Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Undersøgelse af synaptiske vesikel Genbrug Brug af FM Farvestoffer Under Evoked, spontan, og Miniature Synaptiske aktiviteter

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

Vi beskriver brugen af ​​styryl FM farvestoffer til billede synaptiske vesikel genbrug i funktionelle nerveender. Denne protokol kan anvendes ikke blot på fremkaldte, men også spontan og miniature synaptiske aktiviteter. Protokollen udvider forskellige synaptiske begivenheder, der effektivt kan evalueres.

Abstract

Synaptiske vesikler i funktionelle nerveender gennemgå exocytose og endocytose. Denne synaptiske vesikel genanvendelse kan være effektivt analyseres ved hjælp styryl FM farvestoffer, som afslører omsætning membran. Konventionelle protokoller til anvendelse af FM farvestoffer blev designet til at analysere neuroner efter stimuleret (fremkaldt) synaptisk aktivitet. For nylig har protokoller bliver tilgængelige for at analysere FM-signaler, der ledsager svagere synaptiske aktiviteter, såsom spontane eller miniature synaptiske begivenheder. Analyse af disse små ændringer i FM-signaler kræver, at billeddannende system er tilstrækkelig følsom til at påvise små ændringer i intensitet, men at kunstig ændringer i stor amplitude undertrykkes. Her beskriver vi en protokol, som kan anvendes til fremkaldte, spontan, og miniature synaptiske aktiviteter og anvende dyrkede hippocampale neuroner som et eksempel. Denne protokol omfatter også et middel til at vurdere graden af ​​fotoblegning FM farvestoffer, da dette er en væsentligkilde af artefakter, når imaging små ændringer i intensitet.

Introduction

Funktionaliteten af ​​synaptiske vesikler er en vigtig faktor for synaptisk transmission. Disse vesikler frigiver neurotransmittere, når de smelter med den præsynaptiske plasmamembran (exocytose), og de bliver klar til endnu en cyklus af frigivelse efter bliver regenereret fra plasmamembranen (endocytose) og genindlæses med neurotransmitter. Forskning i dynamik og mekanismerne bag synaptisk vesikel genbrug er blevet stærkt fremskyndet af indførelsen af styryl FM farvestoffer 1. Disse amfipatiske molekyler, som har positivt ladede hydrofile hoved grupper og hydrofobe haler (flere farvestoffer i figur 1A, stereoview af FM1-43 i figur 1B), kan reversibelt ind og ud lipidmembraner uden gennemtrænger dem. Grupper af FM farvestoffer deler lignende funktioner, der påvirker den række af lys, de udsender. For eksempel, FM2-10, FM1-43, og FM1-84 har en dobbeltbinding mellem to cykliske forbindelser og show grøn emission. Forskellen mellem dem er længden af ​​den hydrofobe hale, som bestemmer dens hydrofobicitet og dermed hastigheden af ​​exit fra membranen (departitioning). I tilfælde af FM5-95 og FM4-64, tre dobbeltbindinger knytte de cykliske forbindelser, og de viser rød emission. Disse farvestoffer er forskellige med hensyn til deres hydrofile dele. I alle FM farvestoffer fluorescensintensiteten øges, når de indsættes i biologiske membraner, som følge af en stigning i kvanteudbytte i den hydrofobe miljø i forhold til det hydrofile miljø. Således ændringerne i FM intensitet repræsenterer ændringerne i omsætning membran. De forskellige farver (emission spektre) og hydrofobiciteter gøre FM farvestoffer en alsidig forskning værktøj i synaptisk vesikel genbrug.

Baseret på disse funktioner, er FM-farvestoffer oftest anvendes i henhold til følgende skema, når man analyserer synaptiske vesikel genbrug (figur 2). Neurons er badet i en ekstracellulær opløsning indeholdende FM farvestof, der gør det muligt at blive taget op i synaptiske vesikler (SVS), da de udgør via endocytose (farvning). Farvestoffet vaskes derefter ved at anvende et farvestof-fri ekstracellulære opløsning, hvilket afslører de funktionelle nerveender, nemlig kun de aktivt undergår endocytose vil indeholde en klynge af synaptiske vesikler, der er fyldt med farvestoffet (figur 2 nederst). Efter exocytose fører til tab af FM-farvestoffet til det ekstracellulære rum og et ledsagende tab af fluorescens (affarvning, skyldes både departitioning til et hydrofilt miljø og diffusion væk fra stedet for exocytose). Derfor ændringerne i FM fluorescensintensitet er indikatorer for synaptisk vesikel exo-og endocytose.

FM-farvestoffer er blevet brugt til at farve og affarves de synaptiske vesikler i forskellige organismer og præparater 2,3. Som eksempler kan nævnes pattedyr NEUROnal kulturer 4-9, pattedyr hjernen skiver 10,11, neuromuskulære junctions 12,13, nethinde bipolære neuroner 14,15, og hår celler i cochlea 16.

Typisk i sådanne forsøg er både farvning og affarvning udløst af ekstensivt stimulere neuroner (fremkaldt aktivitet). For nylig, dog synaptiske vesikel genbrug reaktion på svag stimulation er også blevet analyseret, som har genbrug i mangel af en ekstern stimulus (spontan og miniature synaptisk aktivitet) 9,17-19. Spontane og miniature synaptiske Aktiviteterne er defineret som dem, der forekommer i fravær af eksterne stimuli, med den tidligere involverer spontan fyring af aktionspotentialer (Figur 3). Disse svage synaptiske aktiviteter er forbundet med mindre ændringer i FM-signaler end dem, udløst af omfattende stimulering. Målingen kræver, at ændringerne i FM fluorescerning intensitet præcist afspejler synaptiske vesikel exocytose eller endocytose, men ikke kunstig ændringer i intensitet. En årsag til artefakt er tilstedeværelsen af ​​ikke-specifik farvning af plasmamembranen ved hjælp af FM-farvestoffer. Gradvis udvaskning af denne komponent vil føre til en gradvis ændring i den målte fluorescensintensitet, som vil blive fejlagtigt tilskrives synaptiske aktiviteter. Denne faktor kan reduceres ved passende metoder (se protokollen). Det mest bemærkelsesværdige årsag til artefakt er fotoblegning FM farvestof holdes inden synaptiske vesikler. Fotoblegning-relaterede ændringer i FM intensitet skal være lille i forhold til de biologiske (synaptic) ændringer, der måles. Den seneste udvikling af følsomme kameraer, f.eks elektrontiltrækkende multiplicere ladningskoblet indretning (EMCCD) kamera, der gør det muligt at minimere fotoblegning ved at forkorte eksponeringstid og svække intensiteten af lys anvendes til at excitere fluoroforen. En anden årsag til den artefakt er et skred in fokusering lysniveau mikroskop. Fokus drift under et billeddannende session kan være forårsaget af mekaniske eller termiske virkninger og vil fejlagtigt føre til en ændring i den målte fluorescensintensitet.

Her beskriver vi protokoller og udstyr, der gør det muligt at bruge FM farvestoffer til at analysere synaptiske vesikel genvinding, selv i forbindelse med svage eller ingen stimulation, især miniature synaptisk aktivitet. Vi viser eksempler på farvning og affarvning af vesikler under evoked og spontane synaptiske begivenheder, ved hjælp af dyrkede gnaver hippocampus neuroner, og billeddannelse Affarvningstrinnet fase. Vi viser også, hvordan man vurderer graden af ​​FM farvestof fotoblegning, i mangel af enhver FM farvestof tab på grund af synaptiske aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Primær kultur af neuroner fra pattedyrs hjerne

Alle animalske procedurer udført i denne undersøgelse er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Iowa.

  1. Forbered dissocierede cellekultur af CA3-CA1 regioner af hippocampus fra mus eller rotter på postnatal dag 0-1 19,20. Plate hippocampus celler på 12-mm dækglas (tykkelse nummer 0) preseeded med rotte gliale fødelag i skåle med 24 brønde, og ved en densitet på 12.000 celler / brønd.
  2. Kultur de hippocampusneuroner mindst 8 dage for funktionelle nerveender til at udvikle 21. Vi bruger neuroner på 11-14 dage in vitro, når de enkelte nerveender er relativt isoleret uden megen klyngedannelse. Neuroner kan anvendes til forsøg op til ca 21-28 dage in vitro f.eks Willig et al. 22 og Nosyreva og Kavalali 23.
  3. Forfunktionelle undersøgelser, vurdere dækglas (før farvning) for indikatorer for sunde neuroner ved hjælp transmitteret lysmikroskopi (f.eks fasekontrastoptik ved en forstørrelse på 10-20x). Indikatorerne for god sundhed omfatter: en ensartet glialcelle lag, et klart cellulær margen omkring neuroner udvidede dendritter uden beaded strukturer, mangel på cluster somata, og en mangel på bundtet neuritter.

2. Ilægning af Synaptic Vesikler med FM Dye (farvning)

  1. Farvning grundet synaptisk aktivitet fremkaldt af elektrisk felt stimulering (vedrører virkningspotentialer)
    1. Forbered farvning løsning 1 ved tilsætning af FM farvestoffet til en HEPES-baserede dye-fri løsning, fx Tyrodes opløsning (se løsninger for detaljer). Koncentrationen af ​​FM-farvestof er 10 uM FM1-43 og 2,5 uM FM4-64. Typiske koncentrationsintervaller er: 2-15 uM FM1-43 eller 2,5-20 uM FM4-64 3,6. Til forsøg kræver undertrykkelse af tilbagevendendeglutamaterge synaptiske aktivitet og induktion af synaptisk plasticitet, føjer yderligere antagonister af ionotrope glutamatreceptorer: AMPA-receptorer (fx 10 uM CNQX) og NMDA-receptorer (fx 50 uM AP5).
    2. Overfør et dækglas med celler fra dyrkningsmediet til billeddannelse kammer udfyldt med almindelig Tyrodes løsning. Vi bruger en imaging kammer med stimulation elektroder fastgjort til sidevæggene (platin ledninger adskilt af 6,3 mm, RC-21BRFS). Dette kammer er udformet som et lukket billedbehandling kammer, men vi bruger det som et åbent kammer (dvs. uden en top dækglas), med et bad volumen på ~ 200 ul. Under overførslen ikke udsætter de dyrkede celler til luft, og undgå at klemme de dyrkede celler med pincet (plukke dækglasset op fra omkredsen snarere end nær centrum).
    3. Perfundere billeddannelse kammer med almindelig Tyrode-opløsning ved stuetemperatur (23-25 ​​° C).
    4. Påfør farveopløsning 1 af constant perfusion.
    5. Fremkalde synaptisk aktivitet ved anvendelse af elektriske impulser. For at opnå maksimal farvning af den samlede genvinding pulje af synaptiske vesikler i hippocampale neuroner, stimulere kulturerne ved 10 Hz for 60-120 sek 24. Når jeg forsøger at opnå maksimal effektivitet i marken stimulation, holde flere funktioner i tankerne. 1) Højden af ​​badet opløsning skal være så lavt som muligt, samtidig med at de neuroner og stimulerende elektroder helt nedsænket i et tyndt lag af Tyrodes opløsning (for at holde neuroner i live og at opnå en homogen elektrisk felt). 2) Den nuværende intensitet og varighed bør optimeres ved hjælp af en indikator for neuronal uro, fx fluorescerende Ca 2 + billeddannelse, i vores tilfælde, en konstant strøm på 30 mA intensitet og 1 ms varighed giver pålidelige resultater. 3) badopløsningen bør anvendes ved konstant flow ved stimulation af elektrisk stimulation fører til elektrolyse, hvilket protoner (H (f.eks Hanks balancerede saltopløsning med phenolrødt).
    6. Lad neuroner i farveopløsning 1 for en yderligere 60 sek efter feltstimulering er afsluttet, således at post-stimulus endocytose vil blive afsluttet 25.
    7. Vask farvningsopløsningen ud af imaging kammer ved perfusion med skylning løsning 1, en ​​dye-fri Tyrode løsning plus antagonister af AMPA-receptorer og NMDA-receptorer (se afsnit 2.1.1), og en blokker af spændingsafhængige Na + kanaler ( fx 0,5-1 uM tetrodotoxin, TTX). Kombinationen af ​​blokkere undertrykke tabet af FM farvestof gennem spontan synaptisk aktivitet. For at maksimere vask, øge perfusionshastigheden (<em> fx op til 5-6 ml / min) i 1-2 minutter, og der tilsættes en bolus (fx 1 ml) af skylleopløsning 1 direkte til den åbne billeddannelse kammeret manuelt, ved hjælp af en pipette. Styr styrken og retningen af ​​manuelle infusion, så for ikke at forstyrre de dyrkede neuroner.
  2. Farvning grundet synaptisk aktivitet fremkaldt af høj-K +-opløsning (ikke involverer handling potentialer).
    1. Forbered farvning opløsning 2 ved tilsætning af FM-farvestof til høj-K + Tyrode opløsning. Konkret udarbejde en modificeret Tyrodes løsning med 45 mM KCl ved ækvimolær substitution af KCl til NaCl. Hvis det er nødvendigt, tilføje antagonister af AMPA og NMDA-receptorer. Denne high-K + løsning vil depolarisere neuroner kontinuerligt, aktivere Ca 2 + indstrømning i nerveender, og indlede synaptiske vesikel exocytose til det maksimale omfang 26. Højere koncentrationer (70-90 mm) blev også brugt i andre rapporter f.eks Klingauf et al. 27 end Richards et al. 28.
    2. Overfør et dækglas med dyrkede neuroner fra dyrkningsmediet til billeddannelse kammer udfyldt med almindelig Tyrodes løsning.
    3. Farv neuronerne ved stuetemperatur i 1-2 minutter ved anvendelse af farveopløsning 2 ved konstant perfusion eller ved hjælp af en pipette 26,28. I sidstnævnte tilfælde bør det endelige farvestofkoncentration styres ved tilsætning af et kendt volumen farveopløsning 2 til et kendt volumen af ​​farvestof-fri opløsning.
    4. Vask farvningsopløsningen ud af imaging kammer, som beskrevet i afsnit 2.1.7.
  3. Farvning som følge af spontan og miniature synaptisk aktivitet.
    1. Forvarm bicarbonatbaseret løsning (f.eks Minimum Essential Medium, MEM) til 37 ° C ved at placere i kulturen inkubator for mere end 60 min.
    2. Til farvning baseret på spontan synaptisk aktivitet, forberede farveopløsning 3 ved tilsætning af FM-farvestof til MEM. Til farvning baseret på miniature synaptisk aktivitet, forberede farveopløsning 4 ved tilsætning af TTX til farvningsopløsningen 3.
    3. Stain neuroner ved at overføre et dækglas med dyrkede neuroner fra kulturmedium til farvning opløsning 3 eller 4, og efterlader dem i den samme farvning opløsning ved 37 ° C i 10 min.
    4. Skyl dækglasset kortvarigt i skylning løsning 1.
    5. Overfør dækglasset til skylning løsning 1 i en imaging kammer. Husk på følgende. 1) Cellerne bør ikke udsættes for luft, hvis det er nødvendigt, overføre dækglas direkte til billeddannelse kammer uden skylning. 2) Neuroner kan farves ved stuetemperatur ved at erstatte farveopløsning 3 eller 4 med en HEPES-baseret løsning. 3) Neuroner kan farves til fremkaldte synaptisk aktivitet i forbindelse med høj-K + løsning ved hjælp af denne metode, ved at erstatte farveopløsning 3 eller 4 med farveopløsning 2 og udføre de resterende trin ved stuetemperatur.
    6. Vask farvningsopløsningen ud af billeddannelsekammer som beskrevet i afsnit 2.1.7.

3. Udvaskning af FM Dye

  1. Efter neuronal farvning og indledende vask af nogen af ​​de ovenfor beskrevne metoder (afsnit 2.1.7), fortsætte med at perfundere imaging kammer med skylning løsning 1 i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Dette vil fjerne FM farvestof fra plasmamembranen og den ekstracellulære opløsning. I tilfælde af vores billeddannelse kammer, bad perfusionshastigheden er 600-1,200 ul / min. Vask kan også udføres i fravær af ekstracellulær Ca2 + til at undertrykke FM dye tab på grund af synaptiske aktiviteter 17. Vaskene kan forbedres ved en kortvarig anvendelse af Advasep-7, en modificeret cyclodextrin, der fungerer som en ådselsæder af FM-farvestoffer fra plasmamembranen 29-31. Det er afgørende at holde enhver Advasep-7 eksponering kort (fx 5 sek i tilfælde af monolagskultur) for at undgå både at reducere intensiteten af FM puncta 31 og kompromittere hjertlth af cellerne. Fluorescensen fra FM1-43 i plasmamembranen kan også undertrykkes ved en anvendelse af et quencher sulforhodamin 101 (50-100 uM), der ikke træder synaptiske vesikler 32.

4.. Søgning efter en optimal billedkvalitet Field under vask

  1. Kontroller, at cellerne i området, der skal afbildes er sunde, ved hjælp af transmitteret lys mikroskopi med høj forstørrelse og høj numerisk blænde objektiv (f.eks 40X). Fra denne sektion, vi fortsætter med at bruge en omvendt mikroskop (Eclipse Ti, Nikon) udstyret med fasekontrast eller differential interferens kontrast optik. Dette mikroskop er også udstyret med Perfect Focus System (PFS), som muliggør kontinuerlig realtid fokus korrektion, som overvinder mikroskop fokus afdrift. Denne funktion er afgørende for time-lapse imaging under affarvning med samme fokus flyet.
  2. Kontroller, at farvningen var effektivt ved hjælp af fluorescens-optik. Avoide aggregater af FM puncta medmindre de er målet for forskningen, fordi individuelle boutons vil være vanskeligt at skelne. Vær opmærksom på figurer af FM puncta: hvis de fleste af de farvede boutons vises som strenge af cirkulære perler, kunne de repræsentere usunde nerveender. Minimer eksponering af neuroner stærk fluorescens excitation for at undgå fotoblegning.

5.. Aflæsning FM Dye fra Synaptic vesikler (affarvning)

  1. Affarvning grundet synaptisk aktivitet fremkaldt af elektrisk felt-stimulering.
    1. Wash TTX ved perfusion af neuroner i udstrakt grad med en skylleopløsning 2 (samme som skylleopløsning 1, men uden TTX). Bekræft effektiviteten af TTX udvaskning i separate forsøg med de samme vaske parametre (perfusionshastighed og varighed), fx ved fluorescerende Ca 2 + billeddannelse af cytoplasmatiske Ca 2 + transienter induceret af feltstimulering eller ved patch-clamp optagelse af voltaldersafhængige Na +-strømme.
    2. Begynd billeddannelse FM farvestoffer. Til billeddannelse FM1-43 eller FM4-64, skal du bruge 520 nm eller 650 nm lang aflevering emissionsfiltre henholdsvis og et 490 nm exciteringsfilter. Anskaf billeder hver 1-2 sek, ved hjælp af en kort eksponeringstid (fx 10-20 ms), svag excitationsintensitet (fx 5-10% af LED-effekt), og høj følsomhed (fx med EM gevinst). Minimer fotoblegning af FM farvestoffer ved at reducere eksponeringen tid og intensiteten af ​​fluorescens excitation. Minimer mikroskop fokus afdrift ved at tænde Perfect Focus System.
    3. Stimulering af neuroner i skylning løsning 2, ved hjælp af felt-stimulation (fx ved 10 Hz for 120 sek) 20.
    4. Påfør flere runder af stimulation, med mellemliggende hvileperioder på 1-2 min, for at udtømme alle de genbrug synaptiske vesikler af FM farvestof. Dette er vigtigt ved vurderingen af ​​størrelsen af ​​den samlede genanvendelse pulje af synaptiske vesikler, der blev farvet med FM-farvestoffer i the forudgående tilstand 20,33.
  2. Affarvning som følge af synaptiske aktiviteter fremkaldt i fravær af handling potentialer.
    1. Start billeddannelse FM farvestof.
    2. Påfør stimulerende reagenser opløst i skylning løsning 1 eller 2. Sådanne reagenser omfatter: KCl (høj-K +-opløsning, fx 45 mM) 26, ionomycin (en Ca 2 +-ionophor, der hæver den intracellulære Ca2 +-koncentration ved at tillade Ca2 + indstrømning i cellen fra den ekstracellulære opløsning, anvendes fx på 5 uM) 20,34 og saccharose (en hypertonisk løsning, der stimulerer frigivelsen af synaptiske vesikler fra let udløselige pulje, der bl.a. anvendes på 500 mm) 35,36. Brug en hurtig, lokal perfusionssystem for en pålidelig tidsmæssig kontrol med anvendelsen af reagenser, fx SF-77B system fra for Warner Instruments 37, eller Y-rør-system 38-40.
  3. Affarvning som følge af spontan og miniature synaptisk aktivitet.
    1. For affarvning som følge af spontan synaptisk aktivitet skylles TTX som ovenfor (afsnit 5.1.1), ved hjælp af skylning løsning 2. Begynd billeddannelse FM farvestoffer mens perfusion neuroner med skylning opløsning 2.. For affarvning som følge af miniature synaptiske aktiviteter, start billeddannelse FM farvestoffer, samtidig med at perfundere neuronerne med skylning løsning 1 (med TTX).
    2. Efter affarvning baseret på enten spontan eller miniature aktivitet, identificere de funktionelle nerveender ved affarvning via fremkaldt synaptisk aktivitet. Aktivitet kan fremkaldes af en af ​​de procedurer, der er beskrevet ovenfor. Denne identifikation proces er nødvendig, fordi de farvede strukturer kan være dem, andet end de funktionelle nerveender (f.eks langsomt genbrug endosomes eller astrocytiske vesikler), og en stor mængde af affarvning af den fremkaldte aktivitet hjælpemidler i denne proces.

6.. Vurdering af fotoblegemidlet Rate FM Farvestoffer

  1. Farv nerve terminaler med aldehyd-fixable FM farvestof (f.eks FM1-43FX, FM4-64FX). Dette kan gøres ved hjælp af fremkaldte, spontan eller miniature farvning ovenfor beskrevne fremgangsmåde og ved at erstatte FM farvestof med en fixable FM farvestof.
  2. Skyl det fixable FM farvestof som beskrevet i afsnit 2.1.7.
  3. Kemisk fastsætte neuroner ved at overføre dækglasset til fikseringsopløsning: 4% paraformaldehyd og 4% saccharose i Tyrodes opløsning i 30 minutter ved 4 ° C. Fluorescensintensiteten af ​​fixable FM farvestof vil blive bevaret efter kemisk fiksering.
  4. Udvaske fiksativ i 10 min i Tyrode opløsning, ved at overføre dækglasset frisk Tyrode opløsning to gange.
  5. Overfør dækglasset i frisk Tyrodes løsning i imaging kammer.
  6. Start billedbehandling fixable FM-farvestof under anvendelse af det samme sæt af billeddata parametre for levende neuroner. Det er vigtigt at skylle imaging kammer meget godt efter brug af kemisk faste prøve, fordiresterende fiksativ kan påvirke de efterfølgende live-cell imaging eksperimenter, der udføres i det samme kammer. Alternativt til den faste cell imaging, kan de farvede levende celler afbildes til vurdering af fotoblegning sats. Det er imidlertid værd at huske på, at det er vanskeligt at blokere miniature synaptisk aktivitet akut, for eksempel kan frekvensen af miniature aktivitet reduceres til ~ 50% ved at fjerne ekstracellulær Ca2 + 23, men det er ikke en fuldstændig blokade.
  7. Ved slutningen af ​​hver imaging session erhverve et baggrundsbillede til at vurdere den absolutte værdi af FM fluorescens intensitet. Intensiteten af FM puncta udgør ikke kun den sande signal fra FM-farvestoffer i nerveterminaler, men også baggrundsstøj 1) gliaceller, der ligger til grund for den neuronale monolagskultur, 2) dækglasset og optiske komponenter (f.eks objektiv, filtre og spejle), og 3) detektor (EMCCD kamera). Baggrundsstøj er assessed i nonstained regioner af det afbildede område. Når sådanne områder er begrænset i rummet eller heterogen i intensitet, erstatte det med et billede med kameraets lukker lukket og erhverve støj fra detektoren, selvom det ikke er en ideel metode. Anskaf cirka 10 billeder med samme billeddannende parametre.

7.. Image Analysis

  1. Importer de erhvervede data i image-analyse software som en stak af tid-serie billeder. Vi bruger ImageJ (WS Rasband, NIH) og de ​​tilhørende plug-ins, fx Image Stabilizer plug-in (Kang Li) for at korrigere en lille grad af bevægelse blandt FM puncta og Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) til at analysere tidsserien.
  2. Beregn ændringerne i FM intensitet i starten og slutningen af ​​serien (ΔFM). Til dette formål gennemsnit billederne før starten af affarvning og efter afslutningen af affarvning (f.eks 5 billedrammer hver), og generere en forskel billede ved subtracting dem.
  3. Identificer de potentielt funktionelle nerveender ved at anvende en intensitet tærskel til forskellen billedet, og opdage pixels, hvis intensiteter er højere end tærsklen. En metode til at sætte tærsklen er at vælge standardafvigelsen af ​​baggrunden intensitet opnået fra den nøgne dækglasset området.
  4. Identificere de isolerede, funktionelle nerveender som de sammenhængende pixels, der blev påvist, og som opfylder en størrelse kriterium (Minimum og maximum antal pixels i Berøringsassociation). Denne proces eliminerer baggrundsstøj og aggregerede nerveender fra analyse.
  5. Tildel regioner-af-interesse (ROI) på de fundne pixel klynger (med individuelle klynger svarende til de individuelle nerveender). Den samlede ændring i intensitet under affarvning (ΔFM) er en typisk parameter for analyse. Dette repræsenterer den kumulative mængde af fremkaldte, spontan eller miniature synaptisk aktivitet. Udelukke ROIs hvis de udviser en af ​​følgendeændringer i intensitet afhængig af formål eksperimenter: en stigning under optagelse, en pludselig nedgang før stimulation, eller en lang latenstid efter stimulation.
  6. Vurdere graden af ​​fotoblegning ved at importere de erhvervede tidsseriedata i image-analyse software. Gennemsnittet af baggrundsbilleder (fx med en lukket lukker), og trække det fra de enkelte billeder. Tildel ROIs til FM puncta der formodentlig svarer til nerveender, og måle ændringer i ROI intensitet over tid.

Løsninger

  1. Tyrode opløsning
    • Sammensætning (i mM): 125 NaCI, 2 KCI, 2 CaCI2, 2 MgCI2, 30 glucose, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Farveopløsning 1
    • Tyrodes opløsning plus FM farvestof.
    • Denne opløsning anvendes til farvning baseret på fremkaldt synaptisk aktivitet ved elektrisk stimulation.
    • Tilsæt antagonister af AMPA-receptorer og NMDA receptors, hvis nødvendigt.
  3. Farveopløsning 2
    • High-K + Tyrode opløsning plus FM farvestof.
    • Denne modificerede Tyrodes opløsning fremstilles ved stigende KCl-koncentration på 45 mM ved ækvimolær substitution af KCl til NaCl.
    • Denne opløsning anvendes til farvning baseret på fremkaldt synaptisk aktivitet ved kontinuerlig depolarisering.
    • Tilsæt antagonister af AMPA-receptorer og NMDA-receptorer, hvis nødvendigt.
  4. Farveopløsning 3
    • MEM opløsning plus FM farvestof.
    • Denne opløsning anvendes til farvning baseret på spontan synaptisk aktivitet.
  5. Farveopløsning 4
    • MEM løsning plus FM farvestof og TTX.
    • Denne opløsning anvendes til farvning baseret på miniature synaptisk aktivitet.
  6. Skylning løsning 1
    • Tyrode opløsning plus antagonister af AMPA-receptorer og NMDA-receptorer, og TTX.
  7. Skylning løsning 2
    • Tyrode opløsning plus antagonister af AMPA-receptorer og NMDA-receptorer, men uden TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et eksempel, viser vi repræsentative resultater Affarvningsopløsningen tidsforløbet af synaptiske vesikler (figur 4). Dyrkede hippocampale neuroner blev farvet med FM4-64 ved hjælp af spontan synaptisk aktivitet (trin 2.3) og vasket med farvestof-fri opløsning (skylleopløsning 2). De billeddannende viser den oprindelige affarvning tidsforløbet hjælp spontan aktivitet (trin 5.3) (indledende del af kontinuerlig linje, figur 4A). Dette er efterfulgt af affarvning tidsforløb under anvendelse af tre runder af fremkaldte aktivitet med 10 Hz feltstimulering til 120 sek hver (trin 5.1). En måde at måle mængden af fremkaldte affarvning er illustreret med en dobbelt-ended pil (ΔFM fremkaldte), der svarer til størrelsen af den samlede genvinding pulje af vesiklerne.

Før den første stimulus blev givet, var der et gradvist fald i FM intensitet (forstørret i figur 4B). Dette fald var sammensat af affarvningpå grund af spontan synaptisk aktivitet (ΔFM Spont) og fotoblegning (ΔFM PB). Når bidrag fotoblegning er lille, kan ændringen fra den preimaging baseline (ΔFM Spont + ΔFM PB) bruges som en tilnærmelse til Affarvningsopløsningen mængden af spontan aktivitet.

Figur 1
Figur 1. Strukturer af FM farvestoffer. A. FM farvestoffer deler nogle fælles strukturelle træk. De hydrofile grupper forblive i vandig opløsning, og de hydrofobe haler tillader FM farvestoffer til at blive opdelt i membranen. FM2-10, FM1-43 og FM1-84 viser grøn emission, mens FM5-95 og FM4-64 viser rød-forskudt emission. B. Stereoview af FM1-43, de mest almindeligt anvendte FM farvestof. Hydrofilgruppe vender op og hydrofobe haler vender nedad. NitrOgen atomer er farvet blå. For en anden visning af FM1-43, se Schote og Seelig 63..

Figur 2
Figur 2. Grundstruktur FM farvestof brug. Efter påføring til neuroner, FM farvestof indsat i plasmamembranen bliver fluorescerende (grøn), mens den i den vandige opløsning er meget mindre fluorescerende (grå). En synaptiske vesikel (SV) er indlæst (plettet) ved FM-farvestof, når det gennemgår endocytose, typisk efter exocytose. Udvaskning af FM farvestof i ekstracellulær løsning gør det muligt kun de farvede vesikler til at være fluorescerende. Efterfølgende en synaptisk vesikel losset (affarvet), når det undergår exocytose, og derfor frigiver FM farvestof. Under Et billede illustrerer et forbillede farvning af dyrkede hippocampusneuroner med FM1-43 (en overlejring af fluorescens og fasekontrast billeder). Det er bemærkelsesværdigt, at der i den protokol, der er beskrevet i dette papir, repræsenterer de fluorescerende puncta præsynaptiske nerveender (diametre ~ 1 um i typiske centrale neuroner) med klynger af farvede synaptiske vesikler, ikke de enkelte synaptiske vesikler (diametre ~ 40 nm). For enkelhed, denne ordning er en generel idé om exo-endocytose af synaptiske vesikler. Det kan omfatte flere former for exo-endocytose, såsom fuld kollaps fusion efterfulgt af clathrin endocytose, forbigående kiss-and-run exo-endocytose, og størstedelen endocytose 64.. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Tre typer af synaptiske aktiviteter studeret af FM billeddannelse. Evoked synaptisk aktivitet kræver typisk eksterne, elektriske stimuli. Spontan synaptisk aktivitet optræder i fravær af elektriske stimuli. Miniature synaptisk aktivitet opstår spontant uden elektriske stimuli og uden handling potentialer: normalt aktionspotentialet generation er undertrykt af en blokker af spænding-afhængige Na +-kanal, tetrodotoxin. Yderligere aktiviteter omfatter den fremkaldte aktivitet, når exocytose stimuleres af høj-K +-opløsning (kontinuerlig depolarisering), ionomycin (kontinuerlig stigning i cytoplasmatisk Ca 2 + koncentration), og hypertonisk opløsning indeholdende saccharose (fremkalde exocytose af vesikler i let udløselige pool), som alle kræver ikke handling potentiale fyring for synaptiske vesikler at gennemgå exocytose. Bemærk, at i nogle undersøgelser, er den spontane aktivitet bredt defineret til at omfatte miniature aktivitet så godt.

igur 4 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4.. Repræsentant resultat af affarvning. A. Dyrkede hippocampale neuroner blev farvet ved spontan aktivitet med 2,5 uM FM4-64 i 10 minutter ved 37 ° C (trin 2.3) og vasket (protokol nr. 3). Neuroner blev afbildet under affarvning med spontan aktivitet (trin 5.3), og tre runder fremkaldte aktiviteter (trin 5.1) (kontinuerlig kurve, gennemsnit af n = 25 nerveender). Lodrette søjler repræsenterer SEM. Y-aksen repræsenterer den absolutte FM intensitet og "0" repræsenterer intensiteten, når kameraet lukkeren er lukket. Den totale mængde af fremkaldte affarvning vises (ΔFM Evoked). B. En udvidet visning af første fase af affarvning i panel A (kontinuert kurve, SEM stænger udeladt for overskuelighedens skyld). Under en 60 sek observation, er tilbageholdelsesmagten skyldes primært spontan handlingivity (ΔFM Spont), men skyldtes delvis fotoblegning (ΔFM PB). Den fotoblegning Tidsforløbet for FM4-64 (tyk stiplet kurve) blev bestemt i en separat eksperiment af imaging fixable FM4-64 (Protokol 6). Satsen var 2-3% i løbet af 2 min (en enkelt eksponentialfunktion med en tidskonstant på 5.736 sek, bestemt ved kurvetilpasning over 9 min) 19. Den fotoblegning kurve blev tegnet som en eksponentiel funktion med en indledende værdi svarende til det af den målte intensitet af FM4-64. Se supplerende figur S5 i Kakazu et al. 19 til fotoblegning på længere periode (9 min), og med variabel excitationsintensitet og eksponeringstid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet protokoller for farvning og affarvning synaptiske vesikler som reaktion på fremkaldte, spontan og miniature synaptisk aktivitet og for billedbehandling i Affarvningsopløsningen fase. I tillæg til de eksisterende protokoller, har vi inkluderet en ny protokol for at observere FM affarvning baseret på miniature synaptisk aktivitet. Ved hjælp af disse protokoller, vi tidligere identificeret abnormiteter i dyrkede neuroner fra en musemodel af bevægelsen uorden dystoni. I forhold til deres kolleger i wild-type mus, gennemgik disse neuroner accelereret synaptisk vesikel exocytose i en Ca 2 +-afhængig måde, når stimuleret af høj aktivitet 20. Disse neuroner viste også hyppigere miniature synaptisk aktivitet, hvilket bekræftes af patch-clamp elektrofysiologiske optagelser af neurotransmitter release 19.

Den kritiske aspekt af protokollen for at bruge FM-farvestoffer i sådanne analyser er, at Assess og minimere fotoblegning. Subtile ændringer i FM fluorescensintensitet pålideligt kan vurderes, om de ændringer, der skyldes fotoblegning er små i forhold til dem, udløst af synaptisk aktivitet. Reduceret fotoblegning har også potentiale til at undertrykke eller eliminere cytotoksicitet. Fotoblegning kan reduceres ved at minimere eksponeringen af ​​fluoroforer til excitationslys, og der er mindst to komponenter af udstyr til at gøre dette i levende billeddannelse eksperimenter. En vigtig komponent er en følsom detektor af fotoner, fx en EMCCD kamera. Dette gør det muligt at minimere varigheden og intensiteten af ​​eksponeringen uden negativ indflydelse påvisning af fluorescens emission. En associeret komponent er lyskilden system, der begrænser eksponering af prøven til ekscitationslys kun når detektoren erhverver billeder. Dette opnås let ved et LED lys 41, der giver mulighed for en effektiv kontrol af timingen af lyseksponering (ON / OFF takes meget mindre end 1 ms). Eksponeringen kan udløses kun under billedoptagelse ved digitalt output fra kameraet (fx "Fire" terminal i Andor kamera). Yderligere fordele ved at bruge LED bl.a. evne til at styre lys intensitet uden at bruge neutralfiltre, langsigtet stabilitet af lysintensiteten, og fraværet af mekaniske vibrationer, der vil forstyrre præcis håndtering af glaspipetter som i patch-clamp-optagelse .

Generelt strukturelt forskellige farvestoffer photobleach på forskellige satser under de samme imaging forhold. Det ville derfor være ideel til at vurdere omfanget af fotoblegning af fluoroforen anvendes i en bestemt eksperiment. Til FM-farvestoffer i levende nerveender, er det teknisk udfordrende at vurdere fotoblegning sats uafhængigt af synaptisk aktivitet, på grund af spontan eller miniature synaptisk aktivitet. Et fald i fluorescens-intensiteten i en sådan Aktivitety kan skyldes den biologiske tab af FM-farvestoffer (exocytose), fotoblegning FM farvestoffer, eller begge dele. Heldigvis er de strukturer kan rettes FM farvestoffer designet til at være næsten identiske med de af de nonfixable FM farvestoffer. I protokollen beskrevet her, blev der kan rettes FM farvestoffer indlæst i synaptiske vesikler af de samme metoder som nonfixable FM farvestoffer, mens den synaptiske aktivitet blev blokeret bagefter ved kemisk fiksering af prøven. Især antallet af fotoblegning målt ved hjælp af dette system var så lav som 2-3% i løbet af 2 min, når de billeddannende betingelser var de samme som dem, for live-cell imaging 19.

FM farvestoffer kan bruges med forskellige protokoller til at undersøge forskellige aspekter af synaptiske vesikel genanvendelse. Forskellige synaptiske aktiviteter under farvning og affarvning kan kombineres på forskellige måder, afhængigt af de eksperimentelle mål og særlige træk ved synaptisk vesikel genanvendelse, der skal vurderes. Udvælgelsen af ​​antagonister afhænger også af formålet med forsøgene. Desuden kan FM billedbehandling udføres under farvningen fasen samt under Affarvningsopløsningen fase 9,18,42. Det skal også erindres, kan imidlertid FM farvestoffer have uventede effekter, såsom at blokere de muskarine acetylcholin receptorer 43, og gennemtrænger de mechanotransducer kanalerne 44, gemme betjente Ca 2 + kanaler 45, og ATP receptorer 46.. Høje koncentrationer af FM farvestoffer kan potentielt ændre effektiviteten af synaptisk vesikel exocytose selv 47. Vi anbefaler derfor forsigtighed i at designe eksperimenter og fortolkningen af ​​resultaterne vedrørende synaptiske vesikel genbrug. Supplerende metoder til at overveje vil omfatte optagelse i synaptiske vesikler af antistoffer, hvis epitoper er intra-lumenal domæner af vesikel proteiner 22,48. De omfatter også udtrykke pH-følsomme GFP varianter målrettet til vesikel lumen 49-51, og optagelsepH-følsomme antistofkonjugater 52-54 begge detekterer intra-vesikulære pH-ændringer, der ledsager exo-endocytose.

Når sådanne uønskede virkninger er udelukket, FM-farvestoffer har brede anvendelser. For eksempel kan de bruges til at løse, om de samme synaptiske vesikel pools deles til spontane og fremkaldte vesikel frigiver 17,55, i hvilket omfang effektiviteten af synaptisk vesikel genbrug kan reguleres 56,57, og hvilke effekter gør en tidligere tilstand (hvile eller stimuleret) udøve på senere tilstand af vesikel genbrug baseret på fx spontan og miniature synaptisk aktivitet. FM farvestoffer kan også anvendes til at evaluere synaptiske vesikel genanvendelse på ultrastrukturelle niveau, ved at korrelere observationer fra lys og elektronmikroskopi af FM fotoomdannelse metode 30,58-62. FM farvestof kan anvendes til samtidigt at overvåge synaptiske funktioner og intracellulær Ca2 + concentrering 5.. Ud over mærkning af synaptiske vesikler, FM farvestoffer og andre fluorescerende væske-fase markører, såsom fluorescerende dextran 7 kan anvendes til at følge størstedelen endocytose, der er udløst af en intens neuronal aktivitet. Afslutningsvis anvendelser af FM farvestoffer giver en uvurderlig kilde til information om synaptisk vesikel genbrug og yderligere synaptiske funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker medlemmerne af Harata laboratorium til nyttige diskussioner hele udførelsen af ​​dette arbejde. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra American Heart Association, dystoni Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, National Science Foundation, og Whitehall Foundation til NCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Neuroscience Præsynaptiske Terminals Synaptic Blærer mikroskopi Biologisk Assay nervesystem Endocytose exocytose fluorescensimagografi FM farvestof neuron fotoblegning
Undersøgelse af synaptiske vesikel Genbrug Brug af FM Farvestoffer Under Evoked, spontan, og Miniature Synaptiske aktiviteter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J.… More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter