Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.

Abstract

Fonksiyonel sinir terminalleri sinaptik kesecikler ekzositoz ve endositoz tabi. Bu sinaptik vezikül geri dönüşüm etkili membran ciro ortaya styryl FM boyalar kullanılarak analiz olabilir. FM boyaların kullanılması için geleneksel protokolleri uyarılmış (uyarılmış) sinaptik etkinliği aşağıdaki nöronlar analiz etmek için tasarlanmıştır. Son zamanlarda, bu tür protokoller spontan veya minyatür sinaptik olaylar gibi zayıf sinaptik faaliyetleri, eşlik FM sinyallerini analiz için kullanılabilir hale gelmiştir. FM sinyalleri, bu küçük değişikliklerin analizi görüntüleme sistemi, yoğunluğu küçük değişiklikler tespit etmek için yeterince duyarlı olan, ancak büyük genlikli bu suni bastırılmış değişiklikler gerektirir. Burada, uyarılmış spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri, ve bir örnek olarak kültürlü hipokampal nöronlar kullanmak için uygulanabilir bir protokol açıklar. Bu, önemli olduğu için bu protokol, aynı zamanda, boyaların FM ışıkla ağartma oranını değerlendirmek için bir araç içeriryoğunluğundaki küçük değişiklikler görüntüleme eserler kaynağıdır.

Introduction

Sinaptik veziküllerin işlevi sinaptik iletim önemli bir belirleyicisidir. Bunların presinaptik plazma zarı (ekzositozu) ile kaynaştırmak zaman bu veziküller nörotransmitter serbest bırakmak ve bunlar plazma zarı (endositoz) rejenere edilmiş ve nörotransmitter ile yeniden sonra serbest bir çevrimi için hazır hale gelir. Dinamikleri ve sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan mekanizmaları içine Araştırma ölçüde Stiril FM boyaların 1 tanıtımı ile birlikte ivme kazanmıştır. Pozitif (Şekil 1A, Şekil 1B FM1-43 StereoView birden boyalar) hidrofilik baş grupları ve hidrofobik kuyrukları ücret bu amfipatik moleküller, tersine çevrilebilir girmek ve onları nüfuz etmeden lipid membranlar çıkabilirsiniz. FM boyaların grupları yaydıkları ışık aralığını etkileyen benzer özellikler taşırlar. Örneğin, FM2-10, FM1-43 ve-84 FM1 iki siklik bileşikler ve sho arasında bir çift bağa sahipw yeşil emisyon. Aralarındaki fark, hidrofob belirler ve bu nedenle zardan çıkış hızı (departitioning), hidrofobik kuyruk uzunluğudur. FM5-95 ve FM4-64 durumlarda, üç çift bağlar siklik bileşikler bağlamak ve onlar kırmızı emisyon göstermektedirler. Bu boyalar, hidrofilik kısmına göre değişir. Vadesi hidrofilik çevreye hidrofobik ortam göreceli olarak kuantum veriminde bir artışa bağlı olarak, biyolojik zarların içine sokulur, tüm FM boyalar olarak, floresan yoğunluğu artar. Böylece FM şiddetindeki değişiklikler membran ciro değişiklikleri temsil eder. Farklı renk (emisyon spektrumları) ve hidrofobluğa FM sinaptik vezikül geri dönüşüm çok yönlü bir araştırma aracı boyar yapmak.

Bu özelliklere bağlı olarak, FM boyalar çok sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz aşağıdaki şema (Şekil 2) uygun olarak kullanılmaktadır. NöronBu endositoz (boyama) yoluyla meydana olarak s sinaptik vesiküller (SVS) içine alınacak etkinleştirme, FM, boyayı ihtiva eden bir hücre dışı çözelti içinde banyo edilir. Daha sonra boya, boya içermeyen hücre dışı çözelti uygulanması ile yıkanır, bu, yani yalnızca aktif geçiren endositoz boya (Şekil 2, alt) ile yüklenir sinaptik veziküllerin bir küme içerir işlevsel sinir terminalleri, ortaya koymaktadır. Sonraki ekzositozu hücre dışı alanı için FM boya kaybı ve floresan bir eşlik eden kaybına neden olur (destaining, nedeniyle bir hidrofilik çevreye departitioning ve uzak ekzositoz sitesinden difüzyon hem de). Bu nedenle FM floresan yoğunluğundaki değişiklikler sinaptik vezikül ekso-ve endositoz göstergeleridir.

FM boyalar, çeşitli organizmalar ve preparatlar 2,3 sinaptik veziküllerin leke ve destain için kullanılmıştır. Örnekler memeli Neur dahilÖnal kültürleri 4-9, memeli beyin dilimleri 10,11, nöromüsküler kavşakları 12,13, retina bipolar nöronlar 14,15 ve kokleanın 16 saç hücreleri.

Genellikle bu tür deneylerde, boyama ve destaining hem yoğun nöron (uyarılmış aktivite) uyararak tetiklenir. Bir dış etmenin etkisi ile (kendiliğinden ve minyatür sinaptik aktivite) 9,17-19 yokluğunda olduğu gibi geri dönüşüm Ancak son zamanlarda, zayıf bir uyarıya yanıt olarak sinaptik vezikül geri dönüşüm aynı zamanda, analiz edilmiştir. Spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri hareket potansiyellerinin kendiliğinden ateş (Şekil 3) içeren önceki ile, dış uyaranların yokluğunda meydana olanlar olarak tanımlanmaktadır. Bu zayıf sinaptik faaliyetleri geniş uyarılmasıyla tetiklenen daha FM sinyalleri olarak daha küçük değişikliklerle ilişkilidir. Ölçüm gerektirir FM fluoresc değişimlerence yoğunluğu doğru sinaptik vezikül eksositosizini veya endositozu ama yoğunluğu yapay olmamasını değişiklikleri yansıtacak. Dışlayıcı bir nedeni FM boyalar ile, plazma zarının spesifik olmayan lekelenme varlığıdır. Bu bileşenin kademeli yıkama hatalı sinaptik faaliyetleri atfedilen edilecek ölçülen floresan yoğunluğunda kademeli bir değişim, yol açacaktır. Bu faktör (Protokolü bakınız) uygun yöntemlerle azaltılabilir. Dışlayıcı en önemli nedeni sinaptik keseler içinde tutulan FM boya photobleaching olduğunu. FM yoğunluğu ışıkla ağartma ilgili değişiklikler ölçülür biyolojik (sinaptik) değişikliklere göre küçük olmalıdır. Hassas kameralarının son gelişmeler, örneğin, elektron-çarparak şarj-kuplajlı aygıt (EMCCD) kamera, mümkün maruz kalma süresini kısaltarak ve fluorofor uyarmak için kullanılan ışığın yoğunluğunu zayıflatarak ışıkla ağartma en aza indirdiği bulunmuştur. Dışlayıcı bir başka nedeni bir sürüklenme in ışık mikroskobu odaklama seviyesi. Bir görüntüleme oturumu sırasında odak kayması mekanik ya da termal etkilere neden olabilir ve hatalı ölçülen floresan yoğunluğunda bir değişikliğe yol açacaktır.

Burada, bu durum özellikle, minyatür sinaptik etkinliği, daha zayıf ya da herhangi bir stimülasyon bağlamında sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz etmek için FM boyaların kullanımı gerekli protokolleri ve donanım tarif etmektedir. Biz kültürlü kemirgen hipokampal nöronlar kullanarak ve destaining faz görüntüleme, uyarılmış ve spontan sinaptik olaylar sırasında veziküllerin boyama ve destaining örneklerini göstermektedir. Biz de sinaptik faaliyetleri herhangi bir FM boya kaybı yokluğunda, FM boya ağartmanın derecesini değerlendirmek nasıl gösterilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Memeli Beyin gelen nöronlar İlköğretim Kültür

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

  1. Doğum sonrası günlerden 0-1 19,20 on CA3-CA1 farelerden alınan hipokampusun bölgeler veya sıçanların ayrışmış hücre kültürü hazırlayın. 24-bölmeli tepsilerde sıçan glial besleyici tabaka ile preseeded 12 mm kapak (kalınlık sayı 0), ve 12,000 hücre / kuyu yoğunluğunda, hipokampal hücreleri Plate.
  2. Kültür işlevsel sinir terminalleri için en az 8 gün boyunca hipokampal nöronlar 21 geliştirmektir. Bireysel sinir terminalleri çok kümelenme olmadan nispeten izole olduğunda in vitro 11-14 gün nöronlar kullanın. Nöronlar örneğin nitro Willig et al. 22 ve Nosyreva Kavalalı ve 23 ile ilgili olarak 21-28 güne kadar deney için kullanılabilir.
  3. Içinfonksiyonel çalışmalar, geçen ışık mikroskobu (10-20X bir büyütmede örneğin, faz kontrast optikler) kullanılarak, sağlıklı nöronların göstergeleri (boyama öncesi) lamelleri değerlendirmek. Iyi sağlık göstergeleri şunlardır: düzgün bir glial hücre tabakası, nöronların etrafında açık bir hücresel marjı, boncuklu yapılar olmaksızın genişletilmiş dendrit, kümelenmiş somata eksikliği ve birlikte neurites eksikliği.

2. FM boya ile sinaptik veziküllerin (boyama) Yükleme

  1. Nedeniyle elektrik alanı stimülasyonu ile uyarılmış sinaptik etkinlik için boyama, (aksiyon potansiyelleri içerir)
    1. HEPES bazlı boya-serbest çözüm FM boya ekleyerek çözüm 1 boyama hazırlayın, örneğin Tyrodes çözümü (ayrıntılar için ÇÖZÜMLER bakınız). FM boya konsantrasyonu, 10 uM FM1-43 ve 2.5 uM FM4-64'tür. Tipik konsantrasyon aralıkları: 2-15 mcM FM1-43, ya da 2.5-20 uM FM4-64 3,6. Tekrarlayan bastırılmasını gerektiren deneyler içinglutamaterjik sinaptik etkinlik ve sinaptik plastisite indüksiyonu, bundan başka iyonotropik glutamat reseptörlerinin antagonistleri ekleyin: AMPA reseptörleri (örneğin, 10 uM CNQX) ve NMDA reseptörleri (örneğin, 50 uM AP5).
    2. Kültür ortamından düz Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş görüntüleme bölmeye hücreleri ile bir lamel aktarın. Bu yan duvarlar (platin tel 6,3 mm, RC-21BRFS ayrılmış olarak) bağlı uyarım elektrodlar ile bir görüntüleme odası kullanın. Bu bölme ~ 200 | il lik bir banyo hacmi ile, kapalı bir görüntüleme odası olarak tasarlanmıştır, ancak (a olmayan, yani üst örtücü) bir açık odası olarak kullanılmasıdır. Aktarım sırasında, havaya kültür hücreleri açığa ve cımbız (merkezine yakın lamel çevresinden up ziyade almak) ile kültür hücreleri sıkışmaması yok.
    3. Oda sıcaklığında (23-25 ​​° C) de düz bir Tyrode çözeltisi ile görüntüleme odası serpmek.
    4. Işbirliği ile çözüm 1 boyama uygulayınnstant perfüzyon.
    5. Elektrik akımı uygulanması ile sinaptik etkinliği uyandırmak. Hipokampal nöronlar sinaptik veziküllerin toplam dönüşüm havuzunun maksimal boyama, 60-120 saniye boyunca 10 24 Hz'deki kültürleri uyarır. Alan stimülasyonu maksimal verimliliğini elde etmek için çalışırken, akılda birkaç özellikleri tutmak. Nöronlar tutmak ve tamamen) canlı nöronlar tutmak ve homojen bir elektrik alanı elde etmek amacıyla Tyrode çözeltisi (ince bir tabaka içine daldırılmış uyarıcı elektrot ise 1) banyo çözeltisinin yüksekliği, mümkün olduğu kadar düşük olması gerekmektedir. 2) Akım yoğunluğu ve süresi, örneğin flüoresan Ca 2 + görüntüleme sinirsel uyarıların bir gösterge kullanılarak optimize edilmelidir; bizim durumumuzda, 30 mA yoğunluğu ve 1 msn süresince sabit bir akım güvenilir sonuçlar verir. 3) banyo çözeltisi uyarılması sırasında sabit bir akışta uygulanmalıdır; elektriksel uyarım protonları neden elektroliz yol açar (H ile, örneğin Hanks dengeli tuz çözeltisi) ihtiva eden bir çözelti ile yüz fazla birkaç darbe geçirilmesiyle ayrı deneyde asitlenmesini edin.
    6. Post-uyarıcı endositoz 25 tamamlanmış olacak, böylece alan stimülasyonu, sonlandırılır sonra ek bir 60 saniye boyunca boyama solüsyonu 1 nöronlar bırakın.
    7. (Durulama çözeltisi 1, bir boya içermeyen Tyrode çözeltisi artı AMPA reseptörleri ve NMDA reseptörleri (bakınız bölüm 2.1.1) antagonistleri ve voltaja bağımlı Na + kanallarının bir bloke edicisi ile perfüze da görüntüleme odasının dışında boyama çözeltisi yıkayın örneğin 0.5-1 mcM tetrodotoxin, TTX). Bloker kombinasyonu spontan sinaptik aktivite ile FM boya kaybını engeller. Yıkama verimliliği maksimize etmek için, perfüzyon oranını (<arttırmakem> örneğin kadar 1-2 dakika ve bir pipet kullanılarak, elle açık görüntüleme odasına doğrudan çözeltisi 1 durulama bir bolus (örneğin, 1 mi) eklemek için) 5-6 ml / dak. Kültürlü nöronlar rahatsız etmemek için, el ile infüzyon gücünü ve yönünü kontrol eder.
  2. Nedeniyle yüksek K + çözeltisi ile uyarılmış sinaptik etkinlik için boyama, (aksiyon potansiyelleri anlamına gelmez).
    1. Yüksek K + Tyrode çözeltisine FM boya eklenerek çözelti 2 boyama hazırlayın. Özel olarak, NaCl için KCI eşit molar ikamesi ile, 45 mM KCI ile modifiye Tyrode çözeltisi hazırlar. Gerekirse, AMPA ve NMDA reseptörlerinin antagonistleri ekleyin. Bu yüksek-K + çözeltisi sürekli nöronlar depolarize sinir uçlarına Ca 2 + akını sağlamak ve maksimum ölçüde 26 sinaptik vezikül eksositosizini başlatacaktır. Yüksek konsantrasyonlarda (70-90 mM) da örneğin Klingauf vd. 27. Bir diğer raporlarda kullanıland Richards ve ark. 28
    2. Kültür ortamından düz Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş görüntüleme odasına kültürlenmiş nöronlar olan bir lamel aktarın.
    3. Sabit perfüzyon de boyama çözeltisi 2 uygulanması veya bir pipet 26,28 kullanılarak 1-2 dakika boyunca, oda sıcaklığında nöronları Leke. Bu durumda, nihai konsantrasyon boya boya içermeyen çözelti bilinen bir hacme boyama çözeltisi 2, bilinen bir hacmi eklenerek kontrol edilmelidir.
    4. Bölüm 2.1.7 'de tarif edildiği gibi, görüntüleme odasının dışında boyama çözeltisi yıkayın.
  3. Spontan ve minyatür sinaptik bir aktiviteye bağlı boyanarak.
    1. Birden fazla 60 dakika boyunca kültürü inkübatörü içinde yerleştirilerek 37 ° C'ye ön ısıtılması bikarbonat tabanlı bir çözüm (ör: Minimum Essential Medium, MEM).
    2. Spontan sinaptik etkinliği göre boyama için, MEM, FM boya eklenerek boyama çözelti 3 hazırlanır. Boyama için m göresinaptik etkinliği iniature, boyama çözeltisi 3 TTX eklenerek boyama çözeltisi 4 hazırlar.
    3. Çözeltisi 3 veya 4 boyanmadan kültür ortamından kültürlenmiş nöronlar bir lamel aktarılması, ve 10 dakika boyunca 37 ° C 'de, aynı boyama çözeltisi içinde bırakılarak Leke nöronlar.
    4. Çözüm 1 durulama kısaca lamel durulayın.
    5. Bir görüntüleme odası içinde çözelti 1 durulama için lamel aktarın. Akılda aşağıdaki tutun. 1) Hücreler, havaya maruz olmamalıdır, gerekirse durulama olmadan görüntüleme odasına doğrudan lamel aktarın. 2) Nöronlar, bir HEPES tabanlı bir çözeltisi ile boyama çözeltisi 3 ya da 4 değiştirerek oda sıcaklığında boyanmış olabilir. 3) Nöronlar boyama solüsyonu ile 2 boyama çözeltisi 3 veya 4 yerine ve oda sıcaklığında kalan adımları gerçekleştirilmesi ile, bu yöntem kullanılarak, yüksek K + çözeltisi bağlamında uyarılmış sinaptik etkinliği için boyanmış olabilir.
    6. Görüntüleme dışarı boyama çözüm yıkayınbölüm 2.1.7 açıklandığı odası gibi.

3. FM Boya yıkanmasından

  1. Yukarıda tarif edilen yöntemler (bölüm 2.1.7) herhangi biri ile nöronal lekeleme ve ilk yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca durulama çözeltisi 1 ile görüntüleme odası serpmek devam etmektedir. Bu, plazma membran ve hücre dışı çözeltiden FM boya kaldırır. Bizim görüntüleme odasının durumunda, banyo perfüzyon oranı 600-1,200 | il / dk 'dır. Yıkama nedeniyle de sinaptik faaliyetleri 17 FM boya kaybını engellemek için hücre dışı Ca2 + yokluğunda gerçekleştirilebilir. Yıkamalar Advasep-7, plazma zarı 29-31 FM boyaların bir toplayıcı olarak hizmet eden bir tadil edilmiş siklodekstrin kısa bir uygulama ile geliştirilebilir. Her iki FM puncta 31 yoğunluğunu azaltmak ve hea ödün vermemek için (tek tabaka kültür durumunda, örneğin 5 saniye) bir Advasep-7 maruz kısa tutmak için çok önemlidirHücrelerin LTH. Plazma membranında FM1-43 gelen ışıklı da sinaptik veziküllerin 32 girmediği bir söndürücü sülforodamin 101 (50-100 uM) bir uygulama ile baskı altına alınabilir.

4. Yıkama sırasında bir Optimal Image Field aranıyor

  1. Yansıması için alanında hücreler yüksek büyütmeli ve yüksek sayısal diyafram objektif lens (örneğin 40X) ile iletilen ışık mikroskobu kullanılarak, sağlıklı olduğundan emin olun. Bu bölümde, biz faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop (Eclipse Ti, Nikon) kullanmaya devam. Bu mikroskop da mikroskop odak kayması üstesinden sürekli, gerçek-zamanlı odaklama düzeltme, sağlar Mükemmel Odak Sistemi (PFS) ile donatılmıştır. Bu özellik, aynı odaklama düzlemi ile lekenin sırasında time-lapse görüntüleme için esastır.
  2. Bu boyama floresan optik kullanarak etkili oldu doğrulayın. AvFM punktumlarda oid agrega bireysel boutons ayırt etmek zor olacak, çünkü onlar, araştırma hedef sürece. FM punktumlarda şekillere dikkat edin: lekeli boutons çoğu yuvarlak boncuk dizeleri gibi görünür, onlar sağlıksız sinir terminallerini temsil edebilir. Photobleaching önlemek için güçlü bir floresan uyarım için, nöronların maruz kalmamasını sağlayın.

5. Synaptic Keseciklerinde FM Boya boşaltma (destaining)

  1. Elektrik alanı stimülasyonu ile uyarılmış sinaptik bir aktiviteye bağlı lekenin.
    1. Yıkama TTX (çözüm 1 durulama gibi ama ttx olmadan aynı) bir çalkalama solüsyonu 2 ile yoğun nöronlar perfüze tarafından. Alan uyanimasıyla sitoplazmik Ca 2 + Transientlerin + görüntüleme veya volt yama-kelepçe kayıtları ile floresan Ca 2 örneğin aynı yıkama parametrelerini (perfüzyon oranı ve süresi), kullanarak, ayrı ayrı deneylerde TTX arınma etkinliğini onaylamakyaşa bağımlı Na + akımları.
    2. FM boyalar görüntüleme başlatın. FM1-43 veya FM4-64 görüntüleme için, 520 nm veya 650 nm uzun geçiş emisyon filtreleri, sırasıyla ve 490 nm eksitasyon filtresi kullanın. Kısa maruz kalma süresi (örneğin 10-20 msn), zayıf uyarım yoğunluğunu (örneğin LED gücün% 5-10), ve yüksek duyarlılık (örneğin EM kazanç ile) kullanarak, görüntüleri her 1-2 sn edinin. Maruz kalma süresini ve floresans uyarma yoğunluğunu azaltarak FM boyaların photobleaching en aza indirin. Mükemmel Odak Sistemi çevirerek mikroskop odak kaymasını en aza indirmek.
    3. (120 saniye boyunca 10 Hz'de gibi) alan stimülasyonu kullanılarak, 20 çözeltisi 2 durulama nöronları uyarır.
    4. FM boyanın tüm dönüşüm sinaptik veziküller tüketmek, 1-2 dakika müdahale dinlenme dönemleri ile, stimülasyon çok sayıda mermi uygulayın. Th FM boyalarla boyandı sinaptik veziküllerin toplam geri dönüşüm havuzu boyutunu değerlendirirken bu önemlie önce devlet 20,33.
  2. Nedeniyle sinaptik faaliyetleri lekenin aksiyon potansiyellerinin yokluğunda uyarılmış.
    1. FM boya görüntüleme başlatın.
    2. Çözelti 1 veya 2 durulama içinde çözüldü uyarıcı reaktifler uygulanır. Bu reaktifler arasında: Ca 2 + hücre dışı çözeltisinden hücre içine akışı, örneğin, el de izin vererek, hücre içi Ca2 + konsantrasyonu yükseltir (a Ca2 + iyonofor iyonomisin KCl (yüksek K + çözeltisi, örneğin 45 mM) 26, 5 uM) 20,34 ve sükroz (kolayca ayrılabilir havuz, 500 mM'de kullanılan) 35,36 sinaptik veziküllerin salınmasını uyaran bir hipertonik çözelti. Warner Instruments 37, veya Y-boru sisteminden 38-40 den SF-77B sistemi, örneğin, reaktifler uygulayarak güvenilir bir geçici kontrolü için hızlı, yerel bir perfüzyon sistemi kullanın.
  3. Nedeniyle lekenin spontan ve minsinaptik etkinliği iature.
    1. Nedeniyle spontan sinaptik aktivite lekenin için, çözüm 2 durulama kullanılarak, (bölüm 5.1.1) yukarıdaki gibi TTX yıkayın. 2. durulama çözeltisi ile perfüze nöronlar sırasında FM boyalar görüntüleme başlatın. Çözüm 1 (TTX) ile durulama ile nöronlar serpmek devam ederken nedeniyle minyatür sinaptik faaliyetleri lekenin için, FM boyalar görüntüleme başlar.
    2. Spontan veya minyatür ya aktiviteye dayalı lekenin sonra, uyarılmış sinaptik aktivite yoluyla lekenin tarafından fonksiyonel sinir uçları tanımlamak. Etkinlik, yukarıda anlatılan prosedürlerin herhangi biri ile uyarılmış edilebilir. Lekeli yapıların fonksiyonel sinir terminalleri (örneğin yavaş endozomları veya Astrositik veziküller geri dönüşüm) ve bu süreçte uyarılmış aktivite yardımcıları tarafından destaining büyük bir miktarı dışında kalan olabilir, çünkü bu belirleme işlemi gereklidir.

6. FM Boyalarının Photobleaching Oranı değerlendirilmesi

  1. Aldehit-tamir edilebilir FM boya (örneğin FM1-43FX, FM4-64FX) ile sinir terminalleri Leke. Bu, yukarıda tarif edilen uyarılmış spontan ya da minyatür boyama yöntemi kullanılarak yapılır, ve bir tamir edilebilir FM boya FM boya değiştirerek olabilir.
  2. Bölüm 2.1.7 'de anlatıldığı gibi tamir edilebilir FM boya yıkayın.
  3. Kimyasal sabitleştirici çözeltisine lamel aktararak nöronları tamir: 4 ° C'de 30 dakika boyunca Tyrode çözeltisi içinde% 4 paraformaldehid ve% 4 sukroz Tamir edilebilir FM boyanın flüoresan yoğunluğu tespit kimyasal sonra muhafaza edilecektir.
  4. Iki kez, taze Tyrode çözeltisine lamel aktararak, Tyrode çözeltisi içinde 10 dakika için fiksatif yıkayın.
  5. Görüntüleme odasında taze tirod çözeltisi içine lamel aktarın.
  6. Canlı nöronlar gibi görüntüleme parametreleri aynı seti kullanılarak tamir edilebilir FM boya görüntüleme başlayın. Bu, herhangi bir kimyasal olarak sabit bir örneği kullanılarak sonra çok iyi görüntüleme odası durulanması önemlidir, çünküKalan sabitleyici aynı hücre içerisinde gerçekleştirilen sonraki canlı hücre görüntüleme deneyler etkileyebilir. Seçenek olarak ise, sabit hücre görüntüleme için, lekeli canlı hücreler, ışıkla ağartma oranını değerlendirmek için görüntülü olabilir. Ancak, bu akut minyatür sinaptik aktivitesini bloke etmek zor olduğu göz önünde tutarak değer, örneğin, minyatür aktivite sıklığı hücre dışı Ca 2 + 23 çıkararak% 50 ~ indirgenebilir, ama tam değildir abluka.
  7. Her görüntüleme oturumun sonunda, FM floresan yoğunluğu mutlak değerini değerlendirmek için bir arka plan görüntüsü kazanır. FM puncta yoğunluğu sinir terminallerinde FM boyalarından gerçek sinyal, aynı zamanda nöronal tek tabakalı kültürü, 2) lamel ve optik bileşenlerin (örneğin, objektif lens, filtreler ve altında yatan 1) glial hücrelerinden arka plan gürültü sadece temsil eder aynalar), ve 3) dedektör (EMCCD kamera). Arka plan gürültüsü asse olduğunugörüntülü alanın nonstained bölgelerinde bastırılacaktır. Bu tür bölgelerde yoğunluk uzayda veya heterojen sınırlı zaman ideal bir yöntem olmamasına rağmen, kamera deklanşör kapalı bir görüntü ile yerine ve dedektör gürültü kazanır. Aynı görüntüleme parametreleri kullanarak yaklaşık 10 görüntü kazanır.

7. Görüntü Analizi

  1. Zaman serisi görüntüler yığını olarak görüntü analiz yazılımı içine edinilen verileri alın. Biz ImageJ (WS Rasband, NIH) ve ilişkili eklentileri kullanın, örneğin, Görüntü Sabitleyici plug-in (Kang Li) FM puncta arasında hareketinin küçük bir ölçüde düzelterek, ve Zaman Serileri Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) analiz için zaman serisi.
  2. Seriler (ΔFM) başlangıcında ve sonunda FM yoğunluk değişiklikleri hesaplayın. Bu amaçla, lekenin başlamadan önce ve lekenin (örneğin 5 görüntü kareleri her biri) sona ermesinden sonra görüntüleri ortalama ve subtractin bir fark görüntü oluşturmakg onları.
  3. Fark görüntünün bir yoğunluk eşik uygulayarak potansiyel olarak fonksiyonel sinir terminalleri belirlenmesi ve yoğunlukları olan eşik değerinden daha yüksek olan pikselleri algılar. Eşiği ayarı için bir yöntem, çıplak lamel alanından elde edilen arka plan yoğunluğu standart sapmasını seçmektir.
  4. Tespit edilir ve bu bir boyut ölçütü (bitişiklik içinde piksel minimum ve maksimum sayı) tatmin takımından bitişik pikseller olarak izole edilmiş, işlevsel sinir terminalleri belirlenmesi. Bu işlem arka plan gürültü ve analizi toplanan sinir terminalleri ortadan kaldırır.
  5. (Bireysel kümelenmeler bireysel sinir uçlarına karşılık gelen) tespit piksel kümelerinde bölgeleri-faiz (ROI) atayın. (ΔFM) lekenin sırasında yoğunluk olarak toplam değişim analizi tipik bir parametredir. Bu, uyarılmış spontan veya minyatür sinaptik aktivite kümülatif miktarını temsil eder. Onlar Aşağıdakilerden herhangi sergiliyorsa İB'leri dışlamakDeneylerin amaçları bağlı şiddetindeki değişiklikler: Kayıt sırasında bir artış, uyarılmadan önce ani bir düşüş, ya da uyarılmasından sonra uzun bir gecikme.
  6. Görüntü analiz yazılımı içine edinilen zaman serisi verileri alarak ağartmanın oranını değerlendirmek. (Kapalı bir kapak ile örneğin) arka plan görüntüleri ortalama ve bireysel görüntüleri onu çıkarmak. Varsayımsal sinir terminallerine karşılık FM puncta için İB'leri atayın ve zamanla ROI yoğunluğu değişiklikleri ölçmek.

Çözümler

  1. Tyrode çözeltisi
    • (MM olarak) bileşimi: 125 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 glukoz, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7.4.
  2. Boyama çözeltisi 1
    • Tyrode çözeltisi artı FM boya.
    • Bu çözüm, elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış sinaptik etkinliği göre, boyama için kullanılır.
    • AMPA reseptörleri ve NMDA antagonistleri ekleme receptors gerekirse.
  3. Boyama çözeltisi 2
    • Yüksek K + Tyrode çözeltisi artı FM boya.
    • Bu modifiye Tyrode çözeltisi NaCl için KCI eşit mol ikamesi ile, 45 mM KCl konsantrasyonu arttırarak hazırlanmıştır.
    • Bu çözelti, sürekli depolarizasyon uyandırdığı sinaptik etkinliği göre, boyama için kullanılır.
    • Gerekirse, AMPA alıcıları ve NMDA reseptörlerinin antagonistleri ekleyin.
  4. Boyama solüsyon 3
    • MEM çözeltisi artı FM boya.
    • Bu çözelti spontan sinaptik etkinliği göre, boyama için kullanılır.
  5. Boyama çözeltisi 4
    • MEM çözüm artı FM boya ve TTX.
    • Bu çözelti minyatür sinaptik etkinliği göre, boyama için kullanılır.
  6. Çözelti 1 durulama
    • Tyrode çözeltisi artı AMPA reseptörleri ve NMDA reseptörlerinin antagonistleri ve TTX.
  7. Çözeltisi 2 Durulama
    • Tyrode çözeltisi artı AMPA reseptörleri ve NMDA reseptörlerinin antagonistleri, ama TTX olmadan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir örnek olarak, sinaptik veziküllerin destaining zaman süreci (Şekil 4) için temsilci sonuçlar göstermektedir. Kültür hipokampal nöronlar spontan sinaptik etkinliği (adım 2.3) kullanılarak FM4-64 ile boyanmış ve boya içermeyen çözeltisi (çözelti 2 yıkama) ile yıkanmıştır. Görüntüleme spontan aktivite (adım 5.3) (sürekli çizgi ilk parçası, Şekil 4A) kullanılarak başlangıç ​​destaining zaman sürecini gösterir. Bu, yaklaşık 120 saniye boyunca 10 Hz saha uyarısıyla her bir (adım 5.1) ile uyarılmış faaliyet üç tur kullanılarak destaining zaman süresi takip eder. Uyarılmış destaining miktarının ölçülmesi bir yolu veziküllerin toplam geri dönüşüm havuz boyutuna karşılık gelen bir çift uçlu bir ok (ΔFM Uyarılmış) ile görüntülenmiştir.

Ilk uyarıcı verildi önce (Şekil 4B'de büyütülmüş) FM yoğunluğunda kademeli bir düşüş oldu. Bu azalma destaining oluşmuşturnedeniyle kendiliğinden sinaptik bir aktiviteye (ΔFM Spont) ve ışıkla ağartma (ΔFM PB). Işıkla ağartma katkısı küçük olduğunda, preimaging taban (ΔFM Spont + ΔFM PB) arasındaki değişim spontan aktivite destaining miktarda bir yaklaşım olarak kullanılabilmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. FM boyaların yapıları. A. FM paylaşmaktadır bazı ortak yapısal özellikleri boyar. Hidrofilik gruplar, sulu çözelti içinde kalmak ve hidrofobik kuyruklar FM boyalar zarına partisyone izin verir. FM2-10, FM1-43 ve FM1-84 gösteri yeşil emisyon, FM5-95 ve FM4-64 gösteri kırmızı-kaymıştır emisyon ise. FM1-43, en sık kullanılan FM boya B. StereoView. Hidrofilik grup yukarı bakacak ve hidrofobik kuyrukları aşağı bakacak. Nitrogen atomları mavi renklidir. FM1-43 bir başka görünümü için, Schote ve Seelig 63 bkz.

Şekil 2,
Şekil 2. Sulu çözelti içinde olduğu (gri), çok daha az floresan ise FM boya kullanım temel şeması. Nöronlara uygulanmasından sonra, plazma membranı içine sokulur FM boya, florasan (yeşil) olur. Genellikle eksositosizini şu, endositozu uğrar bir sinaptik vezikül (SV), FM boya ile (lekeli) yüklenir. Hücre dışı çözelti içinde FM boyayı dışarı yıkama sadece lekeli veziküller floresan olmasını sağlar. Bu eksositosizini uğrar ve bu nedenle FM boya bıraktığında Daha sonra, bir sinaptik vezikül (beneği) boşaltılır. Bir görüntü aşağıda FM1-43 ile kültür hipokampalinden bir örnek boyanma (floresan, faz kontrast görüntüleri bir bindirme göstermektedir.) Bu yazıda tarif edilen protokol olarak, floresan puncta presinaptik sinir terminallerinin sinaptik veziküllerin lekeli kümeleri ile (tipik merkezi nöronların çapı yaklaşık 1 um) değil, tek tek sinaptik vesiküller (çapı, ~ 40 nm) temsil olduğunu not etmek gerekir. Basitlik için, bu düzeni sinaptik veziküllerin zo-endositozun genel bir fikir temsil eder. Böyle clathrin endositzolar, geçici öpücük-ve-run exo-endositoz ve toplu endositoz 64 ardından tam çöküşü füzyon gibi zo-endositozun birden fazla form, içerebilir. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.

Şekil 3,
Şekil 3,. FM görüntüleme tarafından incelenen sinaptik faaliyetleri üç tip. Uyarılmış sinaptik etkinliği tipik haliyle, dış elektrik uyaranlara gerektirir. Spontan sinaptik etkinliği elektriksel uyarıcının yokluğunda meydana gelir. Minyatür sinaptik aktivite elektrik uyaranlara olmadan ve aksiyon potansiyelleri olmadan kendiliğinden oluşur: genellikle aksiyon potansiyeli nesil voltaj bağımlı Na + kanal, tetrodotoxin bir engelleyici tarafından bastırılır. Eksositoz (sitoplazmik Ca2 + konsantrasyonunu sürekli bir artış) ve iyonomisin, yüksek K + çözeltisi (sürekli depolarizasyon) ile uyarılır ve sükroz (kolayca ayrılabilir havuzda veziküllerin ekzositozu ortaya çıkarma) içeren hipertonik çözelti ilave edildiğinde etkinlikleri uyarılmış aktivitesi içerir eksositosizini geçmesi sinaptik veziküller için aksiyon potansiyeli ateşlemesini gerekmez bütün bunlar. Bazı çalışmalarda, spontan aktivite genel olarak hem minyatür aktivitesi kapsayacak şekilde tanımlanır, unutmayın.

ŞEKIL 4 "fo: İçerik-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 4,. Destaining Temsilcisi sonucu. A. kültürlü nöronlar, hipokampal 37 ° C (adım 2.3) de 10 dakika boyunca 2.5 uM FM4-64 ile spontan aktivite ile boyandı ve (Protokolü 3) ile yıkanmıştır. Nöronlar spontan aktivite (adım 5.3) ile lekenin sırasında görüntülü ve uyarılmış faaliyetleri (adım 5.1) (sürekli eğri, ortalama n = 25 sinir terminalleri) üç mermi. Düşey çubuklar SEM temsil eder. Y-ekseni mutlak FM yoğunluğunu temsil eder ve bir kamera deklanşör kapalı olduğunda "0" yoğunluğunu temsil eder. Uyarılmış destaining toplam miktarı (ΔFM Uyarılmış) gösterilir. B. Bir Panel A (sürekli eğri, açıklık için atlanmış SEM bar) lekenin başlangıç ​​aşamasında görünümü genişletti. 60 saniye gözlem sırasında, gözaltına spontan hareket nedeniyle olduivity (ΔFM Spont) ama nedeniyle (ΔFM PB) Photobleaching kısmen oldu. FM4-64 (kalın noktalı eğri) ve ışıkla ağartma zaman süreci tamir edilebilir FM4-64 (Protokolü 6) görüntüleme ayrı bir deneyde belirlenmiştir. Oranı (9 dakika boyunca eğri vasıtasıyla tespit 5736 sn 'lik bir zaman sabiti olan bir tek bir üstel fonksiyon,), 2 dakika 19 üzerinde% 2-3 oldu. Işıkla ağartma eğri FM4-64 ölçülen yoğunluğunun edilene eşdeğer başlangıç ​​değeri olan bir üslü fonksiyonu olarak çizildi. Uzun süre (9 dk) üzerinden ağartmanın için Kakazu vd. 19'unda ek Şekil S5 görmek ve değişken uyarım şiddeti ve maruz kalma süresi ile. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz, spontan ve minyatür sinaptik aktivite uyarılmış ve destaining aşamasında görüntüleme için yanıt sinaptik veziküller boyama ve lekenin için protokoller tanımlamışlardır. Mevcut protokoller ek olarak, minyatür sinapsis aktivitesine dayandığı FM destaining gözlemleme yeni bir protokol dahil ettik. Bu protokolleri kullanarak, önceden hareket bozukluğu distoni bir fare modeli kültürlü nöronlar anormallikleri tespit. Yüksek etkinlik 20 ile uyarıldığında, vahşi tip farelerde muadilleri ile karşılaştırıldığında, bu nöronlar, Ca2 +-bağımlı bir şekilde sinaptik vezikül eksositosizini hız uygulandı. Nörotransmitter salınımı 19 yama-kelepçe elektrofizyolojik kayıtlar teyit gibi bu nöronlar da, daha sık minyatür sinaptik aktivite gösterdi.

Bu tür analizlerde FM boyalar kullanarak için protokol kritik yönü asse içinss ve photobleaching en aza indirmek. Işıkla neden olduğu değişikliği sinaptik etkinliği tarafından tetiklenen ile karşılaştırıldığında küçük olup olmadığını FM floresan yoğunluğu görülen değişiklikler güvenilir bir şekilde tespit edilebilir. Azaltılmış ışıkla ağartma de sitotoksisite bastırmak ya da ortadan kaldırmak için bir potansiyele sahiptir. Photobleaching ışığı uyarım için florofor maruz kalmasını en aza indirerek azaltılabilir ve canlı deneylerinde görüntüleme yapmak için ekipman, en az iki bileşeni vardır. Önemli bir bileşeni bir EMCCD makinesi, örneğin, bir foton karşı duyarlı olan detektör bir. Bu da olumsuz floresan emisyonu tespit etkilemeden maruz kalma süresi ve yoğunluğu en aza indirmek için yapar. Bağlantılı bir bileşeni detektör görüntü elde sadece uyarım ışığına numunenin maruz kalmasını sınırlar ışık kaynağı sistemidir. Bu kolayca ışık pozlama zamanlaması etkin kontrolü için izin veren bir LED ışık 41 (ON / OFF T elde edilirakes 1 msn daha az). Pozlama kamera (Andor kamera örneğin "Fire" terminal), dijital çıkışı ile sadece fotoğraf çekimi sırasında tetiklenebilir. LED kullanarak ek avantajları şunlardır: yama kelepçe kayıt olarak cam pipetler hassas kullanım müdahale edecek nötral yoğunluk filtreleri, ışık yoğunluğunun uzun vadeli istikrar ve mekanik titreşimlerin yokluğunu kullanmadan ışık yoğunluğunu kontrol yeteneği .

Genel olarak, yapısal olarak farklı olan boyalar aynı görüntüleme koşulları altında farklı oranlarda photobleach. Bu nedenle, belirli bir deneyde kullanılan fluorofor ağartmanın kapsamını değerlendirmek için ideal olacaktır. Canlı sinir terminalleri FM boyalar için, nedeniyle spontan veya minyatür sinaptik aktivite, sinaptik aktivite photobleaching oranı bağımsız değerlendirmek için teknik olarak zordur. Bu tür faaliyete sırasında floresan yoğunluğundaki azalmay FM boyalar (ekzositozu), FM boyaların ışıkla ağartma, ya da her ikisinin biyolojik kaybı nedeniyle olabilir. Neyse ki, tamir edilebilir FM boyaların yapıları nonfixable FM boyaların kişilerce hemen hemen aynı olacak şekilde tasarlanmıştır. Sinaptik etkinliği numunenin kimyasal tespiti ile bloke edilmiştir, oysa daha sonra burada tarif edilen protokol olarak, tamir edilebilir FM boyalar, nonfixable FM boyalar ile aynı yöntemler ile sinaptik vesiküller içine yüklendi. Görüntüleme koşulları canlı hücre görüntüleme 19 için olanlar ile aynı iken Özellikle, bu sistem kullanılarak ölçüldü ışıkla ağartma oranı düşük 2-3 kadar% 2 dakika boyunca oldu.

FM boyalar sinaptik vezikül geri dönüşüm farklı yönlerini keşfetmek için farklı protokoller kullanılabilir. Boyama ve lekenin sırasında farklı sinaptik faaliyetleri deney amaçları ve değerlendirilecek sinaptik vezikül geri dönüşüm özelliklerine bağlı olarak, çeşitli şekillerde birleştirilebilir. Antagonistleri seçimiists de deneylerin amacına bağlıdır. Ayrıca, FM görüntüleme boyama aşamasında hem de destaining faz 9,18,42 sırasında gerçekleştirilebilir. Ayrıca akılda gerektiğini, ancak, FM boyalar gibi muskarinik asetilkolin reseptörlerini bloke 43, ve 44, mağaza işletilen Ca 2 + kanalları 45 mechanotransducer kanalları nüfuz ve ATP 46 reseptörleri gibi beklenmedik etkileri olabilir. FM boyaların yüksek konsantrasyonları, potansiyel olarak, sinaptik vezikül Ekzositoz kendisinin 47 verimliliğini değiştirebilir. Böylece deneyler tasarlama ve sinaptik vezikül geri dönüşüm konusunda sonuçlarını yorumlarken dikkatli öneririz. Dikkate tamamlayıcı şekli epitoplar vezikül protein 22,48 intra-lümene ilişkin etki olan antikorların sinaptik vesiküller içine alımını içerir. Aynı zamanda pH-duyarlı bir vezikül lümen 49-51 hedeflenmiş GFP varyantları ve alımını ifade içerirekzo-endositoz birlikte intra-vesiküler pH değişiklikleri algılar, her ikisi de pH-duyarlı bir antikor konjugatları 52-54 arasında.

Bu tür istenmeyen etkileri arındırıldığında kez, FM boyalar geniş uygulamalar var. Örneğin, aynı sinaptik vezikül havuzları spontan için paylaşımlı olup olmadığını göstermek için kullanılan ve vezikül bültenleri 17,55 uyarılmış, ne ölçüde sinaptik vezikül geri dönüşüm verimi 56,57 regüle edilebileceği ve ne olabilir etkileri yapan bir önce devlet (dinlenme veya uyarılmış), örneğin spontan ve minyatür sinaptik aktivite dayalı vezikül geri dönüşüm sonra devlet uygulamayın. FM boyalar da FM Fotoçevrim yöntemi 30,58-62 ile ışık ve elektron mikroskopi gözlemleri ilişkilendirerek, ultra-yapı seviyesinde sinaptik vezikül geri dönüşümünü değerlendirmek için de kullanılabilir. FM boya aynı anda sinaptik fonksiyonları ve hücre içi Ca2 + con izlemek için kullanılabilirsantrasyondan 5. Sinaptik vesiküller, FM boyalar ve floresan dekstran 7 gibi diğer floresan sıvı-faz işaretleyicilerinin etiketleme ek olarak, yoğun bir nöronal etkinlik tarafından tetiklenen toplu endositoz izlemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, FM boyaların uygulamaları sinaptik vezikül geri dönüşüm ve ek sinaptik fonksiyonları ile ilgili değerli bir bilgi kaynağı sağlamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Yazarlar, bu çalışmanın yürütülmesi boyunca yararlı tartışmalar için harata laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği, distoni Tıbbi Araştırma Vakfı, Edward Mallinckrodt, Jr Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve NCH için Whitehall Vakfı hibe tarafından finanse edildi

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Nörobilim Sayı 85 Presinaptik Terminalleri sinaptik kesecikler Mikroskopi Biyolojik Deney Sinir Sistemi Endositozdan ekzositoz floresan görüntüleme FM boya nöron ışıkla
Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter