Summary
我们描述了使用的苯乙烯调频染料图像突触囊泡循环的功能神经末梢。这个协议可以不仅诱发，也自发和微型突触活动的应用。该协议扩展了多种可有效评估的突触事件。
Abstract
在功能神经末梢突触囊泡的胞吐接受和内吞作用。这种突触囊泡循环可以使用苯乙烯调频染料，它揭示了膜有效的营业额分析。对于使用调频染料的传统协议的设计分析神经元以下的刺激（诱发）突触活动。最近，协议，成为可用于分析伴随弱突触活动，如自发或微型突触活动的调频信号。在FM信号的这些小的变化分析，需要对成像系统是足够敏感以检测强度的微小变化，但振幅较大的那个伪迹变化被抑制。在这里，我们描述了可应用于诱发的，自发的和微型的突触活动，并使用培养的海马神经元作为一个例子的协议。这个协议还包含评估调频染料的光漂白速率的一种手段，因为这是一个显著源成像强度的微小变化，当文物。
Introduction
突触小泡的功能是突触传递的重要决定因素。这些囊泡释放神经递质，当他们与突触前质膜（胞吐作用）熔化，并且它们成为准备发布的另一周期从质膜（内吞作用）进行再生和重新装载神经递质之后。研究的动态及相关突触囊泡循环机制已被引入苯乙烯调频染料1大大加快。这些两亲性分子，其具有带正电荷的亲水性头部基团和疏水性尾（多种染料在图1A中，FM1-43的图1B中stereoview），能可逆地进入和退出脂膜不渗透其中。调频染料组共享影响的光，它们发出的一系列类似的功能。例如，FM2-10，FM1-43，和FM1-84有两个环状化合物和升之间的一个双键瓦特绿色发光。它们之间的区别是疏水尾，这决定了其疏水性，因此，出口处的从膜的速率（departitioning）的长度。在FM5-95和FM4-64的情况下，三个双键连接的环状化合物，它们显示红色发射。这些染料差异相对于它们的亲水部分。在所有的FM染料，当它们被插入到生物膜，由于增加量子产率在相对于所述亲水性环境的疏水性环境中的荧光强度增加。因此，改变FM强度代表了改变膜的营业额。不同的颜色（发射光谱）和疏水性使调频染料一种多用途的研究工具，在突触囊泡循环。
基于这些特性，调频染料大多根据在分析突触小泡循环利用下面的方案（ 图2）中使用。神经元S是沐浴在包含FM染料的细胞外液，使其能够被带进突触小泡（SVS），因为它们通过内吞作用（染色）形成。的染料，然后洗出通过应用染料-自由胞外溶液，这表明功能神经末梢， 即只有那些积极进行内吞作用将包含突触小泡被装入染料（ 图2底部）的群集。随后的胞吐作用导致的调频染料的损失到细胞外空间以及随之而来的损失荧光（脱色;由于两者departitioning到亲水环境和扩散远离胞吐作用的位点）。因此，改变FM的荧光强度是突触囊泡外切和内吞作用的指标。
调频染料已被用于染色和脱色的各种生物和制剂2,3突触囊泡。例子包括哺乳动物neurONAL培养4-9，哺乳动物的脑片10,11，神经肌肉接头12,13，视网膜双极神经细胞14,15和16耳蜗毛细胞。
通常，在这样的实验中，无论染色和脱色是通过广泛刺激神经元（诱发活性）触发。然而，最近，突触小泡循环响应于弱刺激也被分析，因为在没有外部刺激（自发和微型突触活动）9,17-19具有回收利用。自发和微型突触活动被定义为那些发生在没有外界刺激的，前者涉及动作电位（ 图3）的自发发射。这些微弱的突触活动与调频信号比由粗放刺激引发的较小的变化相关联。测量要求的变化，调频fluorescENCE强度准确反映突触囊泡的胞吐或胞吞作用，但强度不是伪迹的变化。伪像的原因之一是通过调频染料质膜的非特异性染色的存在。此组件的逐步洗脱将导致一个逐渐变化的测得的荧光强度，这将被错误地归因于突触活动。这个因子可以通过适当的方法来减少（见协议）。神器的最显着的原因是调频染料突触小泡内保留的漂白。在调频强度的光漂白相关的变更必须在比较所测得的生物（突触）的变化很小。敏感的摄像机的最新发展， 例如在电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机，使得它可以最小化，通过缩短曝光时间，削弱用于激发荧光团的光的强度的光漂白。神器的另一个原因是我的漂移n个光显微镜的聚焦水平。成像会话期间的焦点漂移可以通过机械或热效应引起，并且将错误导致所测量的荧光强度的变化。
这里我们描述的协议和设备，使得有可能使用调频染料来分析突触小泡循环，即使在弱的或无刺激的情况下，特别是在微型突触活动。我们发现囊泡的染色和脱色的例子中诱发和自发突触活动，利用培养的啮齿动物的海马神经元，并且成像脱色阶段。我们还说明了如何评估的调频染料光漂白的程度，在没有任何调频染料损失是由于突触活动。
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Protocol
1。神经元从哺乳动物脑原代培养
在这项研究中进行的所有动物的程序是由爱荷华大学的机构动物护理和使用委员会批准。
- 海马准备从小鼠海马CA3-CA1区或大鼠分离的细胞培养在出生后0-1天19,20。镀上12毫米的盖玻片（厚度数0）预置与大鼠神经胶质饲养层，在24孔培养皿中，并以12,000个细胞/孔的密度将海马细胞。
- 培养海马神经元至少8天为功能性神经末梢发展21。我们使用的神经元在11-14天在体外 ，当个人的神经末梢是相对孤立的没有太多的集群。神经元可用于实验最多体外例如威利格等人 22和Nosyreva和Kavalali 23大约21-28天。
- 为功能性研究，评估盖玻片（染色前）利用透射光显微镜（ 例如相衬光学元件在10-20X的放大倍率）健康的神经元的指标。身体健康的指标包括：一个统一的胶质细胞层，周围的神经元细胞清晰保证金，延长树突无串珠结构，缺乏集群胞体，以及缺乏捆绑突起的。
2。加载突触小泡与FM染料（染色）
- 染色由于受电场刺激诱发的突触活动（包括动作电位）
- 准备由FM染料添加到HEPES为基础的无染料染色解决方案解决方案1， 如台氏液（见解决方案的详细信息）。调频染料的浓度为10μMFM1-43和2.5μMFM4-64。典型浓度范围如下：2-15微米FM1-43，或2.5-20微米FM4-64 3,6。对于需要经常性的抑制实验谷氨酸能突触活动和突触可塑性的诱导，进一步添加离子型谷氨酸受体的拮抗剂：AMPA受体（ 例如，10μMCNQX）和NMDA受体（ 例如，50μMAP5）。
- 与细胞转移盖玻片从培养介质中预先填充与普通台氏液成像室。我们使用的成像腔室与连接到所述侧壁（铂丝分离6.3毫米，RC-21BRFS）的刺激电极。此腔室被设计成一个封闭的成像室中，但我们使用它作为一个开放的腔室（ 即没有顶部盖玻片），用〜200微升的浴体积。在转移过程中，切勿使培养的细胞在空气中，并避免与镊子（挑盖玻片从外围而不是靠近中心）捏培养细胞。
- 灌注成像室中，在室温（23-25℃）纯台氏液。
- 申请者共同染色液1nstant灌注。
- 通过施加电脉冲激发突触活动。对于海马神经元突触小泡的总回收池的最大染色，刺激文化在10 Hz为60-120秒24。当试图达到场刺激的最大效率，保持几个特点在心。 1）浴溶液的高度应尽可能地低，同时保持了神经元和神经刺激电极完全浸没在一层薄薄的台氏溶液（以保持神经元存活并得到均匀的电场）。 2）电流强度和持续时间，应使用神经元兴奋性的指标， 如荧光Ca 2 +的影像进行优化，在我们的例子中，30毫安强度和1毫秒持续时间的恒定电流给出可靠的结果。 3）槽液应以恒定流量的刺激过程中应用;电刺激导致电解，导致质子（H
- 离开神经元染色液1额外60秒后场刺激终止，从而使刺激后细胞内吞作用将完成25。
- 用冲洗液1，无染料台氏液加AMPA受体和NMDA受体（参见第2.1.1节）的拮抗剂，和电压依赖性钠通道的阻断剂灌注洗染色液出了成像室（ 例如 0.5-1微米河豚毒素，TTX）。受体阻滞剂的组合将通过自发突触活动抑制调频染料的损失。为了最大限度地提高洗涤效率，增加灌注率（<em>的如高达5-6毫升/分钟）1-2分钟，并加入直接漂洗溶液1手动打开的成像室中，用移液管的大丸剂（ 例如 1ml）中。手动控制输液的强度和方向，以免打扰培养的神经元。
- 染色由于高-K +解决方案诱发突触活动（不涉及动作电位）。
- 准备染色液2由FM染料加入到高-K +台氏液。具体来说，准备修改台氏液用45毫米氯化钾，氯化钾通过对氯化钠等摩尔取代。如果需要，添加AMPA和NMDA受体的拮抗剂。这种高-K +解决方案将不断神经元去极化，使钙离子流入神经 终端，并启动突触囊泡的胞吐到最大程度26。高浓度（70〜90毫米）的其他报告也使用了如 Klingauf 等人 27的ð理查兹等人 28
- 用培养的神经元传输盖玻片从培养介质中预先填充与普通台氏液成像室。
- 通过将染色溶液2以恒定的灌注，或用移液管26,28染色的神经元在室温下搅拌1-2分钟。在后一种情况下，最终的染料浓度应通过加入染色溶液2至无染料溶液的已知容积的已知容积来控制。
- 洗染色液出成像室，如在2.1.7节中描述。
- 染色由于自发和微型突触活动。
- Prewarm碳酸氢盐为基础的解决方案（ 例如最小必需培养基，MEM），以37℃放置在培养箱内培养超过60分钟。
- 基于自发突触活性染色，由FM染料加入到MEM制备染色溶液3。用于染色基于米iniature突触活动，加入TTX的染色液3准备染色液4。
- 染色的神经元通过将盖玻片用从培养液中培养的神经元染色溶液3或4，并且让它们在37℃的同一染色溶液10分钟。
- 在清洗液1简要冲洗盖玻片。
- 盖玻片转移到清洗液1在成像室。请记住以下几点。 1）细胞不应该暴露在空气中，如有必要，直接将盖玻片成像室不漂洗。 2）神经元可以通过更换染色液3或4用HEPES-基溶液在室温下被染色。 3）神经元可被染色以使用这种方法在高-K +溶液的上下文诱发突触活动，通过更换染色液3或4与染色溶液2，并进行在室温下将剩余的步骤。
- 洗染色液出成像室如第2.1.7所述。
3。洗出的FM染料
- 神经细胞的染色和初期洗涤通过任何上述方法（部分2.1.7）后，继续灌注成像室中，在室温漂洗溶液1 5-10分钟。这会从质膜和细胞外溶液中除去调频染料。在我们的成像腔室的情况下，浴灌注速率为600-1,200微升/分钟。洗，也可以在不存在细胞外的Ca 2 +的抑制调频染料损失是由于突触活动17进行。洗涤液可通过ADVASEP-7，改性环糊精，作为从质膜29-31调频染料清除剂的简要应用增强。关键是要保持任何ADVASEP-7曝光短（ 例如 5秒单层培养的情况下），以避免既降低调频泪点31的强度和损害HEA第l个细胞。从FM1-43在细胞膜上的荧光也可以通过猝灭磺酰罗丹明101（50-100微米），不进入突触小泡32的应用受到抑制。
4。寻找最佳的图像场在洗涤
- 验证该细胞中该字段将被成像是健康的，用透射光显微镜用高倍率和高数值孔径的物镜（ 例如 40X）。从本节开始，我们继续使用倒置显微镜（Eclipse中的Ti，尼康）配有相衬或微分干涉对比光学系统。这种显微镜还配备了完美的对焦系统（PFS），使连续，实时对焦校正，克服了显微镜焦点漂移。这个功能是必不可少的延时成像具有相同的聚焦平面脱色过程。
- 验证染色是有效的，通过使用荧光光学。 AV调频泪点的OID聚集体，除非它们是研究的目标，因为个别boutons将是难以辨别。要注意的FM泪点的形状：如果大部分染色boutons的显示为圆形串珠，他们可以代表不健康的神经末梢。尽量减少神经元的暴露在强烈的荧光激发，以避免光漂白。
5。从突触小泡卸载调频染料（脱色）
- 由于脱色由电场刺激诱发的突触活动。
- 洗TTX通过广泛灌注神经元用冲洗液2（同清洗液1，但没有TTX）。确认洗脱的TTX在单独的实验中的效力，使用相同的洗涤参数（灌注速率和持续时间）， 例如 ，通过荧光的Ca 2 +成像的诱导场的刺激细胞质的Ca 2 +瞬变，或由伏的膜片钳记录年龄依赖性Na +电流。
- 启动成像调频染料。用于成像的FM1-43或FM4-64中，使用520纳米或650纳米长通发射滤波器，分别和一个490nm的激发滤光器。采集图像每隔1-2秒，使用短的曝光时间（ 例如 10〜20毫秒），弱激发强度（ 如 LED电源的5-10％）和高灵敏度（ 例如，使用EM增益）。通过减少曝光时间和荧光激发的强度最小化在FM染料的光致漂白。通过打开完美的对焦系统减低显微镜焦点漂移。
- 刺激神经 元的冲洗液2，使用现场的刺激（ 如在10 Hz 120秒）20。
- 应用多轮的刺激，以1-2分钟间隔休息期，以消耗调频染料全部回收利用突触小泡。评估的染色带FM染料在日突触小泡的总回收池的大小时，这是很重要的e之前的状态20,33。
- 脱色是由于突触活动诱发在没有动作电位。
- 启动成像调频染料。
- 申请溶解在漂洗溶液1或2所述刺激的试剂。这样的试剂包括：氯化钾（高-K +溶液， 例如 45毫米）26，离子霉素（一个Ca 2 +的离子载体，通过允许的Ca 2 +流入细胞从细胞外溶液中，使用例如在引发细胞内Ca 2 +浓度5微米）20,34，和蔗糖（高渗溶液，刺激突触小泡从易释放池， 如使用500毫米）35,36释放。使用一个可靠的时间控制一个快速，局部灌注系统中应用的试剂， 例如从华纳仪器37，或Y型管系统38-40的SF-77B系统。
- 脱色由于自发和最小iature突触活动。
- 对于脱色由于自发突触活动，洗出河豚毒素上文（5.1.1节），用冲洗液2。启动成像调频染料灌注时神经元的冲洗液2。对脱色由于微型突触活动，开始成像调频染料，同时继续灌注神经元的漂洗溶液1（含TTX）。
- 脱色的基础上无论是自发或微型活动后，透过诱发突触活动脱色识别功能神经末梢。活性可以通过任何上述的方法来诱发。这个识别过程是必要的，因为被污染的结构可以是那些比官能神经末梢（ 如缓慢地循环核内体或星形细胞囊泡）和大量脱色的由在此过程中诱发的活性助剂等。
6。评估调频染料的光漂白率
- 染色与醛可以解决的调频染料（ 如 FM1-43FX，FM4-64FX）神经末梢。这样做可以用上述诱发的，自发的，或者微型染色方法，和通过用可固定的调频染料代替调频染料。
- 如第2.1.7所述洗出可修复的调频染料。
- 化学通过将盖玻片固定液固定的神经元：4％多聚甲醛和4％的蔗糖在台氏在4℃下30分钟，溶液可定影调频染料的荧光强度将化学固定后保留。
- 洗出固定液在台氏液10分钟，通过将盖玻片新鲜台氏液两次。
- 转移到盖玻片在成像室新鲜台氏液。
- 开始使用一组相同的成像参数，作为活的神经元成像的可定影调频染料。它使用任何化学固定标本后冲洗成像室非常好是很重要的，因为任何剩余的固定剂可能会影响在同一室内进行后续的活细胞成像实验。可替换地，以固定细胞成像，染色的活细胞可能被成像以评估光漂白速率。然而，值得记住，这是很难清楚地阻止了微型突触活动，例如，微型活动的频率可以降低到约50％通过除去细胞外Ca 2 +的23，但它不是一个完整的封锁。
- 在每个成像会话结束时，获取用于评估调频荧光强度的绝对值的背景图像。调频泪点的强度不仅代表从神经末梢的调频染料的真实信号，而且从1）神经胶质细胞所依据的神经细胞的单层培养物，2）将盖玻片和光学元件（ 例如，物镜，过滤器和背景噪声镜），和3）的检测器（EMCCD相机）。背景噪声ASSEssed在成像领域的nonstained地区。当这样的区域中的强度或空间异构的限制，与图像替换它与照相机快门关闭，并获取来自检测器的噪声，尽管它不是一种理想的方法。使用相同的成像参数获得约10张图像。
7。图像分析
- 导入所获取的数据转换为图像分析软件作为堆叠时间序列图像的。我们使用ImageJ的（WS Rasband，美国国立卫生研究院）和相关的插件， 例如图像稳定器插件（康丽），用于校正小程度的运动之中调频泪点，和时间序列分析仪V2.0（巴拉吉Jayaprakash）分析的时间序列。
- 计算的变化调频强度在串联（ΔFM）的开始和结束。为此，脱色开始前和脱色（ 例如 5图像中的每个帧）结束后的平均化图像，并通过subtractin生成的差分图像克他们。
- 识别潜在的功能性神经末梢通过施加强度阈值的差分图像，并且检测像素的强度都高于阈值。设定阈值的一种方法是选择从裸盖玻片面积得到的背景强度的标准偏差。
- 识别孤立的，功能性神经末梢作为进行检测，并满足一个标准大小（以邻接像素的最小和最大的数字）的相邻像素。这个过程消除背景噪声和分析汇总神经末梢。
- 指定感兴趣区域的所检测到的像素群（与对应于个别神经末梢个体群）（感兴趣区域）。脱色（ΔFM）过程中的强度变化总量是分析的典型参数。这代表诱发的，自发的或微型突触活动的累计金额。排除的ROI，如果它们表现出下列任何根据目的的实验强度的变化：增加了录音过程中，刺激前突然下降，或刺激后很长的等待时间。
- 通过导入所获得的时间序列数据，并将其图像分析软件评估光漂白速率。平均的背景图像（ 例如，具有封闭快门），并从各个图像中减去它。分配投资回报调频泪点的推定对应神经末梢，并测量变化的投资回报率的强度随着时间的推移。
解决方案
- 台氏液
- 组合物（以mM计）：125氯化钠，氯化钾2，2的CaCl 2，2的MgCl 2，30葡萄糖，25 HEPES，310毫渗透摩尔浓度，pH值7.4。
- 染色液1
- 台氏液加调频染料。
- 该溶液被用于染色，基于由电刺激诱发的突触活性。
- 添加AMPA受体和NMDA的拮抗剂recepto如有必要，RS。
- 染色液2
- 高-K +台氏液加调频 染料。
- 这个修改过的台氏液是通过增加KCl浓度至45毫米，由氯化钾对NaCl的摩尔取代制备。
- 该溶液被用于染色的基础上，通过连续的去极化诱发的突触活性。
- 如果需要的话添加AMPA受体和NMDA受体的拮抗剂。
- 染色液3
- MEM液加调频染料。
- 该溶液被用于染色，根据自发突触活动。
- 染色液4
- MEM液加调频染料和TTX。
- 该溶液被用于染色，根据微型突触活动。
- 清洗液1
- 台氏液加AMPA受体和NMDA受体的拮抗剂，和TTX。
- 清洗液2
- 台氏液加AMPA受体和NMDA受体的拮抗剂，但没有河豚毒素。
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Representative Results
作为一个例子，我们展示代表结果的突触小泡的脱色时间过程（ 图4）。培养海马神经元采用自发突触活动（步骤2.3）沾上FM4-64，用无染料溶液（冲洗液2）。成像显示了使用自发活动（步骤5.3）（连续线的起始部分， 图4A）初始脱色时间过程。这后面是脱色时间过程使用三轮诱发活性与10赫兹场刺激为120秒每个（步骤5.1）。测量诱发脱色量的一种方法是说明与对应于囊泡的总回收池的大小双端箭头（ΔFM 诱发 ）。
第一个刺激之先，有FM调频强度逐渐减少（放大图4B）。这一下降是由脱色的由于自发突触活动（ΔFMSPONT）和光漂白（ΔFMPB）。当光漂白的贡献很小，从preimaging基线（ΔFMSPONT +ΔFMPB）的变化可被用作一个近似自发活动的脱色量。
图1。调频染料的结构。A.调频染料股的一些共同的结构特征。亲水性基团留在水溶液中，所述疏水性尾部允许调频染料被划分成薄膜。 FM2-10，FM1-43和FM1-84显示绿色发光，而FM5-95和FM4-64显示红移发射。FM1-43，最常用的调频染料B. Stereoview。亲水基团朝上和疏水尾朝下。 NITROGEN原子为蓝色。对于FM1-43的另一个视图，请参阅Schote和西利格63。
图2。调频染料使用量的基本方案。应用到神经元之后，调频染料插入到质膜成为荧光（绿色），而其在水溶液中是少得多的荧光（灰色）。突触小泡（SV）被加载（染色）由FM染料，当它经历了内吞作用，通常下面的胞吐作用。洗出的FM染料在细胞外液只允许染色囊泡是荧光灯。随后，突触小泡被卸载（脱色），当它发生胞吐，因此释放了调频的染料。下面的图像显示了培养海马神经元与FM1-43的典范染色（荧光和相位对比图像的叠加）。值得注意的是，在本文中所描述的协议，荧光泪点代表突触前神经末梢（典型的中枢神经元的直径约1微米）与集群染色突触小泡，而不是个人的突触小泡（直径约40纳米）。为简单起见，该方案代表外，内吞作用的突触小泡的总体思路。它可以包括多种形式的外切内吞作用，如全崩溃融合其次是网格蛋白介导的内吞作用，瞬态吻了就跑外切内吞作用和胞吞散装64。 请点击这里查看一台放大版这个数字。
图3。三种类型的研究了调频成像突触活动。诱发突触活动通常需要外部电刺激。自发突触活动发生在没有电刺激的。自发发生无电刺激，无动作电位微型突触活动：通常动作电位的产生是由电压依赖性钠离子通道，河豚毒素阻断剂抑制。附加业务包括诱发活动时的胞吐作用是由高-K +溶液（连续的去极化）的刺激下，离子霉素（持续增加胞质Ca 2 +浓度），并将含有蔗糖（引出在易释放池囊泡的胞吐作用）高渗溶液，所有这些都将不需要的突触小泡的动作电位发放经过胞吐作用。需要注意的是，在一些研究中，自发性活动被宽泛地定义为包括微型活性。
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图4。脱色代表结果。A.培养海马神经元在37℃（步骤2.3）染色自发活动与2.5微米FM4-64为10分钟，洗净（协议3）。与自发活动（步骤5.3）脱色过程中神经细胞进行成像，并三轮诱发活动（步骤5.1）（连续的曲线，n的平均值= 25神经末梢）的。竖线表示SEM。 Y轴代表绝对调频强度和“0”表示强度时，照相机快门被关闭。诱发脱色总量指示（ΔFM 诱发 ）B.扩大的观点脱色的A组（连续的曲线，扫描电镜酒吧为清晰起见省略）初始阶段。在一个60秒的观察，拘留，主要是由于自发的行为ivity（ΔFMSPONT），但部分原因是由于漂白（ΔFMPB）。 FM4-64（粗虚线）的光漂白时间进程在单独的实验中，由成像可修复FM4-64（通讯协定第6）确定。发生率为2-3％，在2分钟（用5736秒的时间常数的一个指数函数，由曲线在9分钟拟合确定）19。光漂白曲线被绘制为具有等同于FM4-64的测定强度的初始值的指数函数。为漂白过较长时期（9分）见补充图S5在嘉数等 19，并与可变激励强度和曝光时间。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
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Discussion
我们已经描述了协议的染色和脱色突触小泡响应引起的，自发的和微型突触活动，并为在脱色相位成像。除了现有的协议，我们已观察的基础上微型突触活动的调频脱色的一个新的协议。使用这些协议，我们先前确定的运动障碍肌张力障碍的小鼠模型中培养的神经元异常。相较于他们的同行在野生型小鼠中，这些神经元后行加速在Ca 2 +的依赖性突触囊泡的胞吐的时候用高活性20刺激。这些神经元也表现出更频繁的缩影突触活动，证实了神经递质释放19的膜片钳电生理记录。
该协议采用调频染料在这种分析的关键方面是ASSEss和尽量减少漂白。在FM荧光强度的细微变化能够可靠地评估所造成的光漂白的变化是比较小的那些由突触活动触发。还原漂白还具有抑制或消除毒性的潜力。漂白可以通过最大限度地减少荧光团的暴露于激发光被减小，并有设备中的至少两种组分，为此在实时成像实验。其中一个重要的组成部分是光子的灵敏探测器， 例如，一个EMCCD相机。这使得有可能以最小化暴露的持续时间和强度没有负面影响荧光发射的检测。一个相关的部件是光源系统，限制试样暴露于激发光时，才检测器获取的图像。这很容易通过一个LED灯41，允许光线照射的时间的有效控制（开/关t实现碟刹比1毫秒少得多）。曝光只能在图像捕捉被触发，通过从相机（在安道尔相机如 “火”终端）的数字输出。使用LED的其它优点包括：可以控制发光强度，而无需使用中性密度滤光片，光强度的长期稳定性，并且没有机械振动而将与玻璃移液管的精确处理干扰作为在膜片钳记录的能力。
在一般情况下，在结构上不同的染料光漂白在同一成像条件下，不同的费率。因此，这将是理想的，以评估在特定实验中使用的荧光团的光漂白的程度。对于在活神经末梢调频染料，它在技术上是挑战性的，以评估光漂白速率独立突触活动的，由于自发或微型突触活动。这样activit过程中荧光强度降低Ý可能是由于调频染料（胞吐作用），FM染料光漂白，或两者的生物损失。幸运的是，可以解决FM染料的结构被设计成几乎相同的nonfixable调频染料。在这里所描述的协议中，可固定调频染料装入突触小泡通过同样的方法，nonfixable调频染料，而突触活性用试样的化学固定后挡。值得注意的是，光漂白的使用本系统测得的速度是低至2-3％，在2分钟时的摄像条件相同的那些用于活细胞成像19。
调频染料可以与不同的协议被用来探索突触小泡循环的不同方面。染色和脱色过程中不同的突触活动可以以各种方式进行组合，这取决于实验的目的和突触小泡循环的特定特征进行评估。拮抗剂的选择派分子也依赖于实验的目的。此外，调频成像可以在染色阶段以及在脱色相9,18,42进行。还应当牢记，但是，调频染料可以有意想不到的效果，如阻断毒蕈碱型乙酰胆碱受体43和渗透mechanotransducer通道44，存储操纵性Ca 2 +通道45，和ATP受体46。高浓度的调频染料可以潜在修改的突触小泡的胞吐作用本身47的效率。因此，我们建议在设计实验和解释有关的突触囊泡循环的结果慎用。互补的方法来考虑包括吸收到抗体的抗原决定簇是囊泡蛋白22,48的内部腔域的突触小泡。它们还包括表达对pH值敏感的GFP变种针对性地泡49-51流明，并吸收的pH值敏感的标记抗体52-54这两者检测伴随外-内吞作用的帧内囊泡pH值的变化。
一旦这种有害的影响被排除在外，调频染料都有广泛的应用。例如，它们可以被用来解决是否相同的突触小泡池自发共享和诱发囊泡释放17,55，到什么程度的突触小泡循环的效率，可调节56,57，以及什么样的影响做了以前的状态的基础上， 如自发性和微型突触活动的囊泡循环的后期状态（静止或刺激）产生。调频染料也可用于评估突触小泡循环在超微结构水平，由调频光转化方法30,58-62从光学和电子显微镜观察结果相关联。调频染料可以用于同时监测突触功能和细胞内Ca 2 +浓度中心定位5。除了 突触囊泡中，FM染料等荧光流体相的标记，如荧光葡聚糖7的标签可以被用来监视批量内吞作用是受强烈的神经元活动触发。总之，调频染料的应用程序提供有关突触囊泡循环和附加突触功能的信息的宝贵来源。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者感谢原田实验室的成员在整个这项工作的执行有益的讨论。这项工作是由美国心脏协会，肌张力障碍医学研究基金会，爱德华马林克罗特，小基金会，美国国家科学基金会和白厅基金，以资助NCH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Isolated stimulator |  Digitimer |
DS3 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
| Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
| Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
| Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
| Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
| LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
| Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
| Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
| CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
| D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
| Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
| Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
| Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |
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