Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Undersökning av synaptiska vesikler återvinning Använda FM Färgämnen Under Evoked, Spontan, och miniatyr Synaptic aktiviteter

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

Vi beskriver användningen av styryl FM-färgämnen för att bilden synaptiska vesikler återvinning i funktionella nervterminaler. Detta protokoll kan användas inte bara för att framkallas, men även spontana och miniatyr synaptiska aktiviteter. Protokollet expanderar sorten av synaptiska händelser som effektivt kan utvärderas.

Abstract

Synaptic blåsor i funktionella nervterminaler genomgår exocytos och endocytos. Denna synaptiska vesikler återvinning kan vara ett effektivt sätt analyseras med styryl FM-färgämnen, som avslöjar membran omsättning. Konventionella protokoll för användning av FM-färgämnen har utformats för att analysera nervceller efter stimulerad (framkallade) synaptisk aktivitet. Nyligen har protokoll blivit tillgängliga för analys av FM-signaler som följer svagare synaptiska aktiviteter, såsom spontana eller miniatyr synaptiska händelser. Analys av dessa små förändringar i FM-signaler kräver att avbildningssystemet är tillräckligt känsliga för att detektera små förändringar i intensitet, men ändå att artefaktförändringar stor amplitud undertrycks. Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att framkallas, spontan, och miniatyr synaptiska aktiviteter, och använda odlade hippocampus nervceller som exempel. Protokollet innehåller också ett medel för att bedöma graden av fotoblekning av FM-färgämnen, eftersom detta är en viktigkälla till artefakter vid avbildande av små förändringar i intensitet.

Introduction

Funktionaliteten av synaptiska vesiklar är en viktig bestämmande faktor av synaptisk transmission. Dessa blåsor frigör signalsubstanser när de smälter samman med det presynaptiska plasmamembranet (exocytos), och de blir redo för en annan cykel för övergång efter att regenereras från plasmamembranet (endocytos) och lastas med signalsubstans. Forskning om dynamik och mekanismerna bakom synaptiska vesikler återvinning har kraftigt påskyndas genom införandet av styryl FM-färgämnen 1. Dessa amfipatiska molekyler, vilket positivt har laddade hydrofila huvudgrupperna och hydrofoba svansar (flera färgämnen i figur 1 A, stereo av FM1-43 i Figur 1B), kan reversibelt in och ut lipidmembran utan genomsyrar dem. Grupper av FM-färgämnen har liknande egenskaper som påverkar utbudet av ljuset att de släpper ut. Till exempel, FM2-10, FM1-43, och FM1-84 har en dubbelbindning mellan två cykliska föreningar och show grön emission. Skillnaden mellan dem är längden av den hydrofoba svansen, som bestämmer dess hydrofobicitet och därför hastigheten för utträde från membranet (departitioning). I fallen av FM5-95 och FM4-64, tre dubbelbindningar länka de cykliska föreningarna, och de visar röd emission. Dessa färgämnen skiljer sig åt med avseende på deras hydrofila delar. I alla FM-färgämnen, ökar fluorescensintensiteten när de förs in i biologiska membran, beroende på en ökning i kvantutbyte i den hydrofoba miljön i förhållande till den hydrofila miljön. Således förändringarna i FM intensitet representerar de förändringar i membran omsättning. De olika färgerna (emissionsspektra) och hydrofobiciteter gör FM-färgämnen ett mångsidigt forskningsverktyg i synaptiska vesikler återvinning.

Baserat på dessa funktioner är FM-färgämnen används främst enligt följande schema vid analys av synaptiska vesikler återvinning (Figur 2). Neurons badar i en extracellulär lösning innehållande FM färgämne, så att det kan tas upp in i synaptiska vesiklar (SVS), som de bildar via endocytos (missfärgning). Färgen tvättas sedan ut genom att applicera en färgfritt cellulära lösning, vilket avslöjar de funktionella nervterminaler, dvs endast de som aktivt genomgår endocytos kommer att innehålla ett kluster av synaptiska vesiklar som är laddade med färgämnet (Figur 2 botten). Efterföljande exocytos leder till förlust av den FM-färgämne till det extracellulära utrymmet och en åtföljande förlust av fluorescens (avfärgning, på grund av både departitioning till en hydrofil miljö och diffusion iväg från stället för exocytos). Förändringarna i FM-fluorescensintensiteten är därför indikatorer på synaptiska vesikler exo-och endocytos.

FM-färgämnen har använts för att färga och Avfärga synaptiska blåsor i olika organismer och preparat 2,3. Exempel innefattar däggdjurs neuronal kulturer 4-9, däggdjur hjärnan skivor 10,11, neuromuskulära korsningar 12,13, retinal bipolära nervceller 14,15, och hårcellerna i snäckan 16.

Vanligtvis i sådana experiment, är både färgning och avfärgning utlöses av utför stimulera nervceller (framkallat aktivitet). Nyligen dock synaptiska vesikler återvinning som svar på svag stimulering har också analyserats, liksom återvinning i frånvaro av en yttre stimulans (spontan och miniatyr synaptisk aktivitet) 9,17-19. Spontana och miniatyr synaptiska verksamhet definieras som de som förekommer i frånvaro av yttre stimuli, med den förra involverar spontan bränning av aktionspotentialer (Figur 3). Dessa svaga synaptiska aktiviteter är förknippade med mindre förändringar i FM-signaler än de som utlöstes av omfattande stimulering. Mätningen kräver att förändringarna i FM fluorescerrens intensitet avspeglar exakt synaptiska vesikler exocytosis eller endocytos men inte artefaktuella förändringar i intensitet. En orsak till att artefakten är förekomsten av icke-specifik färgning av plasmamembranet genom FM-färgämnen. Gradvis uttvättning av denna komponent kommer att leda till en gradvis förändring i den uppmätta fluorescensintensiteten, som kommer att felaktigt skrivas synaptiska aktiviteter. Denna faktor kan minskas genom lämpliga metoder (se protokoll). Den mest anmärkningsvärda orsaken till artefakten är fotoblekning av FM färgämne kvar i synaptiska vesiklar. Fotoblekning relaterade förändringar i FM-intensitet måste vara små i jämförelse med de biologiska (synaptic) förändringar som mäts. Den senaste utvecklingen av känsliga kameror, t ex elektron multiplicera laddningskopplad anordning (EMCCD) kamera, gör det möjligt att minimera fotoblekning genom att korta exponeringstid och försvagar intensiteten hos det ljus som används för att excitera fluoroforen. En annan orsak till artefakten är en drift in fokuseringsnivå ljusmikroskop. Fokus Avvikelsen under en avbildning session kan orsakas av mekaniska eller termiska effekter och kommer felaktigt att leda till en förändring av den uppmätta fluorescensintensiteten.

Här beskriver vi protokoll och utrustning som gör det möjligt att använda FM-färgämnen för att analysera synaptiska vesikler återvinning även i samband med svag eller ingen stimulans, i synnerhet den miniatyr synaptiska aktiviteten. Vi visar exempel på färgning och avfärgning av blåsor under framkallade och spontana synaptiska händelser, med hjälp av odlade gnagare hippocampus neuroner, och avbilda avfärgning fasen. Vi visar också hur man ska utvärdera graden av FM färgämne fotoblekning, i avsaknad av FM färgämne förlust på grund av synaptiska aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Primär kultur av nervceller från däggdjurshjärnan

Alla djurförsök som utförs i denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Iowa.

  1. Förbered dissocierade cellkultur av CA3-CA1 regionerna av hippocampus från möss eller råttor efter födelsen dagar 0-1 19,20. Plate de hippocampus celler på 12-mm täckglas (tjocklek nummer 0) förinställas med råttan gliaceller feeder lager, i 24-brunnar, och med en täthet av 12.000 celler / brunn.
  2. Culture de hippocampala neuroner under minst 8 dagar vid funktionella nervterminaler för att utveckla 21. Vi använder nervceller på 11-14 dagar in vitro då enskilda nervterminaler är relativt isolerade utan mycket klustring. Neuroner kan användas för experiment upp till omkring 21 till 28 dagar in vitro, t.ex. Willig et al. 22 och Nosyreva och Kavalali 23.
  3. Förfunktionella studier, bedöma täckglas (före färgning) för indikatorer på friska nervceller med hjälp av genomlysning mikroskopi (t.ex. faskontrast optik vid en förstoring av 10-20X). Indikatorerna för god hälsa är: ett enhetligt gliacellsmarkörer lager, en tydlig cell marginal kring nervceller, utökade dendriter utan pärlstav strukturer, brist på klustrade somata, och en brist av sampaketerade neuriter.

2. Laddning av Synaptic Blåsor med FM-Dye (Färgning)

  1. Färgning på grund av synaptisk aktivitet framkallas av elektriska fältet stimulering (gäller aktionspotentialer)
    1. Förbered färglösningen 1 genom tillsats av den FM färgämne till en HEPES baserade färgämnesfria lösningen, t ex Tyrodes lösning (se LÖSNINGAR för detaljer). Koncentrationen av FM färgämnet är 10 mikroM FM1-43 och 2,5 uM FM4-64. Typiska koncentrationsområden är: 2-15 mikroM FM1-43, eller från 2,5 till 20 ^ M FM4-64 3,6. För experiment som kräver suppression av återkommandeglutamaterg synaptisk aktivitet och induktion av synaptisk plasticitet, ytterligare lägga antagonister jonotropa glutamatreceptorer: AMPA receptorer (t.ex. 10 ^ M CNQX) och NMDA-receptorer (t.ex. 50 ^ M AP5).
    2. Överför ett täckglas med celler från odlingsmediet till avbildningskammaren förfylld med vanlig Tyrodes lösning. Vi använder en avbildning kammare med stimuleringselektroder kopplade till sidoväggarna (platinatrådar separerade med 6,3 mm, RC-21BRFS). Denna kammare är utformad som en sluten avbildning kammare, men vi använder det som en öppen kammare (det vill säga utan en övre täckglas), med ett bad volym ~ 200 pl. Under överföringen inte utsätta de odlade cellerna för luft, och inte klämmer de odlade cellerna med pincett (plocka täck upp från omkretsen i stället nära centrum).
    3. BEGJUTA avbildning kammare med vanligt Tyrodes lösning vid rumstemperatur (23-25 ​​° C).
    4. Applicera färgning lösning 1 av samtidignstant perfusion.
    5. Mana synaptisk aktivitet genom applicering av elektriska pulser. För maximal färgning av den totala återvinningen pool av synaptiska vesiklar i hippocampus nervceller, stimulerar kulturerna vid 10 Hz för 60-120 sek 24. När man försöker att uppnå maximal effektivitet i fältstimulering, hålla flera funktioner i åtanke. 1) Höjden hos badlösningen bör vara så låg som möjligt, samtidigt som de nervceller och stimulerande elektroder helt nedsänkta i ett tunt skikt av Tyrodes lösning (i syfte att hålla de neuroner vid liv och för att erhålla ett homogent elektriskt fält). 2) Aktuell intensitet och varaktighet bör optimeras med hjälp av en indikator på neuronal retbarhet, t.ex. lysrörs Ca 2 + avbildning, i vårt fall, en konstant ström av 30 mA intensitet och 1 ms varaktighet ger tillförlitliga resultat. 3) Den badlösningen bör appliceras vid konstant flöde under stimulering, den elektriska stimuleringen leder till elektrolys, vilket leder protoner (H (t.ex. Hanks balanserade saltlösning med fenolrött).
    6. Låt nervceller i färglösningen 1 för ytterligare 60 sek efter fältstimulering upphör, så att efterstimulans endocytos kommer att avslutas den 25.
    7. Tvätta färglösningen ut ur avbildningskammaren genom perfusion av den med sköljlösning 1, ett färgämne fritt Tyrodes lösning plus antagonister för AMPA-receptorer och NMDA-receptorer (se avsnitt 2.1.1), och en blockerare av spänningsberoende Na +-kanaler ( t.ex. 0,5-1 mikroM tetrodotoxin, TTX). Kombinationen av blockerare kommer att undertrycka förlusten av FM färgämne genom spontan synaptisk aktivitet. För att maximera den tvätteffekt, ökar perfusionshastighet (<em> till exempel upp till 5-6 ml / min) i 1-2 minuter, och tillsätt en bolus (t.ex. 1 ml) av sköljlösning 1 direkt till den öppna avbildning kammaren manuellt, med hjälp av en pipett. Styr styrkan och riktningen av den manuella infusion, för att inte störa de odlade neuroner.
  2. Färgning på grund av synaptisk aktivitet framkallas av hög K +-lösning (inte innebär aktionspotentialer).
    1. Bered färgning lösning 2 genom att lägga till FM färgämnet till hög-K + Tyrodes lösning. Specifikt förbereda en modifierad Tyrodes lösning med 45 mM KCl, genom ekvimolär substitution av KCl för NaCl. Om det behövs, tillsätt antagonister till AMPA och NMDA-receptorer. Denna high-K +-lösning kommer att depolarisera nervceller kontinuerligt aktiverar Ca2 + inflöde in i nervändar, och initiera synaptiska vesikler exocytosis den maximala omfattning 26. Högre koncentrationer (70 till 90 mM) användes även i andra rapporter som 27 ett exempel Klingauf et al.d Richards et al. 28
    2. Överför ett täckglas med odlade neuroner från odlingsmediet till avbildningskammaren förfylld med vanlig Tyrodes lösning.
    3. Färga neuroner vid rumstemperatur under 1-2 min genom att applicera färgningslösning 2 vid konstant perfusion eller användning av en pipett 26,28. I det senare fallet bör den slutliga färgämneskoncentrationen styras genom tillsats av en känd volym av färglösningen 2 till en känd volym av färgämnesfria lösningen.
    4. Tvätta färglösningen ur avbildning kammaren, som beskrivs i avsnitt 2.1.7.
  3. Färgning på grund av spontan och miniatyr synaptisk aktivitet.
    1. Förvärm bikarbonat-baserad lösning (t.ex. Minimum Essential medium, MEM) till 37 ° C genom att placera i kulturen inkubator för mer än 60 minuter.
    2. För färgning baserad på spontan synaptisk aktivitet, förbereda färgning lösning 3 genom att lägga till FM färgämnet till MEM. För färgning baserad på miniature synaptisk aktivitet, förbereda färgning lösning 4 genom att lägga till TTX till färglösningen 3.
    3. Fläck nervceller genom att överföra ett täckglas med odlade nervceller från odlingsmedium för färgning lösning 3 eller 4, och lämnar dem i samma färglösningen vid 37 ° C i 10 min.
    4. Skölj täck kort i sköljlösning 1.
    5. Överför täckglas till sköljlösning 1 i en avbildning kammare. Tänk på följande. 1) Celler bör inte utsättas för luft, vid behov överföra täckglas direkt till avbildning kammaren utan sköljning. 2) Neuroner kan färgas vid rumstemperatur genom att byta ut färglösningen 3 eller 4 med en HEPES-baserad lösning. 3) Nervceller kan färgas för framkallade synaptisk aktivitet i samband med hög K +-lösning med den här metoden, genom att ersätta färglösningen 3 eller 4 med färgningslösning 2 och genomförandet av de återstående stegen i rumstemperatur.
    6. Tvätta färglösningen ut ur det bildgivandekammare som beskrivs i avsnitt 2.1.7.

3. Skölja FM Dye

  1. Efter neuronal färgning och initial tvättning av någon av de ovan beskrivna metoder (avsnitt 2.1.7), fortsätter att BEGJUTA avbildning kammare med sköljlösning 1 i 5-10 min vid rumstemperatur. Detta tar bort den FM färgämnet från plasmamembranet och den extracellulära lösningen. I fallet med vår avbildning kammare är badet perfusionshastighet 600-1,200 ul / min. Tvättning kan också genomföras i frånvaro av extracellulär Ca 2 + för att undertrycka FM färgämnesförlust beroende på synaptiska aktiviteter 17. Tvättarna kan förbättras genom en kort applicering av ADVASEP-7, ett modifierat cyklodextrin som tjänar som ett elimineringsmedel av FM-färgämnen från plasmamembranet 29-31. Det är viktigt att hålla någon ADVASEP-7 exponering kort (t.ex. 5 sekunder i fallet med monokultur) för att undvika att både minska intensiteten i FM puncta 31 och äventyra health av cellerna. Den fluorescens från FM1-43 i plasmamembranet kan också undertryckas genom en tillämpning av ett utsläckande sulforhodamine 101 (50-100 mikroM) som inte kommer in synaptiska vesiklar 32.

4. Söka efter en optimal bildfält under tvätt

  1. Kontrollera att cellerna i området som ska avbildas är friska, genomfallande ljusmikroskop med en hög förstoring och hög numerisk bländare objektiv (t.ex. 40X). Från detta avsnitt fortsätter vi att använda ett inverterat mikroskop (Eclipse Ti, Nikon) utrustad med fas kontrast eller differential interferens kontrast optik. Detta mikroskop är också utrustad med perfekt fokus System (PFS) som möjliggör kontinuerlig, realtidsfokuskorrigering, som övervinner mikroskopet fokusglidning. Den här funktionen är nödvändigt för time-lapse avbildning under avfärgning med samma fokuseringsplanet.
  2. Kontrollera att färgningen var effektivt, med hjälp av fluorescensoptik. Avoida aggregat av FM puncta om de inte är föremål för forskning, eftersom enskilda boutons blir svåra att urskilja. Var uppmärksam på formen på FM puncta: om de flesta av de färgade boutons visas som strängar av runda kulor, kunde de representerar ohälsosamma nervterminaler. Minimera exponeringen av nervceller till stark fluorescens excitation för att undvika fotoblekning.

5. Lossning FM Dye från Synaptic Blåsor (Avfärgning)

  1. Avfärgning grund av synaptisk aktivitet framkallad av elektrisk fältstimulering.
    1. Tvätta TTX ut genom perfusion nervceller mycket med en sköljlösning 2 (samma som sköljlösning 1 men utan TTX). Bekräfta effektivitet TTX washout i separata experiment, med samma tvättparametrar (perfusion ränta och varaktighet), t.ex. genom fluorescerande Ca 2 + avbildning av cytoplasmiska Ca 2 + transienter inducerade av fältstimulering, eller av patch-clamp inspelning av voltåldersberoende Na +-strömmar.
    2. Starta avbildning FM-färgämnen. För avbildning FM1-43 eller FM4-64, använder 520 nm eller 650 nm lång passning emissionsfilter, respektive och en 490 nm excitation filter. Förvärva bilder varje 1-2 sek, med hjälp av en kort exponeringstid (t.ex. 10-20 msek), svag excitation intensitet (t.ex. 5-10% av LED-effekt), och hög känslighet (t.ex. med EM vinst). Minimera fotoblekning av FM-färgämnen genom att minska exponeringstiden och intensiteten av fluorescens excitation. Minimera mikroskopets fokus drift genom att slå på den perfekta Focus System.
    3. Stimulera nervceller i sköljlösning 2, med hjälp av fältstimulering (t.ex. vid 10 Hz för 120 sek) 20.
    4. Applicera flera omgångar av stimulering, med mellanliggande viloperioder av 1-2 min, för att tömma alla de återvinnings synaptiska blåsor i FM färgämne. Detta är viktigt vid bedömning av storleken på total återvinning pool av synaptiska vesikler som färgades med FM-färgämnen i the förhandstillstånd 20,33.
  2. Avfärgning grund av synaptiska verksamhet framkallade i avsaknad av aktionspotentialer.
    1. Börja avbildning FM färgämne.
    2. Tillämpa stimulerande reagenser lösta i sköljlösning 1 eller 2. Sådana reagens innefattar: KCl (hög K + lösning, t ex 45 mM) 26, jonomycin (en Ca 2 +-jonofor som höjer den intracellulära Ca2 +-koncentrationen genom att tillåta Ca2 +-inflöde in i cellen från det extracellulära lösningen, som används t.ex. vid 5 ^ M) 20,34 och sackaros (en hypertonisk lösning som stimulerar frisättningen av synaptiska vesiklar från lätt frigörbar pool, användas t ex vid 500 mM) 35,36. Använd en snabb, lokal perfusion systemet för en tillförlitlig tidskontroll i tillämpningen av de reagenser, t.ex. SF-77B-systemet från Warner Instruments 37, eller Y-rörssystem 38-40.
  3. Avfärgning på grund av spontan och miniature synaptisk aktivitet.
    1. För avfärgning på grund av spontan synaptisk aktivitet, skölj TTX som ovan (avsnitt 5.1.1), med hjälp av sköljlösning 2. Starta avbildning FM-färgämnen medan perfusion nervceller med sköljlösning 2. För avfärgning grund miniatyr synaptiska aktiviteter, börja avbildning FM-färgämnen, samtidigt som man fortsätter att BEGJUTA nervceller med sköljlösning 1 (med TTX).
    2. Efter avfärgning baseras antingen spontant eller miniatyr verksamhet, identifiera de funktionella nervterminaler genom avfärgning via framkallade synaptisk aktivitet. Aktivitet kan framkallas av någon av de ovan beskrivna förfarandena. Denna identifieringsprocess är nödvändig eftersom de färgade strukturerna kan vara de andra än de funktionella nervterminaler (t.ex. långsamt återvinning endosomer eller astrocytiska vesikler) samt en stor mängd avfärgning av den framkallade aktivitets stöd i denna process.

6. Bedöma Fotoblekning Rate FM Färgämnen

  1. Färga nervterminaler med aldehyd-fastställbara FM färgämne (t.ex. FM1-43FX, FM4-64FX). Detta kan göras med hjälp av den framkallade, spontana eller miniatyr färgningsmetod som beskrivits ovan och genom att ersätta FM färgämne med en fixerbar FM färgämne.
  2. Tvätta ur fixable FM färgämne som beskrivs i avsnitt 2.1.7.
  3. Kemiskt fixa nervceller genom att överföra täckglas till fixeringslösningen: 4% paraformaldehyd och 4% sackaros i Tyrodes lösning under 30 min vid 4 ° C. Fluorescensintensiteten hos fixerbar FM färgämnet kommer att bevaras efter kemisk fixering.
  4. Tvätta ur fixeringsmedel under 10 min i Tyrodes lösning, genom att överföra täckglas till färsk Tyrodes lösning två gånger.
  5. Överför täckglas till frisk Tyrodes lösning i avbildning kammaren.
  6. Starta avbildning fixable FM färgämne med samma uppsättning av avbildningsparametrar som för levande nervceller. Det är viktigt att skölja avbildning kammaren mycket väl efter att ha använt något kemiskt fasta exemplar, eftersomeventuellt kvar fixativ kan påverka efterföljande live-cell imaging experiment som genomförs i samma kammare. Som alternativ till den fasta cell imaging, kan de färgade levande celler avbildas för bedömning av fotoblekning ränta. Det är dock värt att hålla i minnet att det är svårt att blockera miniatyr synaptisk aktivitet acutely; till exempel, kan frekvensen för miniatyr aktivitet reduceras till ~ 50% genom avlägsnande av extracellulär Ca 2 + 23, men det är inte en fullständig blockaden.
  7. Vid slutet av varje bildsession, förvärva en bakgrundsbild för att bedöma det absoluta värdet av den FM-fluorescensintensitet. Intensiteten i FM puncta utgör inte bara den sanna signalen från FM-färgämnen i nervändar, men också bakgrundsljud från 1) gliaceller som ligger bakom den neuronala monokultur, 2) täckglas och optiska komponenter (t.ex. objektiv, filter och speglar), och 3) detektorn (EMCCD kamera). Bakgrundsljud är Assessed i nonstained regioner av det bildförsedda området. När sådana regioner är begränsade i rymden eller heterogen i intensitet, ersätta den med en bild med kameraslutaren stängd och förvärva buller från detektorn, även om den inte är en idealisk metod. Förvärva cirka 10 bilder med samma avbildningsparametrar.

7. Bildanalys

  1. Importera de förvärvade data i bild-analysprogram som en stapel av tidsseriebilder. Vi använder ImageJ (WS Rasband, NIH) och tillhörande insticksprogram, till exempel bildstabilisator plug-in (Kang Li) för att korrigera en liten grad av rörelse bland FM puncta, och tidsserie Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) för att analysera tidsserien.
  2. Beräkna de förändringar i FM-intensitet vid början och slutet av serien (ΔFM). För detta ändamål skall det genomsnittliga bilderna innan avfärgning och efter slutet av avfärgning (t.ex. 5 bildrutor vardera), och genererar en skillnad bild genom subtracting dem.
  3. Identifiera de potentiellt funktionella nervterminaler genom att tillämpa en intensitetströskel skillnaden bilden, och upptäcka pixlar vars intensitet är högre än tröskeln. Ett förfarande för inställning av tröskelvärdet är att välja standardavvikelsen för bakgrundsintensiteten erhålls från den nakna täckområdet.
  4. Identifiera de isolerade, funktionella nervändar som de intilliggande pixlar som upptäcktes och som uppfyller ett storlekskriterium (Minimala och maximala antalet bildpunkter i omedelbar närhet). Denna process eliminerar bakgrundsljud och aggregerade nervändar från analys.
  5. Tilldela regioner av intresse (ROI) på de detekterade pixelkluster (med individuella kluster motsvarande enskilda nervterminaler). Den totala förändringen i intensitet under avfärgning (ΔFM) är en typisk parameter för analys. Detta motsvarar det sammanlagda beloppet av framkallad, spontan eller miniatyr synaptisk aktivitet. Uteslut ROI om de uppvisar någon av följandeförändringar i intensitet beroende på tillämpning av experiment: en ökning under inspelning, en plötslig minskning före stimulering, eller en lång latens efter stimulering.
  6. Bedöm graden av fotoblekning genom att importera den förvärvade tidsseriedata in i bilden-analysprogram. Medelvärdet bakgrundsbilder (t.ex. med en stängd slutare), och subtrahera den från de enskilda bilderna. Tilldela ROI på FM puncta som förment motsvarar nervterminaler, och mäta förändringar i ROI intensitet över tiden.

Lösningar

  1. Tyrodes lösning
    • Sammansättning (i mM): 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 glukos, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Färgningslösning 1
    • Tyrodes lösning plus FM färgämne.
    • Denna lösning används för färgning, baserat på framkallade synaptisk aktivitet genom elektrisk stimulering.
    • Lägg de antagonister till AMPA receptorer och NMDA receptors om nödvändigt.
  3. Färgning lösning 2
    • High-K + Tyrodes lösning plus FM färgämne.
    • Denna modifierade Tyrodes lösning framställes genom ökning av KCl-koncentrationen till 45 mM, med ekvimolär ersättning av KCl för NaCl.
    • Denna lösning används för färgning, baserat på framkallade synaptisk aktivitet genom kontinuerlig depolarisation.
    • Lägg till de antagonister till AMPA-receptorer och NMDA-receptorer vid behov.
  4. Färgning lösning 3
    • MEM-lösning plus FM färgämne.
    • Denna lösning används för färgning, baserat på spontan synaptisk aktivitet.
  5. Färgning lösning 4
    • MEM-lösning plus FM färgämne och TTX.
    • Denna lösning används för färgning, baserat på miniatyr synaptisk aktivitet.
  6. Sköljning lösning 1
    • Tyrodes lösning plus antagonister till AMPA-receptorer och NMDA-receptorer, och TTX.
  7. Sköljning lösning 2
    • Tyrodes lösning plus antagonister till AMPA-receptorer och NMDA-receptorer, men utan TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som ett exempel visar vi representativa resultat för avfärgning tidsförloppet av synaptiska vesikler (Figur 4). Odlade hippocampusneuroner färgades med FM4-64 med användning av den spontana synaptisk aktivitet (steg 2,3) och tvättades med färgämnesfria lösningen (sköljning lösning 2). Avbildningen visar den initiala avfärgning tidsförloppet med hjälp av spontan aktivitet (steg 5,3) (första delen av kontinuerlig linje, figur 4A). Detta följs av avfärgning tidsförloppet använder tre omgångar av framkallad aktivitet med 10 Hz fältstimulering för 120 sekunder vardera (steg 5.1). Ett sätt att mäta mängden framkallade avfärgning illustreras med en dubbeländade pilen (ΔFM Evoked) som motsvarar storleken på total återvinning pool av blåsor.

Före den första stimulus gavs, var det en gradvis minskning i FM-intensitet (förstorad i figur 4B). Denna minskning bestod av avfärgningpå grund av spontan synaptisk aktivitet (ΔFM Spont) och fotoblekning (ΔFM PB). När bidraget från fotoblekning är liten, kan förändringen från preimaging baslinjen (ΔFM Spont + ΔFM PB) användas som en approximation för avfärgning mängden spontan aktivitet.

Figur 1
Figur 1. Konstruktioner av FM-färgämnen. A. FM färgämnen delar vissa gemensamma strukturella drag. De hydrofila grupperna stanna i vattenlösning och de hydrofoba svansarna låta FM-färgämnen för att delas upp i membranet. FM2-10, FM1-43 och FM1-84 show grön emission, medan FM5-95 och FM4-64 show rödskiftade emissions. B. Stereo av FM1-43, är det mest använda FM-färgämne. Hydrofila gruppen är vänd uppåt och hydrofoba svansar är vända nedåt. NitrOgen atomer är blåfärgad. För en annan bild av FM1-43, se Schote och Seelig 63.

Figur 2
Figur 2. Grundsystem av FM färgämne användning. Efter applicering på neuroner, FM färgämne införas i plasmamembranet blir fluorescerande (grön), medan det i den vattenhaltiga lösningen är mycket mindre fluorescerande (grå). En synaptiska vesikler (SV) är laddad (färgade) av FM färgämnet, när det genomgår endocytos, vanligtvis efter exocytos. Skölja FM färgämnet i cellulära lösning gör bara de färgade blåsor vara fluorescerande. Därefter en synaptiska vesikler lossas (avfärgning) när den genomgår exocytos och därför släpper FM färgämne. En bild nedan visar en exemplar färgning av odlade hippocampus nervceller med FM1-43 (en överlagring av fluorescens-och fas kontrast). Det är att notera att i det protokoll som beskrivs i detta dokument, de fluorescerande puncta representerar presynaptiska nervterminaler (diameter ~ 1 mikrometer i typiska centrala neuroner) med kluster av färgade synaptiska vesikler, inte de enskilda synaptiska vesiklar (diameter ~ 40 nm). För enkelhetens skull, är detta system en allmän uppfattning om exo-endocytos av synaptiska vesikler. Det kan innehålla flera former av exo-endocytos, såsom full-kollaps fusion följt av clathrin medierad endocytos, övergående kiss-and-run exo-endocytos, och huvuddelen endocytos 64. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3. Tre typer av synaptiska verksamheter studeras av FM-avbildning. Framkallade synaptisk aktivitet kräver vanligen yttre, elektriska stimuli. Spontan synaptisk aktivitet sker i frånvaro av elektriska stimuli. Miniatyr synaptisk aktivitet sker spontant utan elektriska stimuli och utan aktionspotentialer: vanligtvis aktionspotential generationen undertrycks av en blockerare av spänningsberoende Na +-kanal, tetrodotoxin. Ytterligare verksamhet omfattar framkallade aktivitet när exocytos stimuleras av hög K +-lösning (kontinuerlig depolarisation), jonomycin (kontinuerlig ökning av cytoplasma Ca 2 + koncentrationen), och hyperton lösning innehåller sackaros (framkalla exocytos av vesiklar i lätt frigörbara poolen), alla kommer inte att kräva aktionspotential bränning för synaptiska vesiklar att genomgå exocytos. Observera att det i vissa studier, är den spontana aktiviteten brett definierad att omfatta miniatyr aktivitet också.

igure 4 "fo: innehåll-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Representativa resultat av avfärgning. A. Odlade hippocampusneuroner färgades genom spontan aktivitet med 2,5 pM FM4-64 under 10 min vid 37 ° C (steg 2,3) och tvättades (protokoll 3). Nervceller avbildades under avfärgning med spontan aktivitet (steg 5,3), och tre rundor av framkallade aktiviteter (steg 5,1) (kontinuerlig kurva, genomsnitt av n = 25 nerv terminaler). Vertikala staplar representerar SEM. Y-axeln representerar den absoluta FM intensitet och "0" representerar intensiteten när en kameraslutaren är stängd. Den totala mängden framkallade avfärgning indikeras (ΔFM Evoked). B. En utökad syn på inledande fasen av avfärgning i panel A (kontinuerlig kurva, SEM barer utelämnats för tydlighet). Under en 60 sek observation, den kvarhållande var främst på grund av spontan handlingivity (ΔFM Spont) men var delvis på grund av att fotoblekning (ΔFM PB). Den fotoblekning tidsförloppet av FM4-64 (tjock streckad kurva) bestämdes i ett separat experiment genom avbildning fixable FM4-64 (protokoll 6). Hastigheten var 2-3% under 2 min (en enda exponentiell funktion med en tidskonstant av 5736 sekund, bestämdes genom kurvanpassning över 9 min) 19. Den fotoblekning kurva ritades som en exponentiell funktion med ett initialvärde som motsvarar den uppmätta intensiteten av FM4-64. Se kompletterande figur S5 i Kakazu et al. 19 för fotoblekning under längre period (9 min), och med varierande excitation intensitet och exponeringstid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit protokoll för färgning och avfärgning synaptiska vesikler som svar på frammanat, spontan och miniatyr synaptisk aktivitet, och för avbildning under avfärgning fasen. Förutom de befintliga protokoll, har vi inkluderat ett nytt protokoll för att observera FM avfärgning utifrån miniatyr synaptisk aktivitet. Med hjälp av dessa protokoll, vi tidigare identifierat avvikelser i odlade nervceller från en musmodell av rörelsestörning dystoni. I jämförelse med sina motsvarigheter i vildtyp möss, genomgick dessa nervceller accelererade synaptiska vesikler exocytos i en Ca2 +-beroende sätt när de stimuleras av hög aktivitet 20. Dessa nervceller visade också oftare miniatyr synaptisk aktivitet, vilket bekräftas av patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar av neurotransmittorfrisättning 19.

Den kritiska aspekten av protokoll för att använda FM-färgämnen i sådana analyser är att Assess och minimera fotoblekning. Subtila förändringar i FM-fluorescensintensitet kan bedömas på ett tillförlitligt sätt om de förändringar som orsakas av fotoblekning är små i jämförelse med de som utlöses av synaptisk aktivitet. Minskad fotoblekning har också potential att undertrycka eller eliminera cytotoxicitet. Fotoblekning kan minskas genom att minimera exponeringen av fluoroforer för excitationsljus, och det finns åtminstone två komponenter i utrustning för att göra detta i levande imaging experiment. En viktig komponent är en känslig detektor av fotoner, t.ex. en EMCCD kamera. Detta gör det möjligt att minimera varaktigheten och intensiteten av exponeringen utan att negativt påverka detekteringen av fluorescensemission. En tillhörande komponent är ljuskällan system som begränsar exponeringen av provet till excitation ljus endast när detektorn förvärvar bilder. Detta kan lätt uppnås genom att en LED-ljus 41 som möjliggör effektiv kontroll av timingen av ljusexponering (ON / OFF takes mycket mindre än 1 ms). Exponeringen kan utlösas endast när du tar bilder, med digital utgång från kameran (t.ex. "Fire" terminal i Andor kamera). Ytterligare fördelar med att använda LED är förmågan att styra ljusintensiteten utan att använda neutrala täthetsfilter, långtidsstabilitet av ljusintensiteten, och frånvaron av mekaniska vibrationer som skulle störa exakt hantering av glaspipetter som i patch-clamp inspelning .

I allmänhet strukturellt olika färgämnen photobleach i olika takt under samma avbildningsbetingelser. Det skulle alltså vara perfekt för att bedöma omfattningen av fotoblekning av fluoroforen som används i ett visst experiment. För FM-färgämnen i levande nervterminaler, är det tekniskt utmanande att bedöma fotoblekning hastigheten oberoende av synaptisk aktivitet, på grund av spontan eller miniatyr synaptisk aktivitet. En minskning i fluorescensintensitet vid sådan Verksamhety kan bero på den biologiska förlust av FM-färgämnen (exocytos), fotoblekning av FM-färgämnen, eller båda. Lyckligtvis är strukturerna hos ställbara FM-färgämnen utformade för att vara nästan identiska med de hos nonfixable FM färgämnen. I det protokoll som beskrivs här, var ställbara FM-färgämnen laddas i synaptiska vesikler med samma metoder som nonfixable FM-färgämnen, medan den synaptiska aktiviteten blockerades därefter genom kemisk fixering av provet. Noterbart är att graden av fotoblekning mäts med detta system var så lite som 2-3% under 2 min, när avbildningsförhållandena var desamma som de som gäller för live-cell imaging 19.

FM-färgämnen kan användas med olika protokoll för att undersöka olika aspekter av synaptisk vesikel återvinning. Olika synaptiska aktiviteter under färgning och avfärgning kan kombineras på olika sätt, beroende på de experimentella syften och särdrag synaptiska vesikler återvinning som ska bedömas. Valet av antagonists beror också på syftet med experimenten. Dessutom kan FM-avbildning utföras under färgningsfasen samt under avfärgning fasen 9,18,42. Man bör också komma ihåg, kan dock att FM-färgämnen har oväntade effekter, såsom att blockera de muskarinacetylkolinreceptorer 43, och genomsyrar de mechanotransducer kanalerna 44, butiksdrivna Ca 2 +-kanaler 45, och ATP receptorer 46. Höga koncentrationer av FM-färgämnen kan eventuellt ändra effektiviteten av synaptiska vesikler exocytosis själv 47. Således rekommenderar vi försiktighet vid planeringen av försöken och tolka resultaten angående synaptiska vesikler återvinning. Kompletterande metoder för att tänka kommer att omfatta upptag i synaptiska vesikler av antikroppar vars epitoper är intra-lumenal domäner av vesikler proteiner 22,48. De omfattar också uttrycka pH-känsliga GFP-varianter riktade till vesikler lumen 49-51, och upptagav pH-känsliga konjugerade antikroppar 52-54 båda upptäcker de intra-vesikulär pH-förändringar som åtföljer exo-endocytos.

När sådana oönskade effekter utesluts, FM-färgämnen har breda applikationer. Till exempel kan de användas för att ta itu med om samma synaptiska vesikler pooler delas för spontana och framkallade vesikler släpper 17,55, i vilken utsträckning effektiviteten i synaptiska vesikler återvinning kan regleras 56,57, och vilka effekter gör ett förhandstillstånd (vila eller stimulerad) utövar på den senare tillstånd av vesikler återvinning baserat på t ex spontan och miniatyr synaptisk aktivitet. FM-färgämnen kan också användas för att utvärdera synaptisk vesikel återvinning vid den ultrastrukturella nivån, genom att korrelera observationer från ljus-och elektronmikroskopi genom FM photoconversion metod 30,58-62. FM färgämne kan användas för att samtidigt övervaka synaptiska funktioner och intracellulär Ca2 + concentra 5. Förutom märkning av synaptiska vesikler, FM-färgämnen och andra fluorescerande vätska-fas markörer såsom fluorescerande dextran 7 kan användas för att övervaka bulk endocytos som utlöses av intensiv nervaktivitet. Sammanfattningsvis, tillämpningar av FM-färgämnen ger en ovärderlig källa till information om synaptiska vesikler återvinning och ytterligare synaptiska funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar medlemmarna i Harata labbet för bra diskussioner under hela utförandet av detta arbete. Detta arbete har finansierats med bidrag från American Heart Association, dystoni Medical Research Foundation, den Edward Mallinckrodt, jr Foundation, National Science Foundation, och Whitehall Foundation till NCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Neurovetenskap presynaptiska terminaler Synaptic Blåsor mikroskopi biologisk analys nervsystemet Endocytosis exocytos fluorescens avbildning FM färgämne neuron fotoblekning
Undersökning av synaptiska vesikler återvinning Använda FM Färgämnen Under Evoked, Spontan, och miniatyr Synaptic aktiviteter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter