocytosis लेकिन तीव्रता में artifactual नहीं परिवर्तन को प्रतिबिंबित. विरूपण साक्ष्य का एक कारण एफएम रंगों से प्लाज्मा झिल्ली की अविशिष्ट धुंधला की उपस्थिति है. इस घटक के क्रमिक वार्शआउट ग़लती synaptic गतिविधियों के लिए जिम्मेदार माना जा जाएगा जो मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक क्रमिक परिवर्तन हो जाएगा. यह पहलू (प्रोटोकॉल देखें) उचित तरीके से कम किया जा सकता है. विरूपण साक्ष्य की सबसे उल्लेखनीय कारण synaptic vesicles भीतर बनाए रखा एफएम डाई की photobleaching है. एफएम तीव्रता में photobleaching से संबंधित परिवर्तन मापा जाता है कि जैविक (synaptic) परिवर्तन की तुलना में छोटा होना चाहिए. संवेदनशील कैमरों की हाल ही में विकास, जैसे इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा, यह संभव जोखिम समय छोटा और फ्लोरोफोरे उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रकाश की तीव्रता को कमजोर करके photobleaching कम करने के लिए बनाता है. विरूपण साक्ष्य का एक अन्य कारण एक बहाव मैं हैn प्रकाश माइक्रोस्कोप से ध्यान केंद्रित स्तर. एक इमेजिंग सत्र के दौरान ध्यान केंद्रित बहाव यांत्रिक या थर्मल प्रभाव की वजह से हो सकता है, और ग़लती से मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक परिवर्तन को बढ़ावा मिलेगा.

यहाँ हम यह संभव विशेष रूप से, लघु synaptic गतिविधि, भी कमजोर या कोई उत्तेजना के संदर्भ में synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग का विश्लेषण करने के लिए एफएम रंगों का उपयोग करने के लिए बनाते हैं कि प्रोटोकॉल और उपकरणों का वर्णन. हम सभ्य कृंतक hippocampal न्यूरॉन्स का उपयोग कर, और destaining चरण इमेजिंग, पैदा की और सहज synaptic घटनाओं के दौरान vesicles के धुंधला हो जाना और destaining के उदाहरण दिखाते हैं. हम यह भी कारण synaptic गतिविधियों के लिए किसी भी एफएम डाई नुकसान के अभाव में, एफएम डाई photobleaching की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

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Protocol

1. स्तनधारी मस्तिष्क से न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

इस अध्ययन में प्रदर्शन सभी पशु प्रक्रियाओं आयोवा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं.

  1. प्रसव के बाद दिन 0-1 19,20 पर सीए 3-सीए 1 चूहों से हिप्पोकैम्पस के क्षेत्रों या चूहों के अलग सेल संस्कृति तैयार करें. 24 अच्छी तरह से बर्तन में चूहे glial फीडर परत, साथ preseeded 12 मिमी coverslips (मोटाई संख्या 0), पर और 12,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह के घनत्व पर हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं थाली.
  2. संस्कृति कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों के लिए कम से कम 8 दिनों के लिए hippocampal न्यूरॉन्स 21 का विकास करने के लिए. व्यक्तिगत तंत्रिका टर्मिनलों ज्यादा क्लस्टरिंग बिना अपेक्षाकृत अलग कर रहे हैं जब हम इन विट्रो में 11-14 दिन पर न्यूरॉन्स का उपयोग करें. न्यूरॉन्स इन विट्रो जैसे Willig एट अल. 22 और Nosyreva और Kavalali 23 में लगभग 21-28 दिनों के लिए प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. के लिएकार्यात्मक अध्ययन, प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी (10-20X के एक बढ़ाई जैसे चरण विपरीत प्रकाशिकी) का उपयोग कर स्वस्थ न्यूरॉन्स के संकेतक के लिए (धुंधला पहले) coverslips का आकलन करें. अच्छे स्वास्थ्य के संकेतकों में शामिल हैं: एक समान glial सेल परत न्यूरॉन्स के चारों ओर एक स्पष्ट सेलुलर मार्जिन, मनके संरचनाओं के बिना बढ़ाया डेन्ड्राइट, संकुल somata की कमी, और बंडल neurites की कमी.

2. एफएम डाई के साथ synaptic vesicles (धुंधला) लोड हो रहा है

  1. कारण बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के द्वारा पैदा synaptic गतिविधि को धुंधला (कार्रवाई क्षमता शामिल है)
    1. एक HEPES आधारित डाई मुक्त समाधान के लिए एफएम डाई जोड़कर समाधान 1 धुंधला तैयार करें, जैसे Tyrode समाधान (विवरण के लिए समाधान देखें). एफएम डाई की एकाग्रता 10 माइक्रोन FM1-43 और 2.5 माइक्रोन FM4-64 है. विशिष्ट एकाग्रता सीमाओं हैं: 2-15 माइक्रोन FM1-43, या 2.5-20 माइक्रोन FM4-64 3,6. आवर्तक के दमन की आवश्यकता के प्रयोगों के लिएglutamatergic synaptic गतिविधि और synaptic plasticity की प्रेरण, आगे ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विरोधी जोड़ें: AMPA रिसेप्टर्स (जैसे 10 माइक्रोन CNQX) और NMDA रिसेप्टर्स (जैसे 50 माइक्रोन AP5).
    2. संस्कृति के माध्यम से सादे Tyrode समाधान के साथ प्रीफिल्ड इमेजिंग कक्ष कोशिकाओं के साथ एक coverslip स्थानांतरण. हम ओर दीवारों (प्लैटिनम तार 6.3 मिमी, आर सी 21BRFS द्वारा अलग) से जुड़ी उत्तेजना इलेक्ट्रोड के साथ एक इमेजिंग कक्ष का उपयोग करें. इस कक्ष ~ 200 μl की एक स्नान की मात्रा के साथ, एक बंद इमेजिंग चैम्बर के रूप में बनाया गया है, लेकिन हम (एक शीर्ष coverslip के बिना IE) एक खुला कक्ष के रूप में उपयोग किया जाता है. स्थानांतरण के दौरान, हवा संवर्धित कोशिकाओं का पर्दाफाश, और चिमटी (केंद्र के पास coverslip परिधि से ऊपर के बजाय लेने) के साथ संवर्धित कोशिकाओं pinching से बचने के लिए नहीं है.
    3. कमरे के तापमान (23-25 ​​डिग्री सेल्सियस) पर सादा Tyrode समाधान के साथ इमेजिंग चैम्बर छिड़कना.
    4. सह द्वारा समाधान 1 धुंधला लागू करेंnstant छिड़काव.
    5. विद्युत दालों लगाने से synaptic गतिविधि आह्वान. Hippocampal न्यूरॉन्स में synaptic vesicles के कुल पुनर्चक्रण पूल के अधिक से अधिक धुंधला के लिए, 60-120 सेकंड 24 के लिए 10 हर्ट्ज पर संस्कृतियों को प्रोत्साहित. क्षेत्र उत्तेजना की अधिकतम दक्षता प्राप्त करने के लिए कोशिश कर रहा है, जब मन में कई सुविधाओं रखना. न्यूरॉन्स रखने और पूरी तरह से) जिंदा न्यूरॉन्स रखने के लिए और एक सजातीय बिजली क्षेत्र को प्राप्त करने के क्रम में Tyrode समाधान (की एक पतली परत में डूबे उत्तेजक इलेक्ट्रोड जबकि 1) नहाने के समाधान की ऊंचाई, यथासंभव कम किया जाना चाहिए. 2) वर्तमान तीव्रता और अवधि, जैसे फ्लोरोसेंट सीए 2 + इमेजिंग neuronal excitability का एक संकेतक का उपयोग कर अनुकूलित किया जाना चाहिए, हमारे मामले में, 30 मा तीव्रता और 1 मिसे की अवधि का एक निरंतर चालू विश्वसनीय परिणाम देता है. 3) स्नान समाधान उत्तेजना के दौरान निरंतर प्रवाह पर लागू किया जाना चाहिए, बिजली की उत्तेजना प्रोटॉन, जिससे इलेक्ट्रोलिसिस की ओर जाता है (एच जैसे हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल) होता है कि एक समाधान के माध्यम से सौ से अधिक कुछ दालों से गुजर रहा एक अलग प्रयोग में अम्लीकरण की जाँच करें.
    6. बाद प्रोत्साहन endocytosis 25 पूरा कर लिया जाएगा ताकि क्षेत्र उत्तेजना समाप्त होने के बाद एक अतिरिक्त 60 सेकंड के लिए धुंधला समाधान 1 में न्यूरॉन्स छोड़ दें.
    7. (Rinsing समाधान 1, एक डाई मुक्त Tyrode समाधान प्लस AMPA रिसेप्टर्स और NMDA रिसेप्टर्स (धारा 2.1.1 देखें) का विरोधी है, और वोल्टेज पर निर्भर ना + चैनलों की एक अवरोधक के साथ यह perfusing द्वारा इमेजिंग चैम्बर के बाहर धुंधला समाधान धो लें जैसे 0.5-1 सुक्ष्ममापी tetrodotoxin, TTX). ब्लॉकर्स के संयोजन सहज synaptic गतिविधि के माध्यम से एफएम डाई के नुकसान को दबाने होगा. वॉशिंग क्षमता को अधिकतम करने के लिए, छिड़काव दर (<वृद्धिउन्हें> जैसे ऊपर 1-2 मिनट, और एक पिपेट का उपयोग, मैन्युअल रूप से खुला इमेजिंग चैम्बर के लिए सीधे समाधान 1 rinsing के एक सांस में (उदाहरण के लिए 1 मिलीलीटर) को जोड़ने के लिए) 5-6 मिलीग्राम / मिनट के लिए. सभ्य न्यूरॉन्स को परेशान करने के लिए इतना रूप में नहीं, मार्गदर्शन लगाने की ताकत और दिशा को नियंत्रित.
  2. कारण उच्च + K समाधान द्वारा पैदा synaptic गतिविधि को धुंधला (कार्रवाई क्षमता शामिल नहीं है).
    1. उच्च कश्मीर + Tyrode का समाधान करने के लिए एफएम डाई जोड़कर समाधान 2 धुंधला तैयार करें. विशेष रूप से, NaCl के लिए KCl की equimolar प्रतिस्थापन द्वारा, 45 मिमी KCl के साथ एक संशोधित Tyrode के समाधान तैयार है. यदि आवश्यक हो, AMPA और NMDA रिसेप्टर्स के विरोधी जोड़ें. इस उच्च + K समाधान, लगातार न्यूरॉन्स बिगाड़ना तंत्रिका टर्मिनलों में सीए 2 + बाढ़ सक्षम है, और अधिक से अधिक हद से 26 synaptic पुटिका एक्सोसाइटोसिस आरंभ हो जाएगा. उच्च सांद्रता (70-90 मिमी) भी जैसे Klingauf एट अल. 27 एक अन्य रिपोर्ट में इस्तेमाल किया गयाडी रिचर्ड्स एट अल. 28
    2. संस्कृति के माध्यम से सादे Tyrode समाधान के साथ प्रीफिल्ड इमेजिंग चैम्बर के लिए सभ्य न्यूरॉन्स के साथ एक coverslip स्थानांतरण.
    3. लगातार छिड़काव पर धुंधला समाधान 2 आवेदन या एक पिपेट 26,28 का उपयोग करके 1-2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर न्यूरॉन्स दाग. उत्तरार्द्ध मामले में, अंतिम डाई एकाग्रता डाई मुक्त समाधान का एक ज्ञात मात्रा को धुंधला समाधान 2 के एक ज्ञात मात्रा जोड़ने के द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए.
    4. खंड 2.1.7 में वर्णित है, इमेजिंग चैम्बर के बाहर धुंधला समाधान धो लें.
  3. सहज और लघु synaptic गतिविधि के कारण धुंधला हो जाना.
    1. अधिक से अधिक 60 मिनट के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर में रखने से 37 डिग्री सेल्सियस तक Prewarm बाइकार्बोनेट आधारित समाधान (जैसे न्यूनतम आवश्यक मध्यम, सदस्य).
    2. सहज synaptic गतिविधि पर आधारित धुंधला के लिए, सदस्य के लिए एफएम डाई जोड़कर धुंधला समाधान 3 तैयार करते हैं. धुंधला के लिए मीटर के आधार परsynaptic गतिविधि iniature, धुंधला समाधान 3 TTX जोड़कर धुंधला समाधान 4 तैयार करते हैं.
    3. समाधान 3 या 4 धुंधला करने के लिए संस्कृति के माध्यम से सभ्य न्यूरॉन्स के साथ एक coverslip स्थानांतरित, और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ही धुंधला समाधान में उन्हें छोड़ने से दाग न्यूरॉन्स.
    4. समाधान 1 rinsing में संक्षिप्त coverslip कुल्ला.
    5. एक इमेजिंग चैम्बर में समाधान 1 rinsing को coverslip स्थानांतरण. मन में रखने के बाद. 1) कक्ष हवा के संपर्क में नहीं होना चाहिए, यदि आवश्यक हो, rinsing बिना इमेजिंग चैम्बर के लिए सीधे coverslip हस्तांतरण. 2) न्यूरॉन्स एक HEPES आधारित समाधान के साथ धुंधला समाधान 3 या 4 जगह से कमरे के तापमान पर दाग जा सकता है. 3) न्यूरॉन्स धुंधला समाधान 2 के साथ धुंधला समाधान 3 या 4 की जगह और कमरे के तापमान पर बचे हुए चरणों को बाहर ले जाने से, इस विधि का उपयोग उच्च + K समाधान के संदर्भ में पैदा synaptic गतिविधि के लिए कलंकित किया जा सकता है.
    6. इमेजिंग के बाहर धुंधला समाधान धो लेंखंड 2.1.7 में वर्णित चैम्बर के रूप में.

3. एफएम डाई बाहर धोने

  1. ऊपर वर्णित तरीकों (धारा 2.1.7) में से किसी ने neuronal धुंधला और प्रारंभिक धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए समाधान 1 rinsing के साथ इमेजिंग चैम्बर छिड़कना जारी है. यह प्लाज्मा झिल्ली और कोशिकी समाधान से एफएम डाई निकाल देंगे. हमारे इमेजिंग चैम्बर के मामले में स्नान छिड़काव दर 600-1,200 μl / मिनट है. वॉशिंग भी कारण synaptic गतिविधियों के लिए 17 एफएम डाई नुकसान को दबाने के लिए बाह्य सीए 2 + की अनुपस्थिति में किया जा सकता है. washes Advasep-7, प्लाज्मा झिल्ली 29-31 से एफएम रंगों की एक मेहतर के रूप में कार्य करता है कि एक संशोधित cyclodextrin का एक संक्षिप्त आवेदन से बढ़ाया जा सकता है. यह दोनों एफएम puncta 31 की तीव्रता को कम करने और hea कोई समझौता से बचने के लिए (monolayer संस्कृति के मामले में उदाहरण के लिए 5 सेकंड) किसी भी Advasep-7 जोखिम कम रखने के लिए महत्वपूर्ण हैकोशिकाओं के LTH. प्लाज्मा झिल्ली में FM1-43 से प्रतिदीप्ति भी synaptic vesicles 32 में प्रवेश नहीं करता है कि एक पेय sulforhodamine 101 (50-100 माइक्रोन) के एक आवेदन के द्वारा दबा दिया जा सकता है.

4. धोने के दौरान एक इष्टतम छवि क्षेत्र के लिए खोज

  1. Imaged किया जा क्षेत्र में कोशिकाओं को एक उच्च बढ़ाई और उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस (जैसे 40X) के साथ प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग, स्वस्थ हैं सत्यापित करें कि. इस खंड से, हम चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप (ग्रहण तिवारी, Nikon) का उपयोग जारी है. इस माइक्रोस्कोप भी खुर्दबीन ध्यान केंद्रित बहाव पर काबू पा जो निरंतर, वास्तविक समय फोकस सुधार, सक्षम बनाता है कि संपूर्ण ध्यान सिस्टम (PFS) के साथ सुसज्जित है. यह सुविधा एक ही ध्यान केंद्रित कर विमान के साथ destaining दौरान समय चूक इमेजिंग के लिए आवश्यक है.
  2. कि धुंधला प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी का उपयोग करके, प्रभावी था सत्यापित करें. ए.वी.एफएम puncta के OID समुच्चय व्यक्ति BOUTONS विचार करने के लिए मुश्किल हो जाएगा, क्योंकि वे अनुसंधान के लक्ष्य कर रहे हैं जब तक. एफएम puncta के आकार पर ध्यान दे: दाग BOUTONS की सबसे परिपत्र मोती के तार के रूप में दिखाई देते हैं, वे अस्वस्थ तंत्रिका टर्मिनलों का प्रतिनिधित्व करेगा. Photobleaching से बचने के क्रम में मजबूत प्रतिदीप्ति उत्तेजना को न्यूरॉन्स के जोखिम को कम.

5. Synaptic vesicles से एफएम डाई उतराई (Destaining)

  1. बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के द्वारा पैदा synaptic गतिविधि के कारण Destaining.
    1. धो TTX (1 समाधान rinsing के रूप में लेकिन TTX के बिना ही) एक rinsing समाधान 2 के साथ बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स perfusing से बाहर. क्षेत्र उत्तेजना से प्रेरित cytoplasmic सीए 2 + यात्रियों की + इमेजिंग, या वोल्ट का पैच दबाना रिकॉर्डिंग द्वारा फ्लोरोसेंट 2 सीए द्वारा जैसे एक ही वाशिंग मानकों (छिड़काव दर और अवधि), का उपयोग कर, अलग प्रयोगों में TTX वार्शआउट की प्रभावशीलता की पुष्टिउम्र पर निर्भर ना + धाराओं.
    2. एफएम रंगों इमेजिंग शुरू. FM1-43 या FM4-64 इमेजिंग के लिए, 520 एनएम या 650 एनएम लंबे पास उत्सर्जन फिल्टर, क्रमशः और एक 490 एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करें. एक कम जोखिम के समय (जैसे 10-20 मिसे), कमजोर उत्तेजना तीव्रता (जैसे एलईडी बिजली की 5-10%), और उच्च संवेदनशीलता (जैसे EM लाभ के साथ) का उपयोग कर, छवियों हर 1-2 सेकंड मोल. जोखिम समय और प्रतिदीप्ति उत्तेजना की तीव्रता को कम करने से एफएम रंगों की photobleaching कम से कम. बिल्कुल सही फोकस प्रणाली को बदल कर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित बहाव को कम.
    3. (120 सेकंड के लिए 10 हर्ट्ज पर जैसे) क्षेत्र उत्तेजना का उपयोग, 20 2 समाधान rinsing में न्यूरॉन्स उत्तेजित.
    4. एफएम डाई के सभी पुनर्चक्रण synaptic vesicles ख़ाली, 1-2 मिनट के बीच के बाकी समय के साथ, उत्तेजना के कई दौर लागू करें. वें में एफएम रंगों के साथ दाग रहे थे कि synaptic vesicles के कुल पुनर्चक्रण पूल के आकार का आकलन करते समय यह महत्वपूर्ण हैए में पहले राज्य 20,33.
  2. कारण synaptic गतिविधियों को Destaining कार्रवाई क्षमता के अभाव में पैदा की.
    1. एफएम डाई इमेजिंग शुरू.
    2. समाधान 1 या 2 rinsing में भंग उत्तेजक अभिकर्मकों लागू करें. इस तरह अभिकर्मकों में शामिल हैं: सीए 2 + कोशिकी समाधान से सेल में बाढ़, इस्तेमाल किया जैसे पर अनुमति देकर intracellular सीए 2 + एकाग्रता उठाती है कि (एक सीए 2 + ionophore ionomycin KCl (उच्च कश्मीर + समाधान, जैसे 45 मिमी) 26, 5 माइक्रोन) 20,34, और सुक्रोज (तत्काल प्रकाशित करने योग्य पूल, 500 मिमी पर इस्तेमाल किया जैसे) 35,36 से synaptic vesicles की रिहाई को उत्तेजित करता है कि एक अतिपरासारी समाधान. वार्नर उपकरण 37, या वाई ट्यूब सिस्टम 38-40 से से एस एफ-77B प्रणाली जैसे, अभिकर्मकों को लागू करने में एक विश्वसनीय अस्थायी नियंत्रण के लिए एक तेज, स्थानीय छिड़काव प्रणाली का प्रयोग करें.
  3. कारण Destaining सहज और मिनटsynaptic गतिविधि iature.
    1. कारण सहज synaptic गतिविधि को destaining के लिए, समाधान 2 rinsing का उपयोग कर, (धारा 5.1.1) के रूप में ऊपर TTX बाहर धोने. समाधान 2 rinsing साथ न्यूरॉन्स perfusing जबकि एफएम रंगों इमेजिंग शुरू. समाधान 1 (TTX) के साथ rinsing के साथ न्यूरॉन्स छिड़कना जारी रखने के कारण लघु synaptic गतिविधियों को destaining के लिए, एफएम रंगों इमेजिंग शुरू.
    2. सहज या लघु या तो गतिविधि पर आधारित destaining के बाद पैदा synaptic गतिविधि के माध्यम से destaining द्वारा कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों की पहचान. गतिविधि ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं में से किसी के द्वारा पैदा की जा सकती है. दाग संरचनाओं कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों (जैसे धीरे धीरे endosomes या astrocytic पुटिका रीसाइक्लिंग) और इस प्रक्रिया में पैदा गतिविधि एड्स से destaining की एक बड़ी राशि के अलावा और उन हो सकता है क्योंकि यह पहचान की प्रक्रिया आवश्यक है.

6. एफएम रंगों की photobleaching दर का आकलन

  1. एल्डिहाइड-फिक्स एफएम डाई (जैसे FM1-43FX, FM4-64FX) के साथ तंत्रिका टर्मिनलों दाग. यह ऊपर वर्णित पैदा की, सहज, या लघु धुंधला विधि का उपयोग किया जाता है, और एक fixable एफएम डाई के साथ एफएम डाई की जगह से कर सकते हैं.
  2. खंड 2.1.7 में वर्णित के रूप में फिक्स एफएम डाई बाहर धो लें.
  3. रासायनिक लगानेवाला समाधान के लिए coverslip स्थानांतरित द्वारा न्यूरॉन्स को ठीक: 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए Tyrode के समाधान में 4% paraformaldehyde और 4% sucrose फिक्स एफएम डाई प्रतिदीप्ति तीव्रता रासायनिक निर्धारण के बाद बनाए रखा जाएगा.
  4. दो बार ताजा Tyrode के समाधान के लिए coverslip स्थानांतरित करके, Tyrode के समाधान में 10 मिनट के लिए लगानेवाला बाहर धो लें.
  5. इमेजिंग कक्ष में ताजा Tyrode के समाधान में coverslip स्थानांतरण.
  6. लाइव न्यूरॉन्स के लिए के रूप में इमेजिंग मापदंडों के एक ही सेट का उपयोग कर fixable एफएम डाई इमेजिंग शुरू. यह किसी भी रासायनिक तय नमूना उपयोग करने के बाद बहुत अच्छी तरह से इमेजिंग कक्ष कुल्ला करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकिकिसी भी शेष लगानेवाला एक ही कक्ष में किए गए बाद में जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों को प्रभावित कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से तय सेल इमेजिंग के लिए, दाग जीवित कोशिकाओं photobleaching दर का आकलन करने के लिए imaged किया जा सकता है. हालांकि, यह तीव्रता से लघु synaptic गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए मुश्किल है कि मन में रखने लायक है, उदाहरण के लिए, लघु गतिविधि की आवृत्ति बाह्य सीए 2 + 23 को निकाल कर 50% ~ को कम किया जा सकता है, लेकिन यह पूरी तरह से नहीं है नाकाबंदी.
  7. प्रत्येक इमेजिंग सत्र के अंत में, एफएम प्रतिदीप्ति तीव्रता के निरपेक्ष मूल्य का आकलन करने के लिए एक पृष्ठभूमि छवि के अधिग्रहण. एफएम puncta की तीव्रता तंत्रिका टर्मिनलों में एफएम रंगों से सच संकेत, लेकिन यह भी neuronal monolayer संस्कृति, 2) coverslip और ऑप्टिकल घटकों (जैसे उद्देश्य लेंस, फिल्टर और आबाद कि 1) glial कोशिकाओं से पृष्ठभूमि शोर न केवल प्रतिनिधित्व करता है दर्पण), और 3) डिटेक्टर (EMCCD कैमरा). पृष्ठभूमि शोर asse हैimaged क्षेत्र के nonstained क्षेत्रों में ssed. ऐसे क्षेत्रों तीव्रता में अंतरिक्ष या विषम में सीमित कर रहे हैं जब यह एक आदर्श तरीका नहीं है, हालांकि, कैमरा शटर बंद के साथ एक छवि के साथ यह विकल्प और डिटेक्टर से शोर हासिल. एक ही इमेजिंग मापदंडों का उपयोग लगभग 10 छवियों मोल.

7. छवि विश्लेषण

  1. समय श्रृंखला छवियों का एक ढेर के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्राप्त डेटा आयात करें. हम ImageJ (WS Rasband, एनआईएच) और संबद्ध प्लग इन का उपयोग, जैसे छवि स्थिरता प्लग में (कांग ली) एफएम puncta के बीच आंदोलन के एक छोटे से डिग्री को सही करने, और समय श्रृंखला विश्लेषक v2.0 (बालाजी जयप्रकाश) का विश्लेषण करने के लिए के लिए समय श्रृंखला.
  2. श्रृंखला (ΔFM) की शुरुआत और अंत में एफएम तीव्रता में परिवर्तन की गणना. यह अंत करने, destaining के शुरू होने से पहले और destaining (5 जैसे छवि तख्ते प्रत्येक) के अंत के बाद छवियों औसत और subtractin द्वारा एक अंतर छवि उत्पन्नजी उन्हें.
  3. फर्क छवि के लिए एक तीव्रता दहलीज लगाने से संभावित कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों को पहचानें, और जिसका तीव्रता सीमा से अधिक है पिक्सल का पता लगाने. सीमा स्थापित करने की एक विधि नंगे coverslip क्षेत्र से प्राप्त पृष्ठभूमि तीव्रता का मानक विचलन का चुनाव है.
  4. और पता लगाया कि एक आकार कसौटी (समीपता में पिक्सल के न्यूनतम और अधिकतम संख्या) को संतुष्ट थे कि सन्निहित पिक्सल के रूप में अलग, कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों को पहचानें. इस प्रक्रिया पृष्ठभूमि शोर और विश्लेषण से एकत्रित तंत्रिका टर्मिनलों समाप्त.
  5. (व्यक्ति समूहों व्यक्तिगत तंत्रिका टर्मिनलों के लिए इसी के साथ) का पता चला पिक्सेल समूहों पर क्षेत्रों के हित (ROIs) निरुपित. (ΔFM) destaining दौरान तीव्रता में पूरी तरह से परिवर्तन विश्लेषण का एक विशिष्ट पैरामीटर है. यह, पैदा की सहज या लघु synaptic गतिविधि का संचयी राशि का प्रतिनिधित्व करता है. वे निम्न में से किसी भी प्रदर्शन अगर ROIs बाहर निकालेंप्रयोगों के उद्देश्यों के आधार पर तीव्रता में परिवर्तन: रिकॉर्डिंग के दौरान वृद्धि हुई है, उत्तेजना से पहले अचानक कमी, या उत्तेजना के बाद एक लंबे विलंबता.
  6. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण कर लिया समय श्रृंखला डेटा आयात द्वारा photobleaching की दर का आकलन करें. (एक बंद शटर के साथ उदा) पृष्ठभूमि छवियों औसत, और व्यक्तिगत छवियों से घटाना. कथित रूप से तंत्रिका टर्मिनलों के अनुरूप है कि एफएम puncta को ROIs असाइन करें, और समय के साथ आरओआई तीव्रता में परिवर्तन को मापने.

समाधान

  1. Tyrode समाधान
    • (मिमी) संरचना: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 2 2 MgCl, 30 ग्लूकोज, 25 HEPES, 310 mOsm, 7.4 पीएच.
  2. धुंधला समाधान 1
    • Tyrode समाधान प्लस एफएम डाई.
    • यह समाधान बिजली की उत्तेजना के द्वारा पैदा की synaptic गतिविधि पर आधारित, धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है.
    • AMPA रिसेप्टर्स और NMDA के विरोधी जोड़ें receptoरुपये यदि आवश्यक है.
  3. धुंधला समाधान 2
    • उच्च कश्मीर + Tyrode समाधान प्लस एफएम डाई.
    • इस संशोधित Tyrode समाधान NaCl के लिए KCl की equimolar प्रतिस्थापन द्वारा, 45 मिमी के लिए KCl एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा तैयार किया जाता है.
    • यह समाधान सतत विध्रुवण द्वारा पैदा synaptic गतिविधि पर आधारित, धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है.
    • यदि आवश्यक हो तो AMPA रिसेप्टर्स और NMDA रिसेप्टर्स के विरोधी जोड़ें.
  4. धुंधला समाधान 3
    • सदस्य समाधान प्लस एफएम डाई.
    • यह समाधान सहज synaptic गतिविधि पर आधारित, धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है.
  5. धुंधला समाधान 4
    • सदस्य समाधान प्लस एफएम डाई और TTX.
    • यह समाधान लघु synaptic गतिविधि पर आधारित, धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है.
  6. समाधान 1 Rinsing
    • Tyrode समाधान प्लस AMPA रिसेप्टर्स और NMDA रिसेप्टर्स के विरोधी, और TTX.
  7. समाधान 2 Rinsing
    • Tyrode समाधान प्लस AMPA रिसेप्टर्स और NMDA रिसेप्टर्स की विरोधी है, लेकिन TTX बिना.

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Representative Results

एक उदाहरण के रूप में, हम synaptic vesicles के destaining समय कोर्स (चित्रा 4) के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स सहज synaptic गतिविधि (2.3 कदम) का उपयोग FM4-64 के साथ दाग और डाई मुक्त समाधान (2 समाधान rinsing) के साथ धोया गया. इमेजिंग सहज गतिविधि (5.3 कदम) (सतत लाइन का प्रारंभिक हिस्सा, चित्रा -4 ए) का उपयोग प्रारंभिक destaining समय पाठ्यक्रम से पता चलता है. यह 120 सेकंड के लिए 10 हर्ट्ज क्षेत्र उत्तेजना प्रत्येक (5.1 कदम) के साथ पैदा गतिविधि के तीन दौर का उपयोग destaining समय पाठ्यक्रम द्वारा पीछा किया जाता है. पैदा destaining की मात्रा को मापने का एक तरीका यह vesicles की कुल पुनर्चक्रण पूल के आकार से मेल खाती है कि एक डबल समाप्त तीर (ΔFM पैदा) के साथ सचित्र है.

पहला प्रोत्साहन दिए जाने तक, चित्रा (4 बी में बढ़े) एफएम तीव्रता में एक क्रमिक कमी थी. यह कमी destaining से बना थाकारण सहज synaptic गतिविधि के लिए (ΔFM Spont) और photobleaching (ΔFM पंजाब). Photobleaching के योगदान छोटा है, preimaging आधारभूत (ΔFM Spont + ΔFM पंजाब) से परिवर्तन सहज गतिविधि का destaining राशि को एक सन्निकटन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एफएम रंगों की संरचनाएं. ए एफएम के शेयरों में कुछ सामान्य ढांचागत सुविधाओं रंजक. हाइड्रोफिलिक समूहों जलीय घोल में रहने और हाइड्रोफोबिक पूंछ एफएम रंजक झिल्ली में विभाजित करने की अनुमति दे. FM2-10, FM1-43 और FM1-84 शो हरी उत्सर्जन, FM5 -95 और FM4-64 शो लाल स्थानांतरित उत्सर्जन करता है. FM1-43, सबसे अधिक इस्तेमाल किया एफएम डाई के बी stereoview. हाइड्रोफिलिक समूह सामना करना पड़ रहा है और हाइड्रोफोबिक पूंछ नीचे का सामना कर रहे हैं. Nitrogen परमाणुओं नीले रंग के होते हैं. FM1-43 का एक और दृश्य के लिए, Schote और Seelig 63 देखें.

चित्रा 2
चित्रा 2. जलीय घोल में कि (ग्रे) बहुत कम फ्लोरोसेंट है जबकि एफएम डाई उपयोग की मूल योजना. न्यूरॉन्स के लिए आवेदन करने के बाद, प्लाज्मा झिल्ली में डाला एफएम डाई, फ्लोरोसेंट (हरा) हो जाता है. यह आम तौर पर एक्सोसाइटोसिस निम्नलिखित, endocytosis से गुज़रता है जब एक synaptic पुटिका (एसवी), एफएम डाई से (दाग) भरी हुई है. कोशिकी समाधान में एफएम डाई बाहर धोने केवल दाग पुटिका फ्लोरोसेंट होने के लिए सक्षम बनाता है. यह एक्सोसाइटोसिस आए और इसलिए एफएम डाई विज्ञप्ति जब बाद में, एक synaptic पुटिका (destained) उतार दिया है. एक छवि से नीचे FM1-43 के साथ संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स की एक कापी धुंधला (प्रतिदीप्ति और चरण विपरीत छवियों का एक ओवरले दिखाता है). यह इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल में, फ्लोरोसेंट puncta presynaptic तंत्रिका टर्मिनलों दाग synaptic vesicles के समूहों के साथ (ठेठ केंद्रीय न्यूरॉन्स में व्यास ~ 1 माइक्रोन), न कि व्यक्तिगत synaptic vesicles (व्यास ~ 40 एनएम) का प्रतिनिधित्व करते हैं, उस पर ध्यान दें की है. सादगी के लिए, इस योजना के synaptic vesicles के Exo-endocytosis की एक सामान्य विचार का प्रतिनिधित्व करता है. यह ऐसी क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis, क्षणिक चुंबन एंड रन Exo-endocytosis, और थोक endocytosis 64 द्वारा पीछा पूर्ण पतन संलयन के रूप में Exo-endocytosis के कई रूपों, शामिल कर सकते हैं. का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.

चित्रा 3
चित्रा 3. एफएम इमेजिंग द्वारा अध्ययन synaptic गतिविधियों के तीन प्रकार. पैदा synaptic गतिविधि आमतौर पर बाहरी, बिजली उत्तेजनाओं की आवश्यकता है. उठना, synaptic गतिविधि बिजली उत्तेजनाओं के अभाव में होता है. लघु synaptic गतिविधि बिजली उत्तेजनाओं के बिना और कार्रवाई क्षमता के बिना सहज होता: आमतौर पर संभावित कार्रवाई पीढ़ी वोल्टेज पर निर्भर ना + चैनल, tetrodotoxin की एक अवरोधक से दबा दिया जाता है. एक्सोसाइटोसिस (cytoplasmic सीए 2 + एकाग्रता में निरंतर वृद्धि) ionomycin, उच्च + K समाधान (निरंतर विध्रुवण) द्वारा प्रेरित, और सुक्रोज (तत्काल प्रकाशित करने योग्य पूल में vesicles के एक्सोसाइटोसिस eliciting) युक्त अतिपरासारी समाधान है, जब अतिरिक्त गतिविधियों पैदा गतिविधि में शामिल एक्सोसाइटोसिस गुजरना करने synaptic vesicles के लिए संभावित कार्रवाई फायरिंग की आवश्यकता नहीं होगी, जो सभी के. कुछ अध्ययनों में, सहज गतिविधि मोटे तौर पर के रूप में अच्छी तरह से लघु गतिविधि धरना परिभाषित किया गया है, उस पर ध्यान दें.

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चित्रा 4. Destaining के प्रतिनिधि परिणाम. ए संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स 37 डिग्री सेल्सियस (2.3 कदम) पर 10 मिनट के लिए 2.5 माइक्रोन FM4-64 के साथ सहज गतिविधि से दाग रहे थे, और (प्रोटोकॉल 3) धोया. न्यूरॉन्स सहज गतिविधि (5.3 कदम) के साथ destaining दौरान imaged थे, और पैदा की गतिविधियों (5.1 कदम) (सतत वक्र, एन के औसत = 25 तंत्रिका टर्मिनलों) के तीन दौर. ऊर्ध्वाधर सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं. शाफ़्ट पूर्ण एफएम तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है और एक कैमरा शटर बंद कर दिया है जब "0" तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है. पैदा destaining की कुल राशि (ΔFM पैदा) संकेत दिया है. बी एक पैनल ए (सतत वक्र, स्पष्टता के लिए छोड़े गए SEM सलाखों) में destaining के प्रारंभिक चरण के दृश्य का विस्तार किया. एक 60 सेकंड अवलोकन के दौरान हिरासत में सहज अधिनियम की वजह से थाivity (ΔFM Spont) लेकिन कारण (ΔFM पंजाब) photobleaching के लिए आंशिक रूप से किया गया था. FM4-64 (मोटी बिंदीदार वक्र) की photobleaching समय पाठ्यक्रम फिक्स FM4-64 (प्रोटोकॉल 6) इमेजिंग द्वारा एक अलग प्रयोग में निर्धारित किया गया था. दर (9 मिनट से अधिक वक्र ढाले द्वारा निर्धारित 5736 सेकंड का एक समय लगातार साथ एक एकल घातीय समारोह,) 2 मिनट 19 से अधिक 2-3% थी. photobleaching वक्र FM4-64 के मापा तीव्रता की है कि एक प्रारंभिक मूल्य समकक्ष के साथ एक घातीय समारोह के रूप में तैयार किया गया था. लंबी अवधि (9 मिनट) पर photobleaching के लिए Kakazu एट अल. 19 में अनुपूरक चित्रा S5 देखें, और चर उत्तेजना तीव्रता और जोखिम समय के साथ. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

हम सहज और लघु synaptic गतिविधि पैदा की, और destaining चरण के दौरान इमेजिंग के लिए के जवाब में synaptic vesicles धुंधला और destaining के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. मौजूदा प्रोटोकॉल के अलावा, हम लघु synaptic गतिविधि पर आधारित एफएम destaining देख के एक नए प्रोटोकॉल को शामिल किया है. इन प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम पहले से आंदोलन विकार dystonia का एक माउस मॉडल से सभ्य न्यूरॉन्स में असामान्यताएं की पहचान की. उच्च गतिविधि 20 से प्रेरित जब जंगली प्रकार चूहों में उनके समकक्षों की तुलना में, उन न्यूरॉन्स एक सीए 2 + निर्भर तरीके में synaptic पुटिका एक्सोसाइटोसिस त्वरित कराना पड़ा. Neurotransmitter रिहाई 19 के पैच दबाना electrophysiological रिकॉर्डिंग द्वारा की पुष्टि के रूप में उन न्यूरॉन्स भी, अधिक लगातार लघु synaptic गतिविधि देखी गई.

इस तरह के विश्लेषण में एफएम रंगों का उपयोग के लिए प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलू asse हैएस एस और photobleaching कम से कम. Photobleaching की वजह से बदलाव synaptic गतिविधि से चालू होने वाले उन लोगों की तुलना में छोटे होते हैं अगर एफएम प्रतिदीप्ति तीव्रता में सूक्ष्म परिवर्तन मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता. कम photobleaching भी cytotoxicity दबाने या खत्म करने की क्षमता है. Photobleaching प्रकाश उत्तेजना को fluorophores के जोखिम को कम से कम किया जा सकता है, और रहते इमेजिंग प्रयोगों में यह करने के लिए उपकरण के कम से कम दो घटक हैं. एक महत्वपूर्ण घटक एक EMCCD कैमरा जैसे, फोटॉनों की एक संवेदनशील डिटेक्टर है. यह संभव नकारात्मक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने को प्रभावित किए बिना जोखिम की अवधि और तीव्रता को कम करने के लिए बनाता है. एक संबद्ध घटक डिटेक्टर छवियों का अधिग्रहण केवल जब उत्तेजना प्रकाश को नमूना के जोखिम सीमा कि प्रकाश स्रोत प्रणाली है. यह आसानी से प्रकाश जोखिम के समय के कुशल नियंत्रण के लिए अनुमति देता है कि एक एलईडी प्रकाश 41 (पर / बंद टी द्वारा हासिल की हैakes 1 मिसे की तुलना में काफी कम). जोखिम कैमरा (Andor कैमरे में उदाहरण के लिए "आग" टर्मिनल) से डिजिटल उत्पादन से, केवल छवि को पकड़ने के दौरान शुरू हो सकता है. एलईडी का उपयोग करने के अतिरिक्त लाभ में शामिल हैं: पैच दबाना रिकॉर्डिंग के रूप में कांच pipettes की सटीक हैंडलिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा जो तटस्थ घनत्व फिल्टर, प्रकाश तीव्रता के दीर्घकालिक स्थिरता, और यांत्रिक कंपन की अनुपस्थिति का उपयोग किए बिना प्रकाश की तीव्रता को नियंत्रित करने की क्षमता .

सामान्य में, संरचनात्मक रूप से विभिन्न रंगों में एक ही इमेजिंग परिस्थितियों में अलग दरों पर photobleach. यह इस प्रकार एक विशेष प्रयोग में इस्तेमाल की fluorophore photobleaching की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए आदर्श होगा. लाइव तंत्रिका टर्मिनलों में एफएम रंगों के लिए, यह कारण सहज या लघु synaptic गतिविधि के लिए, synaptic गतिविधि की photobleaching दर स्वतंत्र आकलन करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. ऐसे activit दौरान प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमीY एफएम रंजक (एक्सोसाइटोसिस), एफएम रंगों की photobleaching, या दोनों में से जैविक हानि के कारण हो सकता है. सौभाग्य से, फिक्स एफएम रंगों की संरचनाओं nonfixable एफएम रंगों के उन लोगों के लिए लगभग समान होने के लिए तैयार कर रहे हैं. Synaptic गतिविधि का नमूना रासायनिक निर्धारण द्वारा बाद में ब्लॉक किया गया था, जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, फिक्स एफएम रंजक, nonfixable एफएम रंगों के रूप में एक ही तरीके से synaptic vesicles में भरी हुई थी. इमेजिंग शर्तों जीना सेल इमेजिंग 19 के लिए उन के रूप में ही थे जब विशेष रूप से, इस प्रणाली का उपयोग करके मापा photobleaching की दर के रूप में कम 2-3% 2 मिनट से अधिक था.

एफएम रंगों synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के विविध पहलुओं का पता लगाने के लिए अलग अलग प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा सकता है. धुंधला और destaining दौरान विभिन्न synaptic गतिविधियों प्रयोगात्मक लक्ष्य और मूल्यांकन की synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के विशिष्ट सुविधाओं पर निर्भर करता है, विभिन्न तरीकों से जोड़ा जा सकता है. antagon का चयनists भी प्रयोगों के उद्देश्य पर निर्भर करता है. इसके अलावा, एफएम इमेजिंग धुंधला चरण के दौरान और साथ ही destaining चरण 9,18,42 के दौरान किया जा सकता है. यह भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, हालांकि, कि एफएम रंजक ऐसे मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स 43 अवरुद्ध, और 44, दुकान संचालित सीए 2 + चैनल 45 mechanotransducer चैनलों permeating, और एटीपी 46 रिसेप्टर्स के रूप में अप्रत्याशित प्रभाव हो सकता है. एफएम रंगों की उच्च सांद्रता संभवतः synaptic पुटिका एक्सोसाइटोसिस ही 47 की दक्षता को संशोधित कर सकते हैं. इस प्रकार हम प्रयोगों के डिजाइन और synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के बारे में परिणामों की व्याख्या में सावधानी की सलाह देते हैं. विचार करने के लिए पूरक के तरीकों जिसका epitopes पुटिका प्रोटीन 22,48 के भीतर lumenal डोमेन हैं एंटीबॉडी की synaptic vesicles में तेज शामिल होंगे. उन्होंने यह भी पीएच के प्रति संवेदनशील पुटिका लुमेन 49-51 के लिए लक्षित GFP वेरिएंट, और तेज व्यक्त शामिलExo-endocytosis साथ अंतर vesicular पीएच परिवर्तन का पता लगाने, जो दोनों के पीएच के प्रति संवेदनशील एंटीबॉडी conjugates 52-54 की.

इस तरह के अवांछित प्रभाव बाहर रखा गया है एक बार, एफएम रंजक व्यापक आवेदन किया है. उदाहरण के लिए, वे एक ही synaptic पुटिका पूल सहज के लिए साझा कर रहे हैं कि क्या पता किया और पुटिका विज्ञप्ति 17,55 पैदा की, किस हद तक synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग की दक्षता 56,57 विनियमित किया जा सकता है, और हो सकता है क्या प्रभाव करता है एक पूर्व राज्य (बाकी या प्रेरित) जैसे सहज और लघु synaptic गतिविधि पर आधारित पुटिका रीसाइक्लिंग के बाद राज्य पर डालती है. एफएम रंजक भी एफएम photoconversion विधि 30,58-62 द्वारा प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से टिप्पणियों correlating द्वारा, ultrastructural स्तर पर synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एफएम डाई एक साथ synaptic कार्यों और intracellular सीए 2 + चुनाव की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैcentration 5. Synaptic vesicles, एफएम रंगों और ऐसे फ्लोरोसेंट dextran 7 के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट द्रव चरण मार्कर की लेबलिंग के अलावा तीव्र neuronal गतिविधि से शुरू हो रहा है कि थोक endocytosis निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, एफएम रंगों के अनुप्रयोगों synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग और अतिरिक्त synaptic कार्यों के बारे में जानकारी का एक अमूल्य स्रोत प्रदान करते हैं.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखक इस कार्य के निष्पादन के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए Harata प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, Dystonia मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, एडवर्ड Mallinckrodt, जूनियर फाउंडेशन, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, और एनसीएच को व्हाइटहॉल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

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References

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पैदा की, सहज, और लघु Synaptic गतिविधियों के दौरान एफएम रंगों का उपयोग synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के परीक्षा
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Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

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