Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

Abstract

שלפוחית ​​סינפטית בקצוות עצבים תפקודיים עוברת exocytosis ואנדוציטוזה. מחזור שלפוחית ​​הסינפטית זה יכול להיות יעיל ניתח באמצעות צבעי FM styryl, אשר חושפים את המחזור בממברנה. פרוטוקולים מקובלים לשימוש בצבעי FM נועדו לניתוח נוירונים הבאים פעילות הסינפטית מגורה (עורר). לאחרונה, פרוטוקולים הפכו זמינים לניתוח אותות FM המלווים את פעילות הסינפטית חלשה יותר, כגון אירועים הסינפטי ספונטניים או מיניאטורי. ניתוח של שינויים הקטנים אלה באותות FM דורש כי מערכת ההדמיה היא רגישה מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בעוצמתם, אך כי שינויי artifactual של משרעת גדולה מודחקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן להחיל על עורר, ספונטני, ופעילות הסינפטית מיניאטורי, ולהשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית לדוגמה ירושלים. פרוטוקול זה משלב גם אמצעי להערכת שיעור photobleaching של צבעי FM, כמו זה הוא משמעותימקור לחפצים כאשר הדמיה שינויים קטנים בעוצמתן.

Introduction

הפונקציונליות של שלפוחית ​​סינפטית היא הקובע חשוב של שידור סינפטי. בועיות אלו לשחרר נוירוטרנסמיטרים כאשר הם מתמזגים עם קרום presynaptic הפלזמה (exocytosis), והם הופכים להיות מוכנים למחזור נוסף של שחרור לאחר שנוצר מחדש מקרום הפלזמה (אנדוציטוזה) ומחדש עם מוליך עצבי. חקר הדינמיקה של ומנגנוני מחזור שלפוחית ​​הסינפטית כבר מואץ באופן משמעותי על ידי ההקדמה של צבעי FM styryl 1. מולקולות אלה amphipathic, אשר באופן חיובי יש לחייב קבוצות ראש הידרופילי וזנב הידרופובי (צבעים מרובים באיור 1 א ', stereoview של FM1-43 באיור 1 ב'), יכולות להיכנס ולצאת הפיך ממברנות שומנים בדם ללא מחלחל אותם. קבוצות של צבעי FM חולקים תכונות דומות המשפיעות על הטווח של אור שהם פולטים. לדוגמא, FM2-10, יש לי FM1-43, וFM1-84 קשר כפול אחד בין שתי תרכובות וsho מחזורייםפליטה ירוקה w. ההבדל ביניהם הוא אורך הזנב הידרופובי, הקובע הידרופוביות שלה, ולכן השיעור של יציאה מהקרום (departitioning). במקרים של FM5 -95 וFM4-64, שלושה קשרים כפולים לקשר תרכובות מחזוריות, והם מראים פליטה אדומה. צבעים אלו שונים ביחס לחלקים הידרופילי שלהם. בכל צבעי FM, עוצמת הקרינה עולה כאשר הם מוכנסים לתוך ממברנות ביולוגיות, כתוצאה מגידול בתשואת קוונטים בהידרופובי הסביבה ביחס לסביבה הידרופילי. לפיכך השינויים בעוצמת FM מייצגים את השינויים במחזור הממברנה. צבעים השונים (ספקטרום פליטה) וhydrophobicities להפוך FM צובע כלי מחקר מגוונים במחזור שלפוחית ​​הסינפטית.

בהתבסס על תכונות אלה, צבעי FM משמשים בעיקר על פי התכנית הבאה בעת ניתוח מחזור שלפוחית ​​הסינפטית (איור 2). עצבוןשל שטופים בפתרון תאי המכיל את צבע FM, המאפשר לה לנקוט לתוך שלפוחית ​​סינפטית (SVS) כפי שהם יוצרים באמצעות אנדוציטוזה (מכתים). לצבוע לאחר מכן נשטף החוצה על ידי יישום פתרון תאי נטול צבע, זה חושף את הקצוות עצבים תפקודיים, כלומר רק את אנדוציטוזה באופן פעיל בתהליך תכיל מקבץ של שלפוחית ​​סינפטית שנטענים עם הצבע (איור 2 תחתון). exocytosis לאחר מוביל לאובדן של צבע FM למרחב תאי ואובדן נלווה של הקרינה (destaining; בשל שני departitioning לסביבה הידרופילי ודיפוזיה מהאתר של exocytosis). לכן השינויים בעוצמת הקרינה FM הם אינדיקטורים של שלפוחית ​​Exo-ואנדוציטוזה הסינפטי.

צבעי FM שימשו כדי להכתים וdestain שלפוחית ​​סינפטית באורגניזמים והכנות 2,3 שונים. דוגמאות כוללות neur היונקיםתרבויות onal 4-9, פרוסות של יונקים מוח 10,11, צמתים התוקפת 12,13, הנוירונים דו קוטביים רשתית 14,15, ותאי שיער של שבלול אוזן 16.

בדרך כלל בניסויים כאלה, גם הצביעה וdestaining מופעלים על ידי הרחבת המרצת הנוירונים (הפעילות עורר). לאחרונה, עם זאת, מחזור שלפוחית ​​הסינפטית בתגובה לגירוי חלש יש גם ניתח, כפי שיש במחזור, בהעדר גירוי חיצוני (פעילות הסינפטית ספונטנית ומיניאטורי) 9,17-19. פעילות הסינפטית ספונטנית וזעירה מוגדרות אלה המתרחשים בהיעדר גירויים חיצוניים, עם לשעבר מעורב הירי הספונטני של פוטנציאלי פעולה (איור 3). פעילות הסינפטית החלשה אלה קשורים לשינויים קטנים יותר באותות FM מאלה שמופעלים על ידי גירוי נרחב. המדידה דורשת שהשינויים בfluoresc FMעוצמת ence משקפת במדויק exocytosis הסינפטי שלפוחית ​​או אנדוציטוזה אך שינויים לא artifactual באינטנסיביות. אחת סיבות לחפץ היא נוכחותם של כתמים ספציפיים של קרום הפלזמה על ידי צבעי FM. סחף הדרגתי של רכיב זה יביא לשינוי הדרגתי בעוצמת הקרינה שנמדדה, שיהיה מיוחס בטעות לפעילות הסינפטית. גורם זה יכול להיות מופחת על ידי שיטות מתאימות (ראה פרוטוקול). הסיבה הבולטת ביותר של החפץ היא photobleaching של צבע FM נשמרים בתוך שלפוחית ​​סינפטית. השינויים הקשורים לphotobleaching בעוצמת FM חייבים להיות קטנים בהשוואה לשינויים הביולוגיים (הסינפטי) שנמדדו. הפיתוח האחרון של מצלמות רגישות, למשל המצלמה מכשיר תשלום מצמידים אלקטרונים הכפלה (EMCCD), מאפשר למזער photobleaching על ידי קיצור זמן חשיפה ומחליש את עוצמת האור המשמש כדי לעורר את fluorophore. סיבה נוספת לחפץ היא i להיסחףn את רמת ההתמקדות של מיקרוסקופ אור. להיסחף להתמקד במהלך פגישת הדמיה יכולה להיגרם על ידי השפעות מכאניות או תרמית, ותהיה בטעות יביא לשינוי בעוצמת הקרינה שנמדדה.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד המאפשרים להשתמש בצבעי FM לנתח מחזור שלפוחית ​​הסינפטית אפילו בהקשר של גירוי חלש או לא, בפרט, הפעילות הסינפטית מיניאטורי. אנחנו מראים דוגמאות לצביעה וdestaining של שלפוחית ​​במהלך אירועים הסינפטי עוררים וספונטניים, תוך שימוש בתאי עצב בהיפוקמפוס המכרסם בתרבית, והדמית שלב destaining. אנחנו גם מדגימים כיצד להעריך את מידת photobleaching צבע FM, בהעדר כל אובדן צבע FM בשל פעילות הסינפטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות העיקרית של נוירונים מהמוח של היונקים

נהלי כל החיה שבוצעו במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת איווה.

  1. הכן תרבית תאים הניתקת של אזורי CA3-CA1 של ההיפוקמפוס מעכברים או חולדות בימים שלאחר לידה 0-1 19,20. פלייט התאים בהיפוקמפוס על coverslips 12 מ"מ (מספר עובי 0) preseeded עם שכבת מזין גליה חולדה, במנות 24 גם, ובצפיפות של 12,000 תאים / היטב.
  2. תרבות תאי העצב בהיפוקמפוס לפחות 8 ימים למסוף עצב פונקציונלי לפתח 21. אנו משתמשים בתאי עצב על 11-14 ימים במבחנה, כאשר מסופי עצב בודדים הם מבודדים יחסית בלי הרבה אשכולות. הנוירונים יכולים לשמש לניסויים עד כ 21-28 ימים במבחנה למשל יליג ואח'. 22 וNosyreva וKavalali 23.
  3. עבורמחקרים פונקציונליים, להעריך coverslips (לפני הצביעה) לאינדיקטורים של נוירונים בריאים באמצעות מיקרוסקופ מועבר אור (למשל אופטיקה ניגוד שלב בהגדלה של 10-20X). אינדיקטורים של בריאות טובה כוללים: שכבה אחידה גליה תא, מרווח סלולארי ברור סביב נוירונים, דנדריטים הרחיבו ללא מבנים חרוזים, חוסר somata אשכולות, וחוסר neurites ארוזות.

2. טוען שלפוחית ​​Synaptic עם דיי FM (מכתים)

  1. מכתים בשל פעילות הסינפטית עוררה על ידי גירוי שדה חשמלי (כולל פוטנציאל פעולה)
    1. הכן מכתים את הפתרון 1 על ידי הוספת צבע FM לפתרון נטול צבע מבוסס HEPES, הפתרון לדוגמא של Tyrode (ראה פתרונות לפרטים נוספים). הריכוז של צבע FM הוא 10 מיקרומטר FM1-43 ו2.5 מיקרומטר FM4-64. טווחי ריכוז אופייניים הם: 2-15 מיקרומטר FM1-43, או 2.5-20 מיקרומטר FM4-64 3,6. לניסויים הדורשים דיכוי חוזר ונשנהפעילות הסינפטית glutamatergic והאינדוקציה של פלסטיות הסינפטית, להוסיף עוד יריבים של קולטני גלוטמט ionotropic: קולטני AMPA (למשל 10 מיקרומטר CNQX) וקולטני NMDA (למשל מיקרומטר AP5 50).
    2. העבר את coverslip עם תאים מהמדיום לתרבות לחדר ההדמיה prefilled עם הפתרון של Tyrode רגיל. אנו משתמשים בחדר הדמיה עם אלקטרודות הגירוי צמודות לקירות הצד (חוטי פלטינה מופרדים על ידי 6.3 מ"מ, RC-21BRFS). חדר זה ​​נועד כחדר הדמיה סגור, אך אנו משתמשים בו כחדר פתוח (כלומר ללא coverslip עליון), עם אמבטיה בנפח של ~ 200 μl. במהלך העברה, אל תחשפו את התאים בתרבית לאוויר, ולהימנע צובט את התאים בתרבית עם פינצטה (להרים את coverslip מההיקף ולא בסמוך למרכז).
    3. Perfuse חדר ההדמיה עם הפתרון של Tyrode רגיל בטמפרטורת חדר (23-25 ​​° C).
    4. החל מכתים את הפתרון 1 על ידי שיתוףזלוף nstant.
    5. לעורר פעילות הסינפטית על ידי החלת פולסים חשמליים. עבור מכתים מקסימאלי של בריכת המיחזור הכוללת של שלפוחית ​​סינפטית בנוירונים בהיפוקמפוס, לעורר את התרבויות ב10 הרץ ל60-120 שניות 24. כאשר מנסה להשיג יעילות מקסימלי של גירוי שדה, לשמור על מספר תכונות בראש. 1) הגובה של פתרון האמבטיה צריך להיות נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על תאי העצב ומגרת אלקטרודות שקועים כולו בשכבה דקה של הפתרון של Tyrode (על מנת לשמור על תאי העצב בחיים ולהשיג שדה חשמלי הומוגני). 2) עוצמת ומשך נוכחיים צריכה להיות מותאם באמצעות מחוון של רגישות עצבית, כגון ניאון Ca 2 + הדמיה, במקרה שלנו, זרם קבוע של 30 עוצמת mA ו1 משך אלפיות שני נותן תוצאות אמינות. 3) פתרון האמבטיה צריך להיות מיושם בזרם בלתי פוסק במהלך גירוי; הגירוי החשמלי מוביל לאלקטרוליזה, גורם לפרוטונים (H למשל 'הנקס עם פנול אדום).
    6. השאר את הנוירונים בפתרון מכתים 1 ל60 שניות נוספות לאחר גירוי שדה הפקעה, כך שאנדוציטוזה הודעה הגירוי תושלם 25.
    7. שטוף את הפתרון מכתים מתוך חדר ההדמיה ידי מרוסס זה עם פתרון שטיפת 1, הפתרון של Tyrode נטול צבע בתוספת יריבים של קולטני AMPA וקולטני NMDA (ראה סעיף 2.1.1), וחוסם של מתח תלוי + ערוצי Na ( למשל tetrodotoxin 0.5-1 מיקרומטר, TTX). השילוב של חוסמי ימנע את אובדן צבע FM באמצעות פעילות הסינפטית ספונטנית. כדי למקסם את יעילות השטיפה, להגביר את קצב זלוף (<em> לדוגמא של עד 5-6 מיליליטר / דקה) עבור 1-2 דק ', ולהוסיף בולוס (למשל 1 מיליליטר) של שטיפת פתרון 1 ישירות לחדר ההדמיה הפתוח באופן ידני, באמצעות פיפטה. לשלוט על עוצמת וכיוון העירוי ידני, כדי לא להפריע לנוירונים בתרבית.
  2. מכתים בשל פעילות הסינפטית שמעוררת גבוה K + פתרון (אינו כרוך בפוטנציאל פעולה).
    1. הכן מכתים את הפתרון 2 על ידי הוספת צבע FM לפתרון הגבוה של-K + Tyrode. באופן ספציפי, להכין פתרון של Tyrode שונה עם 45 מ"מ KCl, על ידי החלפת equimolar של KCl לNaCl. במידת הצורך, להוסיף את היריבים של קולטני AMPA וNMDA. פתרון גבוה K + זה depolarize נוירונים ברציפות, מאפשר Ca 2 + זרם אל קצוות עצבים, וליזום exocytosis שלפוחית ​​הסינפטית ל26 המידה המקסימלי. ריכוזים גבוהים יותר (70-90 מ"מ) שימשו גם בדיווחים אחרים לדוגמא Klingauf et al. 27ד ריצ'רדס et al. 28
    2. העבר את coverslip עם נוירונים בתרבית מהתרבות בינונית לחדר ההדמיה prefilled עם הפתרון של Tyrode רגיל.
    3. להכתים את הנוירונים בטמפרטורת חדר למשך 1-2 דקות על ידי יישום פתרון מכתים 2 בטפטוף קבוע או באמצעות 26,28 פיפטה. במקרה האחרון, ריכוז הצבע הסופי צריך להיות נשלט על ידי הוספת נפח ידוע של מכתים פתרון 2 עד נפח ידוע של תמיסה נטולת צבע.
    4. שטוף את הפתרון מכתים מתוך חדר ההדמיה, כמפורט בסעיף 2.1.7.
  3. מכתים בשל פעילות הסינפטית ספונטנית ומיניאטורי.
    1. פתרון Prewarm מבוסס ביקרבונט (למשל בינוני מינימום הכרחי, MEM) 37 ° C על ידי הצבת בחממת התרבות ליותר מ -60 דקות.
    2. עבור מכתים המבוסס על פעילות הסינפטית ספונטנית, להכין פתרון מכתים 3 על ידי הוספת צבע FM לממ. עבור מכתים מבוסס על מ 'iniature פעילות הסינפטית, להכין פתרון מכתים 4 על ידי הוספת TTX לפתרון מכתים 3.
    3. נוירונים כתם על ידי העברת coverslip עם נוירונים בתרבית ממדיום התרבות מכתים פתרון 3 או 4, ומשאיר אותם באותו הפתרון מכתים ב37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    4. שוטפים את coverslip בקצרה בשטיפת פתרון 1.
    5. העבר את coverslip לשטיפת פתרון 1 בחדר הדמיה. זכרו את הדברים הבאים. 1) תאים לא צריכים להיות חשופים לאוויר, ואם יש צורך, להעביר את coverslip ישירות לחדר ההדמיה ללא שטיפה. 2) יכולים להיות מוכתמים נוירונים בטמפרטורת חדר על ידי החלפה מכתים פתרון 3 או 4 עם פתרון המבוסס על HEPES. 3) נוירונים יכולים להיות מוכתמים לפעילות הסינפטית עוררת בהקשר של גבוה K + פתרון באמצעות שיטה זו, על ידי החלפה מכתים פתרון 3 או 4 עם מכתים פתרון 2 וביצוע הצעדים שנותרו בטמפרטורת חדר.
    6. שטוף את הפתרון מכתים מתוך ההדמיהתא כמתואר בסעיף 2.1.7.

3. שטפתי את צבע FM

  1. לאחר צביעה עצבית ושטיפה ראשונית על ידי כל אחת מהשיטות הנ"ל, שתוארו (הסעיף 2.1.7), ימשיך תנקב חדר ההדמיה עם שטיפת פתרון 1 ל5-10 דקות בטמפרטורת חדר. פעולה זו תסיר את צבע FM מקרום הפלזמה והפתרון תאי. במקרה של חדר ההדמיה שלנו, שיעור זלוף האמבטיה הוא 600-1,200 μl / min. כביסה יכולה גם להתבצע בהעדר Ca תאי 2 + לדכא אובדן צבע FM בשל פעילות הסינפטית 17. ניתן לשפר שוטף על ידי יישום קצר של Advasep-7, ציקלודקסטרין שונה המשמש כנבלות של צבעי FM מקרום הפלזמה 29-31. זה חיוני כדי לשמור על Advasep-7 כל חשיפה קצרה (5 שניות לדוגמא במקרה של תרבות monolayer) כדי להימנע משתי הקטנת עוצמת puncta FM 31 ובהתפשרות על heaLTH של התאים. הקרינה מן FM1-43 בקרום הפלזמה גם יכולה להיות מדוכאת על ידי יישום של sulforhodamine מרווה 101 (50-100 מיקרומטר) שלא נכנס שלפוחית ​​סינפטית 32.

4. מחפש שדה תמונה אופטימלי במהלך כביסה

  1. ודא שהתאים בתחום להיות צילמו בריאים, תוך שימוש במיקרוסקופ אור מועבר עם עדשת ההגדלה גבוהה וגבוה מספרי-צמצם אובייקטיבי (למשל 40X). מסעיף זה, שאנו ממשיכים להשתמש במיקרוסקופ הפוכה (Eclipse Ti, ניקון) מצוידים בניגוד שלב או אופטיקה התערבות ההפרש לעומת זאת. מיקרוסקופ זה הוא גם מצויד במערכת המושלמת פוקוס (PFS) המאפשר תיקון רציף, בזמן אמת, התמקדות, אשר מתגבר להיסחף מוקד מיקרוסקופ. תכונה זו היא חיונית לזמן לשגות הדמיה במהלך destaining עם אותו מטוס ההתמקדות.
  2. ודא מכתים שהיה יעיל, על ידי השימוש באופטיקה הקרינה. אבאגרגטים OID של puncta FM, אלא אם כן הם היעד של מחקר, כי boutons הבודד יהיה קשה להבחין. שים לב לצורות של puncta FM: אם רוב boutons המוכתם מופיעים כמחרוזות של חרוזים עגולים, הם יכולים לייצג מסוף עצב לא בריא. למזער את החשיפה של תאי העצב לעירור הקרינה חזק על מנת למנוע photobleaching.

5. פריקת FM דיי משלפוחית ​​סינפטית (destaining)

  1. Destaining בשל פעילות הסינפטית עורר על ידי גירוי שדה חשמלי.
    1. לשטוף TTX על ידי מרוסס נוירונים בהרחבה עם פתרון שטיפה 2 (אותו דבר כמו שטיפת פתרון 1 אך ללא TTX). לאשר את היעילות של כישלון TTX בניסויים נפרדים, תוך שימוש באותם הפרמטרים כביסה (שיעור זלוף ומשך), למשל על ידי Ca ניאון 2 + הדמיה של 2 + ארעיים cytoplasmic Ca הנגרם על ידי גירוי שדה, או על ידי הקלטת התיקון-clamp של וולטזרמי Na + תלוי גיל.
    2. התחל הדמיה צבעי FM. הדמיה FM1-43 או FM4-64, השתמש 520 ננומטר או 650 מסנני פליטת מסירה ארוכה ננומטר, בהתאמה ומסנן עירור 490 ננומטר. לרכוש תמונות בכל שנייה 1-2, באמצעות זמן קצר חשיפה (לדוגמא 10-20 אלפיות שנייה), בעוצמה חלשה עירור (למשל 5-10% מכוח LED), ורגישות גבוהה (למשל עם רווח EM). למזער photobleaching של צבעי FM על ידי צמצום זמן חשיפה ועוצמת עירור הקרינה. למזער את נדידת מוקד מיקרוסקופ ידי הפעלת מערכת הפוקוס המושלמת.
    3. לעורר את תאי העצב בשטיפת פתרון 2, תוך שימוש בשדה גירוי (למשל ב10 הרץ ל120 שניות) 20.
    4. החל סיבובים רבים של גירוי, עם תקופות מנוחת התערבות של 1-2 דק ', לרוקן את כל שלפוחית ​​סינפטית המיחזור של צבע FM. זה חשוב כאשר הערכת גודל בריכת מחזור הכוללת של שלפוחית ​​סינפטית שהיו מוכתמות בצבעים FM בהדואר מדינה לפני 20,33.
  2. Destaining בשל פעילות הסינפטית עורר בהעדר פוטנציאל פעולה.
    1. התחל הדמיה לצבוע FM.
    2. החל ריאגנטים המגרה מומסים בשטיפת פתרון 1 או 2. ריאגנטים מסוג זה כוללים: KCl (פתרון גבוה K +, למשל 45 מ"מ) 26, ionomycin (Ca 2 + ionophore שמעלה את 2 + ריכוז Ca תוך תאי כך שהוא מאפשר Ca 2 + זרם לתוך התא מהפתרון תאי, למשל בשימוש ב 5 מיקרומטר) 20,34, וסוכרוז (פתרון hypertonic שממגר את השחרור של שלפוחית ​​סינפטית מברכת releasable בקלות, למשל בשימוש ב500 מ"מ) 35,36. השתמש במערכת מהירה, מקומית זלוף לשליטה זמנית אמינה ביישום חומרים כימיים, כגון: מערכת SF-77B משל ורנר מכשירים 37, או מערכת Y-צינור 38-40.
  3. Destaining בשל ספונטני ודקותiature פעילות הסינפטית.
    1. לdestaining בשל פעילות הסינפטית ספונטנית, לשטוף את TTX כאמור לעיל (סעיף 5.1.1), תוך שימוש בשטיפת פתרון 2. התחל הדמיה צבעי FM במהלך מרוססי נוירונים עם שטיפת פתרון 2. לdestaining בשל פעילות הסינפטית זעירה, להתחיל הדמיה צבעי FM, תוך המשך ינקב נוירונים עם שטיפת פתרון 1 (עם TTX).
    2. לאחר destaining מבוסס על פעילות או ספונטנית או זעירה, לזהות את הקצוות העצבים תפקודיים על ידי destaining באמצעות פעילות הסינפטית עוררה. פעילות יכולה להיות עורר על ידי מי מהנהלים שתוארו לעיל. תהליך זיהוי זה הוא הכרחי משום שהמבנים המוכתמים יכולים להיות אלה שאינם מסופים הפונקציונליים העצביים (למשל מחזור לאט endosomes או שלפוחית ​​astrocytic) וכמות גדולה של destaining ידי עזרי פעילות העוררים בתהליך זה.

6. הערכת שיעור Photobleaching של צבעי FM

  1. כתם מסופי עצב עם צבע FM אלדהיד-ניתן לתקן (למשל FM1-43FX, FM4-64FX). זה יכול להיעשות בשיטה עוררה, ספונטנית, או מיניאטורי מכתים שתוארה לעיל, ועל ידי החלפת צבע FM עם צבע FM ניתן לתקן.
  2. לשטוף את צבע FM ניתן לתקן כאמור בסעיף 2.1.7.
  3. כימי לתקן את הנוירונים על ידי העברת coverslip לפתרון מקבע: paraformaldehyde 4% וסוכרוז 4% בפתרון של Tyrode ל30 דקות ב 4 ° C. עוצמת הקרינה של צבע FM ניתן לתקן תישמר לאחר קיבוע כימי.
  4. לשטוף את מקבע עבור 10 דקות בפתרון של Tyrode, על ידי העברת coverslip לפתרון של Tyrode הטרי פעמיים.
  5. העבר את coverslip לפתרון של Tyrode הטרי בחדר ההדמיה.
  6. התחל הדמיה לצבוע FM ניתן לתקן תוך שימוש באותו הסט של פרמטרים הדמיה כלנוירונים חיים. חשוב לשטוף את חדר ההדמיה היטב לאחר השימוש בכל דגימה קבועה כימי, כיכל מקבע שנותר יכול להשפיע על ניסויי הדמיה לחיות תאים שלאחר מכן בוצעו באותו החדר. לחלופין להדמית תא הקבוע, תאי חיים המוכתמים עלולים להיות צילמו להערכת שיעור photobleaching. עם זאת, כדאי לזכור שזה קשה כדי לחסום את הפעילות הסינפטית מיניאטורי בחריפות, למשל, תדירות פעילות זעירה יכולה להיות מופחתת ל ~ 50% על ידי הסרת Ca תאי 2 + 23, אבל זה לא מוחלט מצור.
  7. בסוף כל פגישת הדמיה, לרכוש תמונת רקע להערכת הערך המוחלט של עוצמת הקרינה ה-FM. עוצמת puncta FM מייצגת את האות לא רק נכונה מצבעי FM במסוף עצב, אלא גם את רעש רקע מ1 תאים) גליה העומדים בבסיס התרבות העצבית monolayer, 2) coverslip ורכיבים אופטיים (עדשה למשל אובייקטיבית, מסננים ו מראות), ו 3) הגלאי (המצלמה EMCCD). רעשי רקע הוא assessed באזורי nonstained של שדה הדמיה. כאשר האזורים אמורים מוגבלים בחלל או הטרוגנית בעוצמתם, להחליף אותו עם תמונה עם תריס המצלמה סגור ולרכוש רעש מהגלאי, למרות שזה לא שיטה אידיאלית. לרכוש כ 10 תמונות באמצעות אותם הפרמטרים ההדמיה.

7. ניתוח תמונה

  1. לייבא את הנתונים שנרכשו לתוך תוכנת דימוי ניתוח כערימה של תמונות בזמן סדרה. אנו משתמשים ImageJ (WS Rasband, NIH) והתוספות הנלוות, כגון: מייצב תמונת התוספת (קאנג לי) לתיקון במידה קטנה של תנועה בקרב puncta FM, הסדרות עתיות Analyzer V2.0 (באלאג'י ג'איאפראקאש) לניתוח סדרת הזמן.
  2. לחשב את השינויים בעוצמת FM בתחילת וסוף הסדרה (ΔFM). לשם כך, בממוצע התמונות לפני תחילת destaining ולאחר תום destaining (למשל 5 מסגרות תמונה כל אחד), וליצור תמונת הבדל על ידי subtractinגרם להם.
  3. זהה את מסוף עצב פוטנציאל התפקודי על ידי יישום סף עוצמה לתמונת ההבדל, וכדי לזהות פיקסלים עוצמות שגבוהות מהסף. אחת שיטות לקביעת הסף היא לבחור את סטיית התקן של עוצמת הרקע המתקבלת מהשטח coverslip החשוף.
  4. זהה את המסופים המבודדים, פונקציונליים עצביים כמו פיקסלים רציפים שהתגלו ושיספקו את קריטריון גודל (מספרים מינימאליים ומקסימאליים של פיקסלים ברצף). תהליך זה מבטל רעשי רקע ומסוף עצב מצטבר מניתוח.
  5. הקצאה (ROIs) אזורים של ריבית על האשכולות זוהו פיקסל (עם אשכולות בודדים מתאימים למסופי עצב בודדים). סך השינוי באינטנסיביות במהלך destaining (ΔFM) הוא פרמטר אופייני לניתוח. זה מייצג את הסכום המצטבר של פעילות הסינפטית עוררת, ספונטנית או מיניאטורי. תכלול ROIs אם הם מפגינים כל אחד מאלהשינויים בעוצמת בהתאם למטרות של ניסויים: עלייה בזמן ההקלטה, ירידה פתאומית לפני הגירוי, או חביון ארוכה לאחר גירוי.
  6. להעריך את שיעור photobleaching ידי יבוא נתונים בזמן סדרה שנרכשו לתוך תוכנת דימוי ניתוח. ממוצע תמונות הרקע (למשל עם תריס סגור), ולחסר אותו מהתמונות בודדות. הקצאת ROIs לpuncta FM שputatively מתאימות למסוף עצב, ולמדוד את השינויים בעוצמת החזר השקעה לאורך זמן.

פתרונות

  1. הפתרון של Tyrode
    • הרכב (במ"מ): 125 NaCl, KCl 2, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 30 גלוקוז, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7.4.
  2. פתרון מכתים 1
    • פתרון בתוספת צבע FM של Tyrode.
    • פתרון זה משמש לצביעה, המבוסס על פעילות הסינפטית עורר על ידי גירוי חשמלי.
    • הוסף את היריבים של קולטני AMPA וNMDA receptoRS במידת צורך.
  3. מכתים פתרון 2
    • הפתרון של High-K + Tyrode בתוספת הצבע FM.
    • הפתרון של Tyrode שונה זה הוכן על ידי הגדלת ריכוז KCl ל45 מ"מ, על ידי החלפת equimolar של KCl לNaCl.
    • פתרון זה משמש לצביעה, המבוסס על פעילות הסינפטית עוררה על ידי שלילת קוטביות רציפה.
    • הוסף את היריבים של קולטני AMPA וקולטני NMDA במידת צורך.
  4. מכתים פתרון 3
    • פתרון MEM בתוספת צבע FM.
    • פתרון זה משמש לצביעה, המבוסס על פעילות הסינפטית ספונטנית.
  5. פתרון מכתים 4
    • פתרון MEM בתוספת צבע FM וTTX.
    • פתרון זה משמש לצביעה, המבוסס על פעילות הסינפטית מיניאטורי.
  6. שטיפת פתרון 1
    • פתרון בתוספת היריבים של קולטני AMPA וקולטני NMDA של Tyrode, וTTX.
  7. שטיפת פתרון 2
    • פתרון בתוספת היריבים של קולטני AMPA וקולטני NMDA של Tyrode, אבל בלי TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדוגמא, אנו מציגים תוצאות נציג לקורס זמן destaining של שלפוחית ​​סינפטית (איור 4). נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית הוכתמו FM4-64 באמצעות הפעילות הספונטנית סינפטיים (שלב 2.3) ונשטפו עם פתרון נטול צבע (שטיפת פתרון 2). ההדמיה מציגה את מהלך זמן destaining הראשוני באמצעות פעילות ספונטנית (שלב 5.3) (חלק הראשון של קו רציף, איור 4 א). זה ואחריו כמובן זמן destaining באמצעות שלושה סבבים של פעילות עוררת עם 10 גירוי שדה הרץ ל120 שניות כל אחד (שלב 5.1). אחת דרכים למדידת כמות destaining העורר מאוירת בחץ פעמיים הסתיימו (ΔFM עורר) שמתאים לגודל של בריכת מחזור הכוללת של שלפוחית.

לפני הגירוי הראשון ניתנו, חלה ירידה הדרגתית בעוצמת FM (מוגדלת באיור 4 ב). ירידה זו הייתה מורכבת מdestainingבשל פעילות הסינפטית ספונטנית (ΔFM Spont) וphotobleaching (ΔFM PB). כאשר התרומה של photobleaching היא קטנה, השינוי מנקודת התחלת preimaging (ΔFM Spont + ΔFM PB) יכול לשמש כקירוב לסכום destaining של פעילות ספונטנית.

איור 1
איור 1. מבנים של צבעי FM. א FM צובע מניות כמה תכונות מבניות משותפות. הקבוצות הידרופילי להישאר בתמיסה מימית והזנבות הידרופובי לאפשר צבעי FM ליחולקו לממברנה. FM2-10, FM1-43 וFM1-84 פליטה ירוקה מופע, תוך פליטת אדום העביר FM5 -95 וFM4-64 מופע. ב stereoview של FM1-43, לצבוע FM הנפוץ ביותר. קבוצה הידרופילי הוא פונה כלפי מעלה וזנבות הידרופובי הם פונים כלפי מטה. Nitrאטומים עוגן הם בצבע כחול. עבור תצוגה נוספת של FM1-43, ראה Schote וSeelig 63.

איור 2
איור 2. ערכה בסיסית של שימוש בצבע FM. לאחר יישום לתאי עצב, צבע FM מוכנס לתוך קרום הפלזמה הופכת ניאון (ירוק), ואילו שבתמיסה המימית היא הרבה פחות ניאון (אפור). שלפוחית ​​הסינפטית (SV) נטענת (מוכתם) על ידי צבע FM, כאשר הוא עובר אנדוציטוזה, בדרך כלל בעקבות exocytosis. שטפתי את צבע FM בפתרון תאי מאפשר רק שלפוחית ​​המוכתמת להיות ניאון. בהמשך לכך, שלפוחית ​​הסינפטית נפרקה (destained) כאשר הוא עובר exocytosis ולכן משחרר את צבע FM. תמונה שלהלן מדגימה מכתים מופת של נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים עם FM1-43 (כיסוי של תמונות בניגוד הקרינה ושלב). יש לשים לב, כי בפרוטוקול המתואר במאמר זה, puncta הניאון מייצג מסופי presynaptic עצב (קטרים ​​~ 1 מיקרומטר בנוירונים מרכזיים טיפוסיים) עם אשכולות של שלפוחית ​​סינפטית מוכתמת, לא שלפוחית ​​בודדת סינפטיים (קטרים ​​~ 40 ננומטר). לשם פשטות, תכנית זו מייצגת את רעיון כללי של Exo-אנדוציטוזה של שלפוחית ​​סינפטית. זה יכול לכלול צורות שונות של Exo-אנדוציטוזה, כגון היתוך מלא קריסה אחרי אנדוציטוזה בתיווך clathrin, Exo-אנדוציטוזה נשיקה וברח החולף, ואנדוציטוזה תפזורת 64. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
איור 3. שלושה סוגים של פעילות הסינפטית נחקרה על ידי ההדמיה FM. פעילות הסינפטית עוררה בדרך כלל דורשת גירויים חיצוניים, חשמליים. פעילות הסינפטית ספונטנית מתרחשת בהיעדר גירויים חשמליים. פעילות הסינפטית מיניאטורות מתרחשת באופן ספונטני ללא גירויים חשמליים וללא פוטנציאל פעולה: בדרך כלל דור פוטנציאל הפעולה מדוכא על ידי חוסם של המתח תלוי Na + ערוץ, tetrodotoxin. פעילויות נוספות כוללות פעילות העוררת כאשר exocytosis הוא מגורה על ידי פתרון גבוה K + (שלילת קוטביות רציפה), ionomycin (גידול מתמשך ב2 + ריכוז Ca cytoplasmic), ופתרון hypertonic המכיל סוכרוז (לעורר exocytosis של שלפוחית ​​בבריכת releasable בקלות), כל אשר לא ידרוש מן ירי פוטנציאל פעולה לשלפוחית ​​סינפטית לעבור exocytosis. שים לב, בחלק מהמחקרים, הפעילות הספונטנית מוגדרת באופן רחב על מנת להקיף פעילות מיניאטורי גם כן.

igure 4 "עבור: תוכן width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
איור 4. תוצאת נציג destaining. נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית א הוכתמו על ידי פעילות ספונטנית עם 2.5 מיקרומטר FM4-64 10 דקות ב 37 ° C (שלב 2.3), ושטפו (פרוטוקול 3). נוירונים הם צילמו במהלך destaining עם פעילות ספונטנית (שלב 5.3), ושלושה סבבים של פעילות עורר (שלב 5.1) (עקומה רציפה, ממוצע של n = 25 מסוף עצב). קווים אנכיים מייצגים SEM. ציר ה-Y מייצג את עוצמת FM המוחלטת ו" 0 "מייצג את עוצמת כאשר תריס מצלמה נסגר. הסכום הכולל של destaining העורר מצויינים (ΔFM עורר). ב הרחיב אור השלב הראשוני של destaining בפנל (עקומה רציפה, הברים SEM הושמטו לבהירות). במהלך תצפית שניות 60, העיכוב נבע בעיקר מאקט ספונטניivity (ΔFM Spont), אבל חלקו נבע photobleaching (ΔFM PB). כמובן זמן photobleaching של FM4-64 (עקומה מקווקוות עבה) נקבע בניסוי נפרד על ידי הדמיה ניתן לתקן FM4-64 (פרוטוקול 6). השיעור היה 2-3% מעל 2 דקות (פונקציה מעריכית יחידה עם קבוע של 5,736 שניות זמן, שנקבעו על ידי עקומה הולמת מעל 9 דקות) 19. עקומת photobleaching נמשכת כפונקציה מעריכית עם שווה ערך ראשוני לזה של העצמה הנמדדת של FM4-64. ראה S5 איור משלים בKakazu et al. 19 לphotobleaching על תקופה ארוכה יותר (9 דק '), ובעצמת העירור משתנה וזמן חשיפה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש לנו תארנו פרוטוקולים להכתמה וdestaining שלפוחית ​​סינפטית בתגובה לעורר, פעילות הסינפטית ספונטנית וזעירה, והדמיה בשלב destaining. בנוסף לפרוטוקולים הקיימים, יש לנו כלל בפרוטוקול חדש של התבוננות destaining FM המבוסס על פעילות הסינפטית מיניאטורי. תוך שימוש בפרוטוקולים אלה, זיהינו בעבר ליקויים בנוירונים בתרבית ממודל של עכברים של דיסטוניה ההפרעה לתנועה. בהשוואה לעמיתיהם בwild-type עכברים, תאי עצב אלו התנסו בי מואצים exocytosis שלפוחית ​​הסינפטית ב2 אופן + תלוי Ca כאשר מומרצים על ידי פעילות גבוהה 20. נוירונים אלה הראו גם פעילות הסינפטית מיניאטורי תכוף יותר, כפי שאושר על ידי קלטות אלקטרו תיקון מהדק של שחרור הנוירוטרנסמיטר 19.

ההיבט הקריטי של הפרוטוקול לשימוש בצבעי FM בניתוח כזה הוא ASSEss ולמזער photobleaching. שינויים עדינים בעוצמת הקרינה FM ניתן להעריך באופן מהימן אם השינויים שנגרמו על ידי photobleaching הם קטנים בהשוואה לאלה שמופעלים על ידי פעילות הסינפטית. photobleaching המופחת יש גם את הפוטנציאל לדכא או לחסל cytotoxicity. Photobleaching יכול להיות מופחת על ידי מזעור החשיפה של fluorophores לאור העירור, ויש לפחות שני מרכיבים של ציוד לעשות את זה בניסויים חי הדמיה. אחד מרכיבים חשובים הוא גלאי רגיש של פוטונים, למשל מצלמה EMCCD. זה עושה את זה אפשרי כדי למזער את המשך ועוצמת החשיפה ללא משפיע לרעה על זיהוי של פליטת הקרינה. רכיב הקשורים הוא מערכת מקור האור אשר מגבילה את החשיפה של הדגימה לאור העירור רק כאשר הגלאי רוכש תמונות. זו מושגת בקלות על ידי 41 LED אור המאפשרים שליטה יעילה של העיתוי של חשיפה לאור (ON / OFF לאakes הרבה פחות מmsec 1). החשיפה יכולה להיות מופעלת רק בעת לכידת תמונה, על ידי יציאה דיגיטלית מהמצלמה (מסוף למשל "אש" במצלמה אנדור). יתרונות נוספים של שימוש LED כוללים: היכולת לשלוט בעוצמת אור ללא שימוש במסנני צפיפות ניטראליים, יציבות לטווח ארוך של עוצמת האור, והעדר תנודות מכאניות אשר יפריעו לטיפול מדויק של טפטפות זכוכית כמו בהקלטה התיקון-clamp .

באופן כללי, צבעים שונים מבני photobleach בשיעורים שונים באותם תנאי ההדמיה. וכך זה יהיה אידיאלי כדי להעריך את מידת photobleaching של fluorophore משמש בניסוי מסוים. לצבעי FM בקצוות עצבים בשידור חי, זה מאתגר מבחינה טכנית כדי להעריך את השיעור עצמאי photobleaching של פעילות הסינפטית, בשל פעילות הסינפטית ספונטנית או מיניאטורי. ירידה בעוצמת הקרינה במהלך activit כזהy יכול להיות בגלל האובדן הביולוגי של צבעי FM (exocytosis), photobleaching של צבעי FM, או שניהם. למרבה המזל, את המבנים של צבעי FM ניתן לתקן נועדו להיות כמעט זהה לאלה של צבעי FM nonfixable. בפרוטוקול המתואר כאן, צבעי FM ניתן לתקן הועמסו לתוך שלפוחית ​​הסינפטית על ידי אותן השיטות כמו צבעי FM nonfixable, ואילו הפעילות הסינפטית נחסמה לאחר מכן על ידי קיבוע כימי של הדגימה. יש לציין, שיעור photobleaching נמדד באמצעות מערכת זו היה נמוך כמו 2-3% מעל 2 דקות, כאשר תנאי ההדמיה היו זהים לאלה של תאי חי הדמיה 19.

צבעי FM ניתן להשתמש בפרוטוקולים שונים כדי לחקור היבטים מגוונים של מחזור שלפוחית ​​הסינפטית. פעילות הסינפטית שונה במהלך הצביעה וdestaining ניתן לשלב בדרכים שונות, בהתאם למטרות הניסוי והתכונות ספציפיות של מחזור שלפוחית ​​הסינפטית להיות מוערכת. הבחירה של antagonists תלוי גם במטרה של הניסויים. יתר על כן, ההדמיה FM יכול להתבצע בשלב הצביעה, כמו גם בשלב destaining 9,18,42. כמו כן יש לזכור, עם זאת, כי צבעי FM יכולים להיות השפעות בלתי צפויות, כגון חסימה קולטני אצטילכולין מוסקריניים 43, ומחלחלים לערוצי mechanotransducer 44, Ca 2 + ערוצים המופעל בחנות 45, ו-ATP קולטני 46. ריכוזים גבוהים של צבעי FM עלולים לשנות את היעילות של exocytosis שלפוחית ​​הסינפטית עצמו 47. לכן אנו ממליצים על זהירות בתכנון הניסויים ולפרש את התוצאות ביחס למחזור שלפוחית ​​הסינפטית. שיטות משלימות לשקול תכלול ספיגה לתוך שלפוחית ​​הסינפטית של נוגדני אפיטופים שהם תחומים התוך lumenal של חלבוני שלפוחית ​​22,48. הם כוללים גם להביע GFP pH רגיש גרסאות ממוקדות ללומן שלפוחית ​​49-51, וספיגהשל conjugates נוגדן pH רגיש 52-54 שניהם לזהות שינויי pH התוך ועי הנלווים Exo-אנדוציטוזה.

ברגע שאינן נכללות בתופעות לא רצויות כגון, יש לי הצבעים FM יישומים רחבים. לדוגמא, הם יכולים לשמש כדי לענות אם הם באותו בריכות שלפוחית ​​הסינפטית משותפות לספונטנית ועוררו משחררת שלפוחית ​​17,55, באיזו מידת היעילות של מחזור שלפוחית ​​הסינפטי יכולה להיות מוסדרת 56,57, ומה השפעות עושה מדינה לפני (מנוחה או מגורה) להפעיל על המדינה מאוחר יותר של מחזור השלפוחית ​​מבוסס על, למשל ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. גם צבעי FM יכולים לשמש כדי להעריך מחזור שלפוחית ​​הסינפטית ברמת ultrastructural, על ידי קישור בין תצפיות מהאור ומיקרוסקופים אלקטרונים בשיטת photoconversion FM 30,58-62. צבע FM ניתן להשתמש בו זמנית לפקח פונקציות הסינפטי וCa 2 + קון תאייםcentration 5. בנוסף לתיוג של שלפוחית ​​סינפטית, צבעי FM וסמני נוזל שלב אחרים ניאון כגון dextran ניאון 7 ניתן להשתמש כדי לפקח על אנדוציטוזה בתפזורת שמופעלת על ידי פעילות עצבית אינטנסיבית. לסיכום, היישומים של צבעי FM לספק מקור רב ערך של מידע אודות מחזור שלפוחית ​​הסינפטית ופונקציות הסינפטי נוספות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לחברים במעבדה Harata לדיונים מועילים לאורך כל ביצוע עבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי, קרן דיסטוניה המחקר רפואי, Mallinckrodt אדוארד, הבן הקרן, הקרן הלאומית למדע והקרן וייטהול לNCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Neuroscience גיליון 85 מסופי Presynaptic Synaptic שלפוחית מיקרוסקופית הביולוגי assay מערכת עצבים אנדוציטוזה exocytosis דימות פלואורסצנטי לצבוע FM נוירון photobleaching
בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter