Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Undersøkelse av Synaptic Vesikkel Recycling Bruke FM Fargestoffer Under fremkalt, spontan, og miniatyr Synaptic Aktiviteter

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

Vi beskriver bruk av styryl FM fargestoffer til bilde synaptisk vesikkel gjenvinning i funksjonelle nerveterminaler. Denne protokoll kan anvendes ikke bare for å fremkalt, men også spontan og miniatyr synaptiske aktiviteter. Protokollen utvider rekke synaptiske hendelser som kan effektivt evaluert.

Abstract

Synaptiske vesikler i funksjonelle nerveterminaler gjennomgå eksocytose og endocytose. Dette synaptisk vesikkel gjenvinning kan være effektivt analysert ved hjelp styryl FM fargestoffer, som avslører membran omsetning. Konvensjonelle protokoller for bruk av FM-fargestoffer ble designet for å analysere nevroner følgende stimulert (fremkalt) synaptiske aktivitet. Nylig har protokoller blir tilgjengelige for å analysere FM-signaler som følger svakere synaptiske aktiviteter, for eksempel spontane eller miniatyr synaptiske hendelser. Analyse av disse små endringer i FM-signaler krever at avbildningssystem er tilstrekkelig følsomt til å detektere små forandringer i intensiteten, men at kunstig endring av stor amplitude undertrykkes. Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å fremkalt, spontan, og miniatyr synaptiske aktiviteter, og bruke dyrkede hippocampus nevroner som et eksempel. Denne protokollen inneholder også et middel for å vurdere graden av fotobleking av FM-fargestoffer, da dette er en betydeligkilde av gjenstander når imaging små endringer i intensitet.

Introduction

Funksjonaliteten av synaptiske vesikler er en viktig determinant av synaptisk transmisjon. Disse vesikler slipper nevrotransmittere når de smelter sammen med den presynaptiske plasmamembran (eksocytose), og de blir klar for en ny syklus av utgivelsen etter å ha blitt regenerert fra plasmamembranen (endocytose) og lastes med nevrotransmitter. Forskning på dynamikken i og mekanismene bak synaptisk vesikkel gjenvinning har blitt kraftig fremskyndet av innføringen av styryl FM fargestoffer en. Disse amphipathic molekyler, som har positivt ladede vanntiltrekkende leder grupper og hydrofobe haler (flere fargestoffer i figur 1A, stereoview av FM1-43 i figur 1B), kan reversibelt inn og ut lipid membraner uten gjennomsyre dem. Grupper av FM fargestoffer dele lignende funksjoner som påvirker omfanget av lys som de slipper ut. For eksempel, FM2-10, FM1-43, og FM1-84 har en dobbeltbinding mellom to cykliske forbindelser og show grønn utslipp. Forskjellen mellom dem er lengden av den hydrofobe halen, som bestemmer dens hydrofobisitet og dermed hastigheten av utgangen fra membranen (departitioning). I de tilfeller av FM5-95 og FM4-64, tre dobbeltbindinger koble de sykliske forbindelser, og de viser røde utslipp. Disse fargestoffer forskjellige med hensyn til sine hydrofile deler. I alle FM-fargestoffer, øker fluorescensintensiteten når de blir satt inn i biologiske membraner, på grunn av en økning i kvanteutbytte i det hydrofobe miljø i forhold til det hydrofile miljø. Dermed endringene i FM intensitet representerer endringene i membranen omsetning. De ulike fargene (utslipp spektra) og hydrofobisiteter gjør FM fargestoffer en allsidig forskningsverktøy i synaptisk vesikkel resirkulering.

Basert på disse funksjonene, er FM-fargestoffer for det meste brukt i henhold til følgende skjema når analysere synaptisk vesikkel gjenvinning (figur 2). Neurons er badet i et ekstracellulært løsning som inneholder FM fargestoff, slik at det å bli tatt opp i synaptiske vesikler (SVS) som de danner via endocytose (flekker). Fargestoffet blir deretter vasket ut ved å anvende et fargestoff-fritt ekstracellulær løsning, og dette viser de funksjonelle nerveterminaler, dvs. bare de aktivt gjennomgår endocytose vil inneholde en klynge av synaptiske vesikler som er lastet med fargestoffet (figur 2 på undersiden). Etterfølgende eksocytose fører til tap av FM fargestoff til ekstracellulære rom og en samtidig tap av fluorescens (avfarging, på grunn av både departitioning til en hydrofil miljø og diffusjon bort fra stedet av eksocytose). Derfor endringene i FM fluorescens intensitet er indikatorer på synaptisk vesikkel exo-og endocytose.

FM fargestoffer har blitt brukt til å farge og destain de synaptiske vesikler i ulike organismer og preparater 2,3. Eksempler inkluderer pattedyr neuronal kulturer 4-9, pattedyr hjernen skiver 10,11, nevromuskulære veikryss 12,13, retinal bipolare nevroner 14,15, og hårcellene i cochlea 16.

Typisk i slike forsøk, blir både farging og avfarging utløst av stor utstrekning å stimulere nervecellene (fremkalt aktivitet). Nylig har imidlertid synaptisk vesikkel gjenvinning i respons til svak stimulering har også blitt analysert, som har resirkulering i fravær av en ekstern stimulus (spontan og miniatyr-synaptisk aktivitet) 9,17-19. Spontane og miniatyr synaptiske aktiviteter er definert som de som forekommer i fravær av eksterne stimuli, med den tidligere involverer spontan avfyring av aksjonspotensialer (figur 3). Disse svake synaptiske aktiviteter er forbundet med mindre endringer i FM-signaler enn de som utløses av omfattende stimulering. Målingen krever at endringene i FM fluorescerendeence intensitet nøyaktig reflektere synaptisk vesikkel eksocytose eller endocytose men ikke kunstig endringer i intensitet. En årsak til at gjenstanden er tilstedeværelsen av ikke-spesifikk farging av plasmamembranen av FM-fargestoffer. Gradvis utvasking av denne komponenten vil føre til en gradvis endring i den målte fluorescens intensitet, som vil bli feilaktig tilskrives synaptisk aktivitet. Denne faktoren kan reduseres ved hjelp av egnede metoder (se Protocol). Det mest bemerkelsesverdige årsaken til gjenstanden er fotobleking av FM fargestoff beholdes i synaptiske vesikler. De fotobleking relaterte endringer i FM intensitet må være liten i forhold til de biologiske (synaptic) endringer som er målt. Den siste utviklingen av følsomme kameraer, f.eks elektron-multiplisere charge-coupled device (EMCCD) kamera, som gjør det mulig å minimalisere fotobleking ved å korte eksponeringstid og svekke intensiteten til lyset som brukes for å eksitere fluoroforen. En annen årsak til gjenstanden er en drift in fokuserings nivå av lysmikroskop. Fokuset drift under en avbildning sesjon kan være forårsaket av mekaniske eller termiske effekter, og vil feilaktig føre til en endring i den målte fluorescens intensitet.

Her beskriver vi protokoller og utstyr som gjør det mulig å bruke FM-fargestoffer for å analysere synaptiske vesikkel resirkulering til og i sammenheng med svak eller ingen stimulering, særlig miniatyr synaptisk aktivitet. Vi viser eksempler på farging og avfarging av vesikler under fremkalt og spontane synaptiske hendelser, bruk av kultur gnager hippocampus nevroner, og bildebehandling avfarging fasen. Vi viser også hvordan man skal vurdere graden av FM fargestoff fotobleking, i fravær av en hvilken som helst FM fargestoff tap på grunn av synaptisk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Primær Culture av nerveceller fra pattedyrhjernen

Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa.

  1. Klargjør dissociated cellekultur av CA3-CA1 regioner i hippocampus fra mus eller rotter dager etter fødsel 0-1 19,20. Plate de hippocampus celler på 12-mm dekkglass (tykkelse nummer 0) preseeded med rotte glial matersjikt, i 24-brønn retter, og ved en densitet på 12.000 celler / brønn.
  2. Kultur hippocampus nevroner i minst åtte dager for funksjonelle nerveterminaler for å utvikle 21. Vi bruker nevroner på 11-14 dager in vitro når individuelle nerveterminaler er relativt isolert uten mye clustering. Nerveceller kan brukes til eksperimenter opptil ca 21-28 dager in vitro f.eks Willig et al. 22 og Nosyreva og Kavalali 23..
  3. Forfunksjonelle studier, vurdere dekkglass (før farging) for indikatorer på friske nevroner bruker overføres lysmikroskopi (f.eks fasekontrast optikken i en forstørrelse på 10-20X). Indikatorene på god helse inkluderer: en uniform glial celle laget, en klar cellular margin rundt nervecellene, utvidede dendritter uten beaded strukturer, mangel på klynge somata, og en mangel på medfølgende neurites.

2. Legge den synaptiske vesikler med FM Dye (Farging)

  1. Flekker på grunn av synaptiske aktivitet fremkalt av elektrisk felt stimulering (innebærer aksjonspotensialer)
    1. Forbered flekker løsning en ved å legge til FM fargestoff til en HEPES basert dye-fri løsning, f.eks Tyrode løsning (se Løsninger for detaljer). Konsentrasjonen av FM-fargestoff er 10 uM FM1-43 og 2,5 uM FM4-64. Typiske konsentrasjonsområder er: 2-15 mikrometer FM1-43, eller 2,5 til 20 mikrometer FM4-64 3,6. For eksperimenter som krever undertrykkelse av tilbakevendendeglutamaterg synaptiske aktivitet og induksjon av synaptisk plastisitet, videre legge antagonister av ionotrofiske glutamatreseptorer: AMPA reseptorer (f.eks 10 mikrometer CNQX) og NMDA-reseptorer (f.eks 50 mikrometer AP5).
    2. Overfør et dekkglass med cellene fra dyrkningsmediet til avbildnings kammer fylt inn med vanlig Tyrode løsning. Vi benytter en avbildning kammer med stimuleringselektroder festet til sideveggene (platinatråder adskilt med 6,3 mm, RC-21BRFS). Dette kammer er utformet som et lukket kammer tenkelig, men vi bruke det som et åpent kammer (dvs. uten en toppdekkglass), med et bad volum på ~ 200 ul. Under overføring, ikke utsett dyrkede celler til luft, og unngå å klemme de dyrkede celler med pinsett (plukke dekk opp fra omkretsen snarere enn nær sentrum).
    3. Perfuse bildekammeret med vanlig Tyrode løsning ved romtemperatur (23-25 ​​° C).
    4. Påfør flekker løsning en av constant perfusjon.
    5. Fremkalle synaptiske aktivitet ved å bruke elektriske pulser. For maksimal farging av den totale gjenvinning pool av synaptiske vesikler i hippocampus-neuroner stimulerer kulturene ved 10 Hz på 60-120 sek 24. Når jeg prøver å oppnå maksimal effektivitet i feltet stimulering, holde flere funksjoner i tankene. 1) Høyden av badekaret oppløsningen bør være så lavt som mulig, samtidig som de nervecellene og stimulerende elektroder helt nedsenket i et tynt lag med Tyrode løsning (for å holde neuronene i live, og for å oppnå et homogent elektrisk felt). 2) Strøm intensitet og varighet bør optimaliseres ved hjelp av en indikator på neuronal eksitabilitet, f.eks fluorescerende Ca 2 + avbildning, i vårt tilfelle, en konstant strøm på 30 mA intensitet og 1 msek varighet gir pålitelige resultater. 3) Et bad oppløsningen skal anvendes ved konstant volumstrøm ved stimulering, og den elektriske stimulering fører til elektrolyse, forårsaker protoner (H (f.eks Hanks 'balanserte saltløsning med fenolrødt).
    6. La neuronene i farvestoffoppløsningen en i ytterligere 60 sekunder etter at feltstimulering er avsluttet, slik at post-stimulus endocytose vil bli fullført 25..
    7. Vask farging løsning av avbildningskammeret ved perfusjon den med renseoppløsningen 1, et fargestoff-fri Tyrode oppløsning plus antagonister av AMPA-reseptorer og NMDA-reseptorer (se avsnitt 2.1.1), og en blokkering av spennings-avhengige Na +-kanaler ( f.eks 0,5-1 mikrometer tetrodotoxin, TTX). Kombinasjonen av blokkeringer vil undertrykke tap av FM-fargestoff gjennom spontan synaptisk aktivitet. For å maksimere vaskeeffektiviteten, øke perfusjon rate (<em> for eksempel opp til 5-6 ml / min) i 1-2 min, og legge til en bolus (f.eks 1 ml) av Renseoppløsning 1 direkte til den åpne avbildning kammeret manuelt, ved hjelp av en pipette. Kontroll av styrken og retningen av manuell infusjon, for ikke å forstyrre de dyrkede neuroner.
  2. Flekker på grunn av synaptiske aktivitet fremkalt av høy-K +-løsning (ikke innebærer aksjonspotensialer).
    1. Forbered flekker løsning to ved å legge til FM fargestoff til høy-K + Tyrode løsning. Nærmere bestemt, forberede en modifisert Tyrode løsning med 45 mM KCl, etter ekvimolar substitusjon av KCl for NaCl. Hvis nødvendig, legge antagonister av AMPA og NMDA reseptorer. Denne high-K +-løsning vil depolarize nevroner kontinuerlig, aktiverer Ca 2 + tilstrømningen til nerveterminaler, og initiere synaptisk vesikkel eksocytose til maksimal grad 26. Høyere konsentrasjoner (70-90 mm) ble også brukt i andre rapporter f.eks Klingauf et al. 27 end Richards et al. 28
    2. Overfør et dekkglass med dyrkede nerveceller fra dyrkningsmediet til avbildnings kammer fylt inn med vanlig Tyrode løsning.
    3. Flekk neuronene ved romtemperatur i 1-2 min ved å anvende farvebehandlingsoppløsning, 2 ved konstant perfusjon eller ved hjelp av en pipette 26,28. I det sistnevnte tilfellet bør den endelige fargekonsentrasjons kontrolleres ved tilsetning av et kjent volum av farvestoffoppløsningen 2 til et kjent volum av fargestoff-fri oppløsning.
    4. Vask farging løsning av avbildnings kammer, som beskrevet i seksjon 2.1.7.
  3. Flekker på grunn av spontan og miniatyr synaptisk aktivitet.
    1. Prewarm bikarbonat-basert løsning (f.eks Minimum Essential Medium, MEM) til 37 ° C ved å plassere i kulturen inkubator for mer enn 60 min.
    2. For farging basert på spontan synaptisk aktivitet, forberede flekker løsning 3 ved å legge til FM fargestoff til MEM. For farging basert på miniature synaptisk aktivitet, forberede farging løsning 4 ved tilsetning av TTX til farvestoffoppløsningen tre.
    3. Flekk nevroner ved å overføre et dekkglass med dyrkede nerveceller fra kulturmediet til farging løsning 3 eller 4, og forlater dem i den samme farvestoffoppløsningen ved 37 ° C i 10 min.
    4. Skyll dekk kort i skylling løsning en.
    5. Overfør dekk å skylle løsning en i et bildebehandlings kammer. Husk følgende. 1) Cellene bør ikke utsettes for luft, om nødvendig, overfører dekk direkte til avbildningskammeret uten skylling. 2) Neurons kan farges ved romtemperatur ved å erstatte farvebehandlingsoppløsning, 3 eller 4 med en HEPES-løsning. 3) Neurons kan farges for fremkalt synaptisk aktivitet i sammenheng med høyt-K +-løsning ved hjelp av denne fremgangsmåte, ved å erstatte farvebehandlingsoppløsning, 3 eller 4 med farvestoffoppløsningen 2 og utfører de resterende trinn ved romtemperatur.
    6. Vask farging blandingen ut av avbildningskammer som beskrevet i kapittel 2.1.7.

Tre. Vasking ut FM Dye

  1. Etter neuronal farging og initiell vasking av en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne metoder (avsnitt 2.1.7), fortsetter å perfuse avbildnings kammer med renseoppløsningen en 5-10 min ved romtemperatur. Dette vil fjerne FM fargestoff fra plasmamembranen, og ekstracellulær løsning. I tilfelle av avbildningkammeret, er badekaret perfusjon frekvensen 600-1,200 mL / min. Vasking kan også gjennomføres i fravær av ekstracellulær Ca 2 + for å undertrykke FM fargestoff tap på grunn av synaptiske aktiviteten 17. De vasker kan bli styrket ved påføring av et kort Advasep-7, en modifisert cyklodekstrin som fungerer som en scavenger av FM-fargestoffer fra plasmamembranen 29-31. Det er viktig å holde en hvilken som helst Advasep-7 eksponering kort (for eksempel 5 sekunder i tilfellet med monolayer kultur) for å unngå både å redusere intensiteten av FM puncta 31 og går på bekostning av den health av cellene. Fluorescensen fra FM1-43 i plasmamembranen kan også undertrykkes ved en anvendelse av en quencher sulforhodamine 101 (50-100 uM), som ikke går inn synaptiske vesikler 32.

4. Søker etter en optimal bilde Feltet under vask

  1. Kontroller at cellene i feltet for å bli fotografert er sunt, bruker overføres lysmikroskopi med en høy forstørrelse og høy numerisk blenderåpning objektiv (f.eks 40X). Fra denne delen, fortsetter vi å bruke en omvendt mikroskop (Eclipse Ti, Nikon) utstyrt med fase kontrast eller kontrast optikk differensial forstyrrelser. Dette mikroskopet er også utstyrt med Perfect Focus System (PFS) som muliggjør kontinuerlig, sanntidsfokuskorrigering, som overvinner mikroskopet fokus drift. Denne funksjonen er viktig for time-lapse bildebehandling under avfarging med samme fokus flyet.
  2. Kontroller at fargingen var effektivt, ved hjelp av fluorescens-optikk. Avoid aggregater av FM puncta med mindre de er gjenstand for forskning, fordi enkelte boutons vil være vanskelig å skjelne. Ta hensyn til former av FM puncta: hvis de fleste av de fargede boutons vises som strenger av sirkulære perler, kunne de representerer usunn nerveterminaler. Minimere eksponering av nevronene i sterk fluorescens-eksitasjon for å unngå fotobleking.

5. Lossing FM Dye fra synaptiske vesikler (avfarging)

  1. Avfarging på grunn av synaptiske aktivitet fremkalt av elektrisk felt stimulering.
    1. Vask TTX ut ved perfusjon neuronene i stor utstrekning med en skylleløsning 2 (samme som Renseoppløsning 1, men uten TTX). Bekrefte effektiviteten av TTX utvasking i egne eksperimenter, med de samme vaskeparametre (perfusjon rente og varighet), eksempelvis ved fluorescerende Ca 2 + avbildning av cytoplasmatiske Ca 2 + transienter indusert av felt stimulering, eller ved patch-clamp registrering av voltaldersavhengige Na + strømmene.
    2. Begynn bildebehandling FM fargestoffer. For bildebehandling FM1-43 eller FM4-64, bruker 520 nm eller 650 nm lang pasning emisjonsfiltre, henholdsvis, og en 490 nm eksitasjon filter. Acquire bilder hver 1-2 sek, ved hjelp av en kort eksponeringstid (f.eks 10-20 millisekunder), svak eksitasjon intensitet (f.eks 5-10% av LED-effekt), og høy følsomhet (for eksempel med EM gain). Reduser fotobleking av FM-fargestoffer ved å redusere eksponeringstiden og intensiteten av fluorescens-eksitasjon. Minimer mikroskopet fokus drift ved å slå på den perfekte Focus System.
    3. Stimulere nevroner i skylling løsning 2, ved hjelp av felt-stimulering (f.eks ved 10 Hz for 120 sek) 20.
    4. Påfør flere runder med stimulering, med mellomliggende hvileperioder 1-2 min, til å utarme alle resirkulering synaptiske vesikler av FM fargestoff. Dette er viktig for å vurdere størrelsen på total resirkulering pool av synaptiske vesikler som var farget med FM-fargestoffer i the tidligere tilstand 20,33.
  2. Avfarging på grunn av synaptiske aktiviteter fremkalt i fravær av aksjonspotensialer.
    1. Begynn imaging FM fargestoff.
    2. Påfør stimulerende reagenser oppløst i skylling løsning en eller to. Slike reagenser inkluderer: KCl (høy-K +-løsning, for eksempel 45 mm) 26, ionomycin (en Ca 2 + ionophore som øker intracellulær Ca 2 + konsentrasjon ved at Ca 2 + tilstrømningen inn i cellen fra den ekstracellulære løsning, som brukes f.eks ved 5 mm) 20,34, og sukrose (en hyperton løsning som stimulerer frigjøring av synaptiske vesikler fra lett løsbare basseng, brukt f.eks på 500 mm) 35,36. Bruk en rask, lokal perfusjon system for en pålitelig tidsmessig kontroll i bruk av reagenser, for eksempel SF-77B system fra av Warner Instruments 37, eller Y-rør system 38-40.
  3. Avfarging på grunn av spontan og miniature synaptiske aktivitet.
    1. For avfarging på grunn av spontan synaptisk aktivitet, vaske ut TTX som ovenfor (avsnitt 5.1.1), ved hjelp av skylling løsning to. Begynn bildebehandling FM fargestoffer mens perfusert nevroner med skylling løsning to. For avfarging på grunn av miniatyr synaptiske aktiviteter, starte bildebehandling FM fargestoffer, mens du fortsetter å perfuse nervecellene med skylling løsning 1 (med TTX).
    2. Etter avfarging basert på enten spontan eller miniatyr aktivitet, identifisere de funksjonelle nerveterminaler ved avfarging via fremkalt synaptiske aktivitet. Aktiviteten kan bli fremkalt ved en hvilken som helst av prosedyrene beskrevet ovenfor. Denne identifikasjonsprosessen er nødvendig fordi de fargede strukturer kan være andre enn de funksjonelle nerveterminaler (f.eks langsomt gjenvinning endosomer eller astrocytic vesikler) og en stor mengde av avfarging av fremkalt aktivitet hjelpemidler i denne prosessen.

6. Vurdere fotobleking Valuta FM Fargestoffer

  1. Flekk nerveterminaler med aldehyd-fikses FM fargestoff (f.eks FM1-43FX, FM4-64FX). Dette kan gjøres ved hjelp av fremkalt, spontane eller miniatyr-fargemetoden som er beskrevet ovenfor, og ved å erstatte FM fargestoff med et løsbart FM fargestoff.
  2. Skyll den fikses FM fargestoff som beskrevet i kapittel 2.1.7.
  3. Kjemisk feste nervecellene, ved å overføre dekkglass til fikserløsningen: 4% paraformaldehyd og 4% sukrose i Tyrode løsning i 30 min ved 4 ° C. Fluorescens-intensiteten i den løsbart FM fargestoffet blir beholdt etter kjemisk fiksering.
  4. Vask den fiksativ i 10 min i Tyrode oppløsning, ved å overføre dekkglass i frisk Tyrode løsning to ganger.
  5. Overfør dekk til frisk Tyrode løsning i bildekammeret.
  6. Begynn bildebehandling fikses FM fargestoff bruker samme sett av imaging parametere som for live nevroner. Det er viktig å skylle bildekammeret svært godt etter å ha brukt noen kjemisk faste prøven, fordieventuelle gjenværende bindemiddel kan påvirke etterfølgende levende celler avbildnings eksperimenter utført i det samme kammer. Alternativt til den faste celle avbildning, kan de fargede levende celler avbildes for vurdering av fotobleking hastighet. Imidlertid er det verdt å huske på at det er vanskelig å blokkere miniatyr synaptisk aktivitet akutt, for eksempel kan frekvensen av miniatyr-aktivitet bli redusert til ~ 50% ved å fjerne den ekstracellulære Ca 2 + 23, men det er ikke en fullstendig blokade.
  7. Ved slutten av hver avbildning sesjon, skaffe et bakgrunnsbilde for å vurdere den absolutte verdi av FM-fluorescensintensitet. Intensiteten av FM puncta representerer ikke bare den egentlige signal fra FM-fargestoffer i nerveterminaler, men også den bakgrunnsstøy fra 1) gliaceller som ligger til grunn for neuronal monokultur, 2) dekkglass og optiske komponenter (f.eks objektiv, filtre og speil), og 3) til detektoren (EMCCD kamera). Bakgrunnsstøy er assessed i nonstained regioner fotografert feltet. Når slike områder er begrenset på plass eller heterogent i intensitet, erstatte det med et bilde med kameraets lukker lukket og skaffe støy fra detektoren, selv om det ikke er en ideell metode. Erverve ca 10 bildene med de samme bildeparametere.

7. Bildeanalyse

  1. Importer de innsamlede dataene i bildeanalyse programvare som en stabel av tidsseriebilder. Vi bruker ImageJ (WS Rasband, NIH) og de ​​tilhørende plug-ins, f.eks bildestabilisator plug-in (Kang Li) for å korrigere en liten grad av bevegelse blant FM puncta, og Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) for å analysere tidsserien.
  2. Beregn endringene i FM intensitet i starten og slutten av serien (ΔFM). For dette formål, gjennomsnittlig bildene før starten av avfarging og etter utløpet av avfarging (f.eks 5-bilderammer hver), og generere en forskjell bilde ved å subtrahereg dem.
  3. Identifiser de potensielt funksjonelle nerveterminalene ved å bruke en intensitetsterskel til forskjellen bildet, og detektere piksler som har intensiteter er høyere enn terskelen. En metode for å sette terskelen er å velge standardavviket av bakgrunnen intensitet innhentet fra bart dekkområdet.
  4. Identifiser de isolerte, funksjonelle nerveterminaler som de sammenhengende piksler som ble oppdaget og som tilfredsstiller en størrelseskriteriet (minimal og maksimal antall piksler i contiguity). Denne prosessen eliminerer bakgrunnsstøy og aggregerte nerveterminaler fra analyse.
  5. Tildele regioner-of-interesse (Rois) på de oppdagede pixel klynger (med enkelte klynger tilsvarende individuelle nerveterminaler). Den totale endringen i intensitet under avfarging (ΔFM) er en vanlig parameter for analyse. Dette representerer den akkumulerte fremkalt, spontan eller miniatyr synaptiske aktivitet. Ekskluder ROIs hvis de viser noen av følgendeendringer i intensitet avhengig av formålene med eksperimenter: en økning i løpet av innspillingen, en plutselig nedgang før stimulering, eller en lang ventetid etter stimulering.
  6. Vurdere frekvensen av fotobleking ved å importere de oppkjøpte tidsseriedata inn i bildeanalyse programvare. Gjennomsnittlig bakgrunnsbilder (f.eks med en lukket lukkeren), og trekke det fra de enkelte bildene. Tildele ROIs til FM puncta at putatively tilsvarer nerveterminaler, og måle endringer i ROI intensitet over tid.

Solutions

  1. Tyrode løsning
    • Sammensetning (i mM): 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 30 glukose, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Farging løsning 1
    • Tyrode løsning pluss FM fargestoff.
    • Denne løsning anvendes for farging, basert på fremkalt synaptisk aktivitet ved elektrisk stimulering.
    • Tilsett antagonister av AMPA reseptorer og NMDA reseptorrs om nødvendig.
  3. Farging løsning 2
    • Høy-K + Tyrode løsning pluss FM fargestoff.
    • Denne modifiserte Tyrode oppløsning fremstilles ved å øke KCl-konsentrasjon til 45 mM, med ekvimolar substitusjon av KCl for NaCl.
    • Denne løsning anvendes for farging, basert på fremkalt synaptisk aktivitet ved kontinuerlig depolarisering.
    • Tilsett antagonister av AMPA-reseptorer og NMDA-reseptorer om nødvendig.
  4. Farging løsning 3
    • MEM løsning pluss FM fargestoff.
    • Denne løsning anvendes for farging, basert på spontan synaptisk aktivitet.
  5. Farging løsning 4
    • MEM løsning pluss FM fargestoff og TTX.
    • Denne løsning anvendes for farging, basert på miniatyr-synaptisk aktivitet.
  6. Skylling løsning 1
    • Tyrode løsning pluss antagonister av AMPA reseptorer og NMDA reseptorer, og TTX.
  7. Skylling løsning 2
    • Tyrode oppløsning pluss antagonister av AMPA-reseptorer og NMDA-reseptorer, men uten TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et eksempel kan vi vise representative resultater for avfarging tidsforløpet av synaptiske vesikler (Fig. 4). Dyrkede hippocampus-neuroner ble farget med FM4-64 ved hjelp av den spontane synaptisk aktivitet (trinn 2.3) og vasket med fargestoff-fri løsning (Renseoppløsning 2). Den avbildning viser den innledende avfarging tidsforløpet ved hjelp av spontan aktivitet (trinn 5.3) (første del av kontinuerlig linje, figur 4A). Dette blir etterfulgt av avfarging tidsforløpet ved hjelp av tre runder med fremkalt aktivitet med 10 Hz feltstimulering på 120 sek hver (trinn 5.1). En måte å måle mengden av fremkalt avfarging er illustrert med en dobbelt ende pil (ΔFM fremkalt) som svarer til størrelsen av den totale gjenvinning pool av vesikler.

Før den første stimulus ble gitt, var det en gradvis reduksjon i FM-intensitet (forstørret i figur 4B). Denne reduksjonen var sammensatt av avfargingpå grunn av spontan synaptiske aktivitet (ΔFM Spont) og fotobleking (ΔFM PB). Når bidraget av fotobleking er liten, kan det hende at endring fra grunnlinje preimaging (ΔFM Spont + ΔFM PB) benyttes som en approksimasjon til avfarging mengden av spontan aktivitet.

Figur 1
Figur 1. Strukturer av FM-fargestoffer. A. FM fargestoffer deler noen felles strukturelle trekk. De hydrofile grupper være i vandig oppløsning, og de hydrofobe haler tillate FM-fargestoffer som kan deles inn i membranen. FM2-10, FM1-43 og FM1-84 viser grønn utslipp, mens FM5-95 og FM4-64 viser rød-forskjøvet utslipp. B. Stereoview av FM1-43, den mest brukte FM fargestoff. Hydrofil gruppe vender opp og hydrofobe halene vender nedover. N Alleogen atomer er farget blå. For et annet syn på FM1-43, se Schote og Seelig 63.

Fig. 2
Figur 2. Basis-ordningen av FM fargestoff bruk. Etter påføring til neuroner, er FM fargestoffet innføres i plasmamembranen blir lysrør (grønt), mens det i den vandige oppløsning er mye mindre fluorescerende (grå). En synaptisk vesikkel (SV) er lastet (beiset) av FM fargestoff, når det gjennomgår endocytose, typisk etter eksocytose. Vasking ut FM fargestoff i ekstracellulært løsning gjør bare de fargede vesikler å være fluoriserende. Deretter er en synaptisk vesikkel losset (avfarves) når det gjennomgår eksocytose og derfor frigjør FM fargestoff. Et bilde under illustrerer et eksemplar farging av dyrkede hippocampus nevroner med FM1-43 (en overlapping av fluorescens og fase bilder kontrast). Det er verdt å merke at i protokollen beskrevet i denne artikkelen, de fluorescerende puncta representerer presynaptiske nerveterminaler (diameter ~ 1 mikrometer i typiske sentrale nevroner) med klynger av farget synaptiske vesikler, ikke de enkelte synaptiske vesikler (diameter ~ 40 nm). For enkelhet, representerer denne ordningen et generelt bilde av exo-endocytose av synaptiske vesikler. Det kan omfatte flere former for exo-endocytose, som for eksempel full kollaps fusjon fulgt av clathrin endocytose, forbigående Kiss-and-run exo-endocytose, og bulk endocytose 64. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Tre typer synaptiske aktiviteter studert av FM bildebehandling. Fremkalt synaptiske aktivitet krever typisk eksterne, elektriske stimuli. Spontan synaptisk aktivitet forekommer i fravær av elektriske stimuli. Miniatyr synaptiske aktivitet oppstår spontant uten elektrisk stimuli og uten aksjonspotensialer: vanligvis handlingen potensielle generasjon er undertrykt av en blokkering av spenningsavhengige Na + kanal, tetrodotoxin. Andre aktiviteter inkluderer evoked aktivitet når eksocytose er stimulert av høy-K +-løsning (kontinuerlig depolarisering), ionomycin (kontinuerlig økning i cytoplasma Ca 2 + konsentrasjon), og hyperton løsning som inneholder sukrose (fremlokkende eksocytose av vesikler i den lett løsbare bassenget), som alle vil ikke kreve aksjonspotensial avfyring for synaptiske vesikler å gjennomgå exocytose. Legg merke til at i noen studier, er den spontane aktivitet i vid forstand for å omfatte miniatyr-aktivitet i tillegg.

igure 4 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4 Representative resultat av avfarging.. A. Cultured hippocampus-neuroner ble farget ved spontan aktivitet med 2,5 uM FM4-64 i 10 min ved 37 ° C (trinn 2.3), og vasket (protokoll 3). Nevronene ble fotografert under avfarging med spontan aktivitet (trinn 5.3), og tre runder med fremkalt aktiviteter (trinn 5,1) (kontinuerlig kurve, gjennomsnitt av n = 25 nerveterminaler). Vertikale stolper representerer SEM. Y-aksen representerer den absolutte FM intensiteten og "0" representerer intensiteten når en kameralukker er lukket. Den totale mengden av evoked avfarging indikeres (ΔFM fremkalt). B. Et utvidet syn på innledende fase av avfarging i panel A (kontinuerlig kurve, SEM barer utelatt for klarhet). Under en 60 sek observasjon, anholde var hovedsakelig på grunn av spontan handlingivity (ΔFM Spont), men var delvis på grunn av fotobleking (ΔFM PB). Den fotobleking tiden løpet av FM4-64 (tykk stiplet kurve) ble fastsatt i en egen eksperiment av tenkelig fikses FM4-64 (Protokoll 6). Hastigheten var 2-3% i løpet av 2 min (en enkelt eksponentiell funksjon med en tidskonstant på 5,736 sek, bestemt ved kurvetilpasning over 9 min) 19. Den fotobleking kurve ble tegnet som en eksponentiell funksjon med en første verdi som tilsvarer den målte intensiteten til FM4-64. Se utfyllende Figur S5 i Kakazu et al. 19 for fotobleking over lengre tid (9 min), og med variable eksitasjon intensitet og eksponeringstid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet protokoller for farging og avfarging synaptiske vesikler som reaksjon på fremkalt, spontan og miniatyr-synaptisk aktivitet, og for avbildning under avfarging fase. I tillegg til de eksisterende protokoller, har vi inkludert en ny protokoll for å observere FM avfarging basert på miniatyr synaptiske aktivitet. Ved hjelp av disse protokollene, vi tidligere identifisert avvik i dyrkede nerveceller fra en mus modell av bevegelse lidelse dystoni. I forhold til sine kolleger i villtype mus, gjennomgikk disse nevronene akselerert synaptisk vesikkel eksocytose i en Ca 2 +-avhengig måte når stimulert av høy aktivitet 20. Disse nervecellene viste også hyppigere miniatyr synaptisk aktivitet, noe som bekreftes av patch-clamp elektrofysiologiske opptak av neurotransmitterfrigivning 19.

Den kritiske aspektet av protokollen for å bruke FM-fargestoffer i slike analyser er å Assess og minimere fotobleking. Subtile forandringer i FM fluorescensintensitet kan bli pålitelig vurderes hvis endringene skyldes fotobleking er små i forhold til de som utløses av synaptisk aktivitet. Redusert fotobleking har også mulighet for å undertrykke eller eliminere cytotoksisitet. Fotobleking kan reduseres ved å minimalisere eksponeringen av fluoroforer til eksitasjon lys, og det finnes i det minste to komponenter i utstyr for å gjøre dette på leve-avbildnings eksperimenter. En viktig komponent er en følsom detektor for fotoner, f.eks en EMCCD kamera. Dette gjør det mulig å redusere varigheten og intensiteten av eksponering uten negativt å påvirke påvisningen av fluorescensemisjonen. En tilknyttet komponent er lyskilden system som begrenser eksponeringen av prøven til eksitasjon lys bare når detektoren får bilder. Dette er enkelt å oppnå ved en LED lys 41 som åpner for effektiv kontroll av tidspunktet for lyseksponering (ON / OFF tAKES mye mindre enn 1 msek). Eksponeringen kan utløses kun under bildetagning, ved digital utgang fra kameraet (f.eks "Fire" terminal i Andor kamera). Ytterligere fordeler ved bruk av LED er: evnen til å kontrollere lysintensitet uten bruk av nøytrale tetthetsfilter, langvarig stabilitet av lysintensiteten, samt fravær av mekaniske vibrasjoner som ville forstyrre nøyaktig håndtering av glass pipetter som i patch-clamp-opptak .

Generelt er strukturelt forskjellige fargestoffer photobleach med forskjellige hastigheter under samme avbildningsbetingelser. Det ville således være ideelt for å evaluere graden av fotobleking av fluoroforen som brukes i et spesielt eksperiment. For FM-fargestoffer i friske nerveterminaler, er det teknisk vanskelig å vurdere den fotobleking hastighet uavhengig av synaptisk aktivitet, på grunn av spontan eller miniatyr synaptisk aktivitet. En reduksjon i fluorescensintensitet under slike activity kan være på grunn av den biologiske tap av FM-fargestoffer (exocytose), fotobleking av FM-fargestoffer, eller begge deler. Heldigvis er strukturer av de låses FM-fargestoffer som er utformet for å være nesten identisk med de av de nonfixable FM-fargestoffer. I protokollen beskrevet her, ble låses FM fargestoffer lastet inn i synaptiske vesikler av de samme metodene som nonfixable FM fargestoffer, mens den synaptiske aktivitet ble blokkert etterpå ved kjemisk fiksering av prøven. Spesielt, var hastigheten av fotobleking målt ved hjelp av dette systemet så lite som 2-3% i løpet av 2 min når de bildedannende betingelser var de samme som for levende celler avbildning 19..

FM-fargestoffer som kan brukes sammen med forskjellige protokoller for å utforske forskjellige aspekter av synaptisk vesikkel resirkulering. Ulike synaptiske aktiviteter under farging og avfarging kan kombineres på ulike måter, avhengig av de eksperimentelle mål og spesifikke trekk ved synaptisk vesikkel resirkulering å bli vurdert. Utvalget av antagonists avhenger også av formålet med forsøkene. Videre kan FM avbildning utføres under fargingsfasen, så vel som i løpet av avfarging fase 9,18,42. Det bør også tas i betraktning, kan imidlertid at FM fargestoffer ha uventede effekter, for eksempel blokkerer muskarine acetylkolinreseptorer 43, og gjennomtrengende mechanotransducer kanalene 44, butikk-opererte Ca 2 + kanaler 45, og ATP reseptorer 46. Høye konsentrasjoner av FM-fargestoffer kan potensielt modifisere effektiviteten til synaptisk vesikkel exocytose i seg selv 47. Dermed vi anbefaler forsiktighet i utformingen av eksperimenter og tolke resultatene om synaptisk vesikkel resirkulering. Komplementære metoder for å vurdere vil inkludere opptak i synaptiske vesikler av antistoffer som epitoper er intra-lumenal domener av vesikkel proteiner 22,48. De inkluderer også uttrykker pH-sensitive GFP varianter rettet mot vesikel lumen 49-51, og opptakpH-sensitive antistoff konjugater 52-54 begge som oppdager de intra-vesikulær pH-endringer som følger exo-endocytose.

Når slike uønskede effekter er utelatt, FM fargestoffer har brede programmer. For eksempel kan de brukes til å ta opp om de samme synaptiske vesikel bassenger deles for spontan og fremkalt vesikkel utgivelser 17,55, i hvilken grad effektiviteten av synaptisk vesikkel resirkulering kan reguleres 56,57, og hvilke effekter gjør en tidligere tilstand (hvile eller stimulert) øve på senere tilstand av resirkulering vesikkel basert på, f.eks spontan og miniatyr synaptisk aktivitet. FM fargestoffer kan også brukes til å evaluere synaptisk vesikkel resirkulering på ultrastructural nivå, ved å korrelere observasjoner fra lys-og elektronmikroskopi av FM photoconversion metoden 30,58-62. FM fargestoff kan brukes for samtidig å overvåke synaptiske funksjoner og intracellulær Ca 2 + consentra fem. I tillegg til merking av synaptiske vesikler, FM-fargestoffer og andre fluid-fase fluorescerende markører slik som fluorescerende dekstran 7 kan brukes til å overvåke masse endocytose som er utløst av intens neuronal aktivitet. I konklusjonen, anvendelser av FM fargestoffer gir en uvurderlig kilde til informasjon om synaptisk vesikkel resirkulering og ytterligere synaptiske funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker medlemmene av Harata lab for nyttige diskusjoner gjennom hele gjennomføringen av dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra American Heart Association, Dystoni Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr Foundation, National Science Foundation, og Whitehall Foundation til NCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Neuroscience presynaptiske terminaler synaptiske vesikler Mikroskopi biologisk analyse Nervous System endocytose eksocytose fluorescens bildebehandling FM fargestoff nevron photobleaching
Undersøkelse av Synaptic Vesikkel Recycling Bruke FM Fargestoffer Under fremkalt, spontan, og miniatyr Synaptic Aktiviteter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter