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Neuroscience

El examen de la vesícula sináptica Reciclaje utilizando tintes FM Durante Evocados, espontánea, y actividades sinápticas miniatura

Published: March 31, 2014 doi: 10.3791/50557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

Summary

Se describe el uso de colorantes de estirilo FM a la imagen de reciclado de vesículas sinápticas en las terminales nerviosas funcionales. Este protocolo se puede aplicar no sólo a evocada, sino también espontánea y actividades sinápticas en miniatura. El protocolo se expande la variedad de eventos sinápticas que pueden ser evaluados de manera eficaz.

Abstract

Las vesículas sinápticas en las terminaciones nerviosas funcionales sufren exocitosis y endocitosis. Este reciclaje de vesículas sinápticas puede ser analizada de manera efectiva el uso de tintes estirilo FM, que revelan el volumen de negocios de la membrana. Protocolos convencionales para el uso de colorantes FM fueron diseñados para el análisis de las neuronas siguiente estimulada (evocado) la actividad sináptica. Recientemente, los protocolos se han hecho disponibles para el análisis de las señales de FM que acompañan las actividades sinápticas más débiles, como los eventos sinápticas espontáneas o en miniatura. El análisis de estos pequeños cambios en las señales de FM requiere que el sistema de formación de imágenes es lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en la intensidad, sin embargo, que los cambios de artefactos de gran amplitud se suprimen. Aquí se describe un protocolo que se puede aplicar a evocado, espontánea, y actividades sinápticas en miniatura, y el uso de las neuronas del hipocampo en cultivo como un ejemplo. Este protocolo también incorpora un medio de evaluar la tasa de fotoblanqueo de tintes FM, ya que es un importantefuente de artefactos cuando se generan imágenes pequeños cambios en la intensidad.

Introduction

La funcionalidad de las vesículas sinápticas es un determinante importante de la transmisión sináptica. Estas vesículas liberan neurotransmisores cuando se fusionan con la membrana plasmática presináptica (exocitosis), y se convierten listo para otro ciclo de la liberación después de ser regenerado a partir de la membrana plasmática (endocitosis) y cargado nuevamente con neurotransmisores. La investigación sobre la dinámica de los mecanismos subyacentes y el reciclado de la vesícula sináptica se ha acelerado en gran medida por la introducción de colorantes estirilo FM 1. Estas moléculas anfipáticas, que se carga positiva grupos de cabeza hidrófilos y colas hidrofóbicas (múltiples colorantes en la Figura 1A, stereoview de FM1-43 en la Figura 1B), de forma reversible pueden entrar y salir de las membranas lipídicas y sin los impregna. Grupos de tintes FM comparten características similares que influyen en el rango de la luz que emiten. Por ejemplo, FM2-10, FM1-43, y FM1-84 tienen un doble enlace entre dos compuestos cíclicos y Shoemisión verde w. La diferencia entre ellos es la longitud de la cola hidrófoba, que determina su hidrofobicidad y por lo tanto la tasa de salida de la membrana (departitioning). En los casos de FM5-95 y FM4-64, tres dobles enlaces enlazan los compuestos cíclicos, y que muestran emisión de color rojo. Estos colorantes difieren con respecto a sus partes hidrófilas. En todos los tintes de FM, la intensidad de fluorescencia aumenta cuando se insertan en las membranas biológicas, debido a un aumento en el rendimiento cuántico en el entorno hidrófobo en relación con el medio ambiente hidrofílico. Por lo tanto los cambios en la intensidad de FM representan los cambios en el volumen de negocios membrana. Los diferentes colores (espectros de emisión) y hidrofobicidades hacen la FM tiñe una herramienta de investigación versátiles en el reciclado de vesículas sinápticas.

Sobre la base de estas características, los colorantes FM se utilizan sobre todo de acuerdo con el siguiente esquema en el análisis de reciclado de la vesícula sináptica (Figura 2). Neuronas son bañadas en una solución extracelular que contiene el colorante FM, lo que le permite ser tomado en vesículas sinápticas (SVS), ya que forman a través de la endocitosis (manchas). El colorante se lava entonces a cabo mediante la aplicación de una solución extracelular libre de colorante, lo que revela las terminales nerviosas funcionales, es decir, sólo aquellos sometidos a endocitosis activamente contendrá un grupo de vesículas sinápticas que se cargan con el colorante (Figura 2 abajo). Exocitosis subsiguiente conduce a la pérdida del colorante de FM para el espacio extracelular y una pérdida concomitante de la fluorescencia (decoloración; debido tanto a la departitioning a un entorno hidrófilo y difusión lejos del sitio de la exocitosis). Por lo tanto los cambios en la intensidad de fluorescencia de FM son indicadores de la vesícula sináptica exo-y endocitosis.

Colorantes FM se han utilizado para manchar y destain las vesículas sinápticas en diversos organismos y preparaciones 2,3. Los ejemplos incluyen neur mamíferosculturas onal 4-9, rodajas de cerebro de mamíferos 10,11, 12,13 uniones neuromusculares, neuronas bipolares de la retina 14,15, y las células ciliadas de la cóclea 16.

Normalmente, en este tipo de experimentos, tanto de tinción y decoloración son provocados por la estimulación de las neuronas extensivamente (actividad evocada). Recientemente, sin embargo, el reciclado de vesículas sinápticas en respuesta a la estimulación débil también ha sido analizado, como tiene el reciclaje en ausencia de un estímulo externo (la actividad sináptica espontánea y miniatura) 9,17-19. Actividades sinápticas espontáneas y en miniatura se definen como los que ocurren en ausencia de estímulos externos, con el primero que implica la activación espontánea de los potenciales de acción (Figura 3). Estas actividades sinápticas débiles se asocian con cambios más pequeños en las señales de FM que los desencadenados por la extensa estimulación. La medición requiere que los cambios en colg FMintensidad rencia refleja con exactitud la exocitosis de vesículas sinápticas o endocitosis pero los cambios no artifactual en intensidad. Una de las causas del artefacto es la presencia de tinción no específica de la membrana plasmática por los colorantes FM. Lavado gradual de este componente dará lugar a un cambio gradual en la intensidad de fluorescencia medida, que se atribuye erróneamente a las actividades sinápticas. Este factor se puede reducir por métodos apropiados (véase el Protocolo). La causa más notable del artefacto es el fotoblanqueo de colorante de FM retenido dentro de vesículas sinápticas. Los cambios relacionados con photobleaching-en la intensidad de FM deben ser pequeños en comparación con los biológicos (sinápticas) los cambios que se miden. El reciente desarrollo de cámaras sensibles, por ejemplo, la cámara del dispositivo de acoplamiento de carga de electrones multiplicando (EMCCD), hace que sea posible para reducir al mínimo photobleaching acortando el tiempo de exposición y el debilitamiento de la intensidad de la luz usada para excitar el fluoróforo. Otra causa del artefacto es un i driftn el nivel de enfoque de microscopio de luz. La deriva de enfoque durante una sesión de formación de imágenes puede ser causada por efectos mecánicos o térmicos, y se erróneamente conducir a un cambio en la intensidad de fluorescencia medida.

Aquí se describen los protocolos y equipos que hacen posible el uso de colorantes FM para analizar el reciclado de vesículas sinápticas incluso en el contexto de débil o ninguna estimulación, en particular, la actividad sináptica en miniatura. Mostramos ejemplos de la tinción y decoloración de las vesículas sinápticas durante los eventos evocados y espontáneos, utilizando neuronas del hipocampo de roedores cultivadas, y formación de imágenes de la fase de decoloración. También demostramos cómo evaluar el grado de FM tinte fotoblanqueo, en ausencia de cualquier pérdida de colorante FM debido a las actividades sinápticas.

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Protocol

1. Cultivo primario de neuronas de cerebro de los mamíferos

Todos los animales procedimientos realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité de la Universidad de Iowa Institucional Cuidado de Animales y el uso.

  1. Preparar el cultivo de células disociadas de las regiones CA3-CA1 del hipocampo de ratones o ratas en los días postnatales 0-1 19,20. Placa de las células del hipocampo en cubreobjetos de 12 mm (espesor número 0) preconfiguradas con la capa alimentadora glial de rata, en placas de 24 pocillos, y a una densidad de 12000 células / pocillo.
  2. Cultura de las neuronas del hipocampo durante por lo menos 8 días para las terminales nerviosas funcionales para el desarrollo 21. Utilizamos las neuronas en 11-14 días in vitro cuando las terminaciones nerviosas individuales son relativamente aislada y sin mucho clustering. Las neuronas pueden ser utilizados para experimentos aproximadamente en 21-28 días in vitro por ejemplo Willig et al. 22 y Nosyreva y Kavalali 23.
  3. Paraestudios funcionales, evaluar cubreobjetos (antes de la tinción) para los indicadores de las neuronas sanas utilizando microscopía de luz transmitida (por ejemplo, la óptica de contraste de fases con un aumento de 10-20X). Los indicadores de buena salud incluyen: una capa uniforme de células gliales, un claro margen de celular alrededor de las neuronas, dendritas extendidas sin estructuras de cuentas, la falta de somata agrupado, y la falta de neuritas en paquete.

2. Cargando las vesículas sinápticas con el tinte FM (tinción)

  1. La tinción debido a la actividad sináptica evocada por la estimulación de campo eléctrico (se refiere a los potenciales de acción)
    1. Prepare manchando solución 1 añadiendo el colorante FM a una solución libre de tinte a base de HEPES, por ejemplo, solución de Tyrode (Vea las soluciones para más detalles). La concentración de colorante de FM es 10 M FM1-43 y 2,5 M FM4-64. Rangos de concentración típicos son: 2-15 M FM1-43, o 2,5 a 20 mM FM4-64 3,6. Para los experimentos que requieren la supresión de la recurrentela actividad sináptica glutamatérgica y la inducción de la plasticidad sináptica, añaden más antagonistas de los receptores de glutamato ionotrópicos: los receptores de AMPA (por ejemplo, 10 mM CNQX) y los receptores de NMDA (por ejemplo, 50 M AP5).
    2. Transferencia de un cubreobjetos con las células del medio de cultivo a la cámara de formación de imágenes rellenada previamente con solución de Tyrode normal. Utilizamos una cámara de formación de imágenes con los electrodos de estimulación conectados a las paredes laterales (hilos de platino separados por 6,3 mm, RC-21BRFS). Esta cámara está diseñada como una cámara de imágenes cerrado, pero lo utilizan como una cámara abierta (es decir, sin un cubreobjetos superior), con un volumen de baño de ~ 200 l. Durante la transferencia, no exponga las células cultivadas al aire, y evitar pellizcar las células cultivadas con las pinzas (recoger el cubre desde el perímetro en lugar de cerca del centro).
    3. Perfundir la cámara de formación de imágenes con solución de Tyrode normal a temperatura ambiente (23-25 ​​° C).
    4. Aplicar la tinción de solución 1 por la coperfusión nStant.
    5. Evocar la actividad sináptica mediante la aplicación de pulsos eléctricos. Para la tinción máxima de la reserva total de reciclado de vesículas sinápticas en las neuronas del hipocampo, estimular los cultivos a 10 Hz para 60 a 120 seg 24. Al tratar de lograr la máxima eficacia de la estimulación de campo, mantener varias características en mente. 1) La altura de la solución del baño debe ser tan baja como sea posible, mientras se mantiene las neuronas y la estimulación de electrodos totalmente sumergidos en una capa delgada de solución de Tyrode (en el fin de mantener las neuronas vivas y para obtener un campo eléctrico homogéneo). 2) Intensidad de la corriente y la duración deben ser optimizados usando un indicador de la excitabilidad neuronal, por ejemplo, fluorescente de Ca 2 + de formación de imágenes, en nuestro caso, una corriente constante de 30 mA de intensidad y 1 mseg de duración da resultados fiables. 3) La solución del baño se debe aplicar a flujo constante durante la estimulación; la estimulación eléctrica conduce a la electrólisis, hace que los protones (H por ejemplo Hanks con rojo fenol).
    6. Deje las neuronas en solución de tinción 1 para un 60 segundos adicionales después de la estimulación de campo se termina, por lo que la endocitosis post-estímulo se completará 25.
    7. Lavar la solución de tinción fuera de la cámara de imágenes por perfusión con solución de lavado 1, la solución de Tyrode libre de tinte más antagonistas de los receptores AMPA y NMDA (véase la sección 2.1.1), y un bloqueador de los canales de Na + dependientes de voltaje ( por ejemplo, 0,5-1 M tetrodotoxina, TTX). La combinación de bloqueadores suprimirá la pérdida de tinte de FM a través de la actividad sináptica espontánea. Para maximizar la eficacia de lavado, aumentar la tasa de perfusión (<em> por ejemplo, hasta 5-6 ml / min) durante 1-2 minutos, y añadir un bolo (por ejemplo, 1 ml) de la solución de lavado 1 directamente a la cámara de imágenes abierta manualmente, utilizando una pipeta. Control de la fuerza y ​​la dirección de la infusión manual, a fin de no perturbar las neuronas cultivadas.
  2. La tinción debido a la actividad sináptica evocada por solución de alto K + (no implica potenciales de acción).
    1. Preparar la tinción solución 2, añadiendo el colorante FM para la solución de alto K + Tyrode. Específicamente, preparar una solución de Tyrode modificada con 45 mM de KCl, por sustitución equimolar de KCl para el NaCl. Si es necesario, añadir antagonistas de los receptores AMPA y NMDA. Esta solución de alto K + despolarizará neuronas de forma continua, permitirá Ca 2 + afluencia en las terminaciones nerviosas, e iniciar la exocitosis de vesículas sinápticas en la medida máxima 26. Las concentraciones más altas (70-90 mm) también fueron utilizados en otros informes ejemplo Klingauf et al. 27 und Richards et al. 28
    2. Transferencia de un cubreobjetos con neuronas cultivadas del medio de cultivo a la cámara de formación de imágenes rellenada previamente con solución de Tyrode normal.
    3. Tinción de las neuronas a temperatura ambiente durante 1-2 minutos mediante la aplicación de solución de tinción 2 en la perfusión constante o usando una pipeta de 26,28. En este último caso, la concentración de colorante final debe ser controlada mediante la adición de un volumen conocido de solución de tinción 2 para un volumen conocido de solución de colorante libre.
    4. Lavar la solución de tinción fuera de la cámara de imágenes, tal como se describe en la sección 2.1.7.
  3. La tinción debido a la actividad sináptica espontánea y miniatura.
    1. Precaliente solución basada en bicarbonato (por ejemplo, medio esencial mínimo, MEM) a 37 º C colocando en la incubadora de cultivo de más de 60 min.
    2. Para la tinción basado en la actividad sináptica espontánea, preparar la solución de tinción 3 mediante la adición de colorante de FM a MEM. Para la tinción basado en miniature actividad sináptica, preparar la solución de tinción 4 añadiendo TTX para la solución de tinción 3.
    3. Neuronas de la mancha mediante la transferencia de un cubreobjetos con neuronas cultivadas del medio de cultivo a las manchas solución de 3 o 4, y dejándolos en la misma solución de tinción a 37 ° C durante 10 min.
    4. Enjuague el cubreobjetos brevemente en la solución de lavado 1.
    5. Transferir el portaobjetos a la solución de lavado 1 en una cámara de imágenes. Tenga en cuenta lo siguiente. 1) Las células no deben ser expuestos al aire, y si es necesario, transfiera el cubre directamente a la cámara de imágenes sin enjuagar. 2) Las neuronas se pueden teñir a temperatura ambiente mediante la sustitución de la solución de tinción 3 o 4 con una solución a base de HEPES. 3) Las neuronas pueden ser teñidas para la actividad sináptica evocada en el contexto de la solución de alta-K + utilizando este método, mediante la sustitución de la solución de tinción 3 o 4 con solución de tinción 2 y llevar a cabo los pasos restantes a temperatura ambiente.
    6. Lavar la solución de tinción de la proyección de imagencámara como se describe en la sección 2.1.7.

3. Lavar el colorante FM

  1. Después de la tinción neuronal y lavado inicial por cualquiera de los métodos descritos anteriormente (sección 2.1.7), continuar para perfundir la cámara de formación de imágenes con solución de lavado 1 durante 5-10 min a temperatura ambiente. Esto eliminará el colorante de FM de la membrana plasmática y la solución extracelular. En el caso de nuestra cámara de imágenes, la tasa de perfusión del baño es 600-1.200 l / min. El lavado también puede llevarse a cabo en ausencia de Ca2 + extracelular para suprimir FM pérdida de colorante debido a las actividades sinápticas 17. Los lavados se pueden mejorar mediante una breve aplicación de ADVASEP-7, una ciclodextrina modificada que sirve como un eliminador de colorantes FM de la membrana plasmática 29-31. Es crucial para mantener cualquier ADVASEP-7 la exposición a corto (por ejemplo, 5 segundos en el caso de cultivo en monocapa) para evitar tanto la reducción de la intensidad de los puntos lagrimales FM 31 y comprometer la Ley de Educación SuperiorLTH de las células. La fluorescencia de FM1-43 en la membrana de plasma también puede ser suprimida por una aplicación de un extintor sulforodamina 101 (50-100 M) que no entra en las vesículas sinápticas 32.

4. La búsqueda de un campo óptimo de imagen durante el lavado

  1. Verifique que las células en el campo para ser fotografiados son saludables, utilizando microscopía de luz transmitida con un lente objetivo de gran aumento y de alta numérica-apertura (por ejemplo, 40X). Desde esta sección, seguimos utilizando un microscopio invertido (Eclipse Ti, Nikon) equipado con contraste de fase o óptica de contraste de interferencia diferencial. Este microscopio está equipado con sistema de enfoque perfecto (PFS), que permite la corrección de enfoque continuo en tiempo real, lo que supera el microscopio enfoque deriva. Esta característica es esencial para time-lapse durante decoloración con el mismo plano de enfoque.
  2. Verifique que la tinción fue eficaz, mediante el uso de la óptica de fluorescencia. Avda.agregados liminoides de puntos lagrimales FM a menos que sean objeto de la investigación, porque boutons individuales serán difíciles de discernir. Preste atención a las formas de los puntos lagrimales FM: si la mayoría de los boutons teñidas aparecen como collares de cuentas circulares, podrían representar las terminaciones nerviosas no saludables. Minimizar la exposición de las neuronas a una fuerte excitación de fluorescencia con el fin de evitar photobleaching.

5. Descarga de FM tinte del sináptica vesículas (Decoloración)

  1. Decoloración debido a la actividad sináptica evocada por la estimulación de campo eléctrico.
    1. Lavado TTX a cabo por perfusión de las neuronas extensamente con una solución de lavado 2 (igual que la solución de lavado 1 pero sin TTX). Confirmar la eficacia de TTX de lavado en experimentos separados, utilizando los mismos parámetros de lavado (tasa de perfusión y duración), por ejemplo, por fluorescente de Ca 2 + de formación de imágenes de Ca citoplasmáticos 2 + transitorios inducidos por la estimulación de campo, o por grabación de patch-clamp de voltioscorrientes dependientes de la edad de Na +.
    2. Iniciar la imágenes de los colorantes FM. Para obtener imágenes FM1-43 o FM4-64, utilice 520 nm o 650 nm filtros de emisión pase largo, respectivamente, y un filtro de excitación 490 nm. Adquirir imágenes cada 1-2 segundos, con un tiempo de exposición corta (por ejemplo, 10-20 ms), la intensidad de excitación débil (por ejemplo, 5 a 10% de la energía del LED), y alta sensibilidad (por ejemplo, con el aumento de EM). Minimizar fotoblanqueo de los colorantes FM mediante la reducción de tiempo de exposición y la intensidad de excitación de fluorescencia. Minimizar el microscopio enfoque deriva activando el sistema de enfoque perfecto.
    3. Estimular las neuronas en la solución de lavado 2, utilizando el campo-estimulación (por ejemplo a 10 Hz durante 120 segundos) 20.
    4. Aplicar múltiples rondas de estimulación, con periodos de descanso de 1-2 minutos, para agotar todas las vesículas sinápticas reciclaje de tinte FM. Esto es importante para determinar la dimensión de la reserva total de reciclado de las vesículas sinápticas que se tiñeron con tintes FM en the estado previo 20,33.
  2. Decoloración debido a las actividades sinápticas evocada en ausencia de potenciales de acción.
    1. Iniciar la obtención de imágenes del colorante de FM.
    2. Aplicar los reactivos estimulantes disueltos en la solución de lavado 1 o 2. Tales reactivos incluyen: KCl (solución de alto K +, por ejemplo, 45 mM) 26, ionomicina (un ionóforo de Ca 2 + intracelular que eleva la concentración de Ca2 + al permitir Ca 2 + afluencia en la célula de la solución extracelular, por ejemplo, se utiliza en 5 M) 20,34, y sacarosa (una solución hipertónica que estimula la liberación de las vesículas sinápticas de la piscina fácilmente liberable, por ejemplo, utilizado en 500 mM) 35,36. Utilice un sistema de perfusión rápida, local para un control temporal fiable en la aplicación de los reactivos, por ejemplo, el sistema SF-77B de Instrumentos de Warner 37, o el sistema Y-tubo de 38 a 40.
  3. Decoloración debido a la espontánea y miniature la actividad sináptica.
    1. Por decoloración debido a la actividad sináptica espontánea, lavar la TTX que el anterior (sección 5.1.1), utilizando la solución de lavado 2. Comience imágenes de los tintes FM mientras perfusión neuronas con solución de lavado 2. Por decoloración debido a las actividades sinápticas en miniatura, comience imágenes de los tintes de FM, sin dejar de perfundir las neuronas con solución de lavado 1 (con TTX).
    2. Después de la decoloración se deben basada en la actividad, ya sea espontánea o miniatura, identificar las terminales nerviosas funcionales por medio de decoloración actividad sináptica evocada. La actividad puede ser evocado por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Este proceso de identificación es necesaria porque las estructuras teñidas pueden ser aquellos que no sean los terminales nerviosas funcionales (por ejemplo, el reciclaje lentamente endosomas o vesículas astrocíticos) y una gran cantidad de decoloración por las ayudas de actividad evocada en este proceso.

6. Evaluación del Cambio Photobleaching de tintes FM

  1. Teñir las terminales nerviosas con tinte FM-aldehído puede arreglar (por ejemplo, FM1-43FX, FM4-64FX). Esto puede hacerse usando el, método de tinción espontánea, o miniatura evocado descrito anteriormente, y mediante la sustitución de tinte de FM con un colorante de FM se puede fijar.
  2. Lavar el colorante FM corregible, como se describe en la sección 2.1.7.
  3. Fijar químicamente las neuronas mediante la transferencia de la cubreobjetos a la solución de fijación: 4% de paraformaldehído y 4% de sacarosa en solución de Tyrode durante 30 min a 4 ° C. La intensidad de la fluorescencia del colorante de FM se puede fijar será retenido después de la fijación química.
  4. Lavar el fijador durante 10 minutos en solución de Tyrode, mediante la transferencia del cubreobjetos a la solución de Tyrode fresco dos veces.
  5. Transferir el cubreobjetos en solución de Tyrode fresco en la cámara de formación de imágenes.
  6. Comience imágenes del colorante FM corregible utilizando el mismo conjunto de parámetros de imagen como para las neuronas vivas. Es importante enjuagar la cámara de imágenes muy bien después de usar cualquier espécimen fijos químicamente, porquecualquier fijador restante puede afectar a posteriores experimentos de imagen de células vivas que se realizan en la misma cámara. Como alternativa a la formación de imágenes de células fijadas, las células vivas manchadas pueden obtenerse imágenes para determinar el porcentaje fotoblanqueo. Sin embargo, vale la pena tener en cuenta que es difícil para bloquear la actividad sináptica en miniatura de forma aguda, por ejemplo, la frecuencia de la actividad en miniatura puede ser reducido a ~ 50% mediante la eliminación de la Ca2 + extracelular 23, pero no es una completa bloqueo.
  7. Al final de cada sesión de formación de imágenes, adquirir una imagen de fondo para evaluar el valor absoluto de la intensidad de fluorescencia de FM. La intensidad de los puntos lagrimales FM representa no sólo la señal verdadera de los tintes de FM en las terminaciones nerviosas, sino también el ruido de fondo de 1) las células gliales que subyacen en la cultura monocapa neuronal, 2) el cubreobjetos y los componentes ópticos (lentes ejemplo objetiva, filtros y espejos), y 3) el detector (cámara EMCCD). El ruido de fondo es assessed en regiones nonstained del campo de imagen. Cuando tales regiones están limitados en el espacio o heterogénea en intensidad, sustituirlo con una imagen con el obturador de la cámara cerrada y adquirir el ruido del detector, aunque no es un método ideal. Adquirir aproximadamente 10 imágenes utilizando los mismos parámetros de imagen.

7. Análisis de Imagen

  1. Importe los datos adquiridos en el software de análisis de imágenes como una pila de imágenes de series de tiempo. Utilizamos ImageJ (WS Rasband, NIH) y los plug-ins asociados, por ejemplo, estabilizador de imagen plug-in (Kang Li) para corregir un pequeño grado de movimiento entre los puntos lagrimales FM, y la serie Time Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) para analizar la serie temporal.
  2. Calcular los cambios en la intensidad de FM al comienzo y al final de la serie (ΔFM). Para este fin, un promedio de las imágenes antes del inicio de decolorante y después del final de decolorar (por ejemplo 5 cuadros de imagen cada uno), y generar una imagen de diferencia por subtracting ellos.
  3. Identificar las terminales nerviosas potencialmente funcionales mediante la aplicación de un umbral de intensidad de la imagen de diferencia, y detectar los píxeles con intensidades son más altos que el umbral. Un método de establecer el umbral es elegir la desviación estándar de la intensidad de fondo obtenida a partir de la zona cubreobjetos desnudo.
  4. Identificar las terminales nerviosas aisladas y funcionales como los píxeles contiguos que se detectaron y que satisfacen un criterio de tamaño (número mínimo y máximo de los píxeles de la contigüidad). Este proceso elimina el ruido de fondo y las terminales nerviosas agregados de análisis.
  5. Asigne regiones-de-interés (ROI) en los grupos de píxeles detectados (con los distintos grupos que corresponden a las terminaciones nerviosas individuales). El cambio total en intensidad durante decoloración (ΔFM) es un parámetro característico de análisis. Esto representa la cantidad acumulada de la actividad sináptica evocada, espontánea o en miniatura. Excluir ROIs si presentan cualquiera de los siguientescambios en la intensidad en función de los propósitos de los experimentos: un aumento durante la grabación, una disminución repentina antes de la estimulación, o una larga latencia después de la estimulación.
  6. Evaluar la tasa de fotoblanqueo importando los datos de series temporales adquiridos en el software de análisis de imágenes. Promediar las imágenes de fondo (por ejemplo, con un obturador cerrado), y restar de las imágenes individuales. Asigne ROIs para puncta FM que supuestamente corresponden a las terminaciones nerviosas, y medir los cambios en la intensidad de ROI en el tiempo.

Soluciones

  1. Solución de Tyrode
    • Composición (en mM): 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 glucosa, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Solución colorante 1
    • De solución más el colorante de FM de Tyrode.
    • Esta solución se utiliza para la tinción, basado en la actividad sináptica evocada por la estimulación eléctrica.
    • Agregue los antagonistas de los receptores AMPA y NMDA receptoCódigo de producto si es necesario.
  3. Solución colorante 2
    • La solución de K + de alta Tyrode más el colorante de FM.
    • Esta solución de Tyrode modificada se prepara mediante el aumento de la concentración de KCl a 45 mM, por sustitución equimolar de KCl para el NaCl.
    • Esta solución se utiliza para la tinción, basado en evocado la actividad sináptica por despolarización continua.
    • Añadir los antagonistas de los receptores de AMPA y los receptores de NMDA si es necesario.
  4. Solución colorante 3
    • Solución MEM más el colorante de FM.
    • Esta solución se utiliza para la tinción, basado en la actividad sináptica espontánea.
  5. Solución colorante 4
    • Solución MEM más el colorante FM y TTX.
    • Esta solución se utiliza para la tinción, basado en la actividad sináptica en miniatura.
  6. Enjuague la solución 1
    • Solución de Tyrode más los antagonistas de los receptores de AMPA y los receptores de NMDA, y TTX.
  7. Enjuague la solución 2
    • Solución de Tyrode más los antagonistas de los receptores de AMPA y los receptores de NMDA, pero sin TTX.

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Representative Results

A modo de ejemplo, mostramos los resultados representativos de la evolución en el tiempo de decoloración de las vesículas sinápticas (Figura 4). Las neuronas del hipocampo cultivadas se tiñeron con FM4-64 utilizando la actividad sináptica espontánea (paso 2,3) y se lavaron con solución libre de colorante (solución de lavado 2). La imagen muestra el curso inicial de tiempo de decoloración utilizando la actividad espontánea (paso 5.3) (parte inicial de la línea continua de la Figura 4A). Esto es seguido por el transcurso de tiempo de decoloración utilizando tres rondas de actividad evocada con 10 Hz estimulación de campo de 120 seg cada uno (paso 5.1). Una forma de medir la cantidad de decoloración provocada se ilustra con una flecha de dos puntas (ΔFM Evocados) que corresponda con el tamaño del conjunto total de reciclado de las vesículas.

Antes de que se le dio el primero de estímulo, se produjo una disminución gradual de la intensidad de FM (ampliada en la figura 4B). Esta disminución se compone de destainingdebido a la actividad sináptica espontánea (ΔFM SPONT) y photobleaching (ΔFM PB). Cuando la contribución de fotoblanqueo es pequeña, el cambio desde la línea base preimaging (ΔFM SPONT + ΔFM PB) se puede utilizar como una aproximación a la cantidad de decoloración de la actividad espontánea.

Figura 1
Figura 1. Estructuras de tintes FM. A. FM tintes comparte algunas características estructurales comunes. Los grupos hidrófilos permanecen en solución acuosa y las colas hidrófobas permiten que los colorantes FM a dividirse en la membrana. FM2-10, FM1-43 y FM1-84 muestran emisión verde, mientras FM5-95 y FM4-64 muestran la emisión desplazada al rojo. B. Stereoview de FM1-43, el colorante FM más utilizado. Grupo hidrófilo esté hacia arriba y las colas hidrofóbicas estén mirando hacia abajo. Nitrátomos de fibrinógeno son de color azul. Por otra vista de FM1-43, consulte Schote y Seelig 63.

Figura 2
Figura 2. Esquema básico de uso de colorante de FM. Después de la aplicación a las neuronas, el colorante de FM insertado en la membrana plasmática se vuelve fluorescente (verde), mientras que en la solución acuosa es mucho menos fluorescente (gris). Una vesícula sináptica (SV) se carga (teñida) por el tinte FM, cuando se somete a la endocitosis, por lo general después de la exocitosis. El lavado de la tintura FM en solución extracelular permite sólo las vesículas teñidas para ser fluorescente. Posteriormente, una vesícula sináptica se descarga (destained) cuando se somete a la exocitosis y por lo tanto libera el colorante de FM. Una imagen de abajo muestra una tinción ejemplar de las neuronas del hipocampo en cultivo con FM1-43 (una superposición de fluorescencia y de fase imágenes de contraste). Es de señalar que, en el protocolo que se describe en este documento, los puntos lagrimales fluorescentes representan presináptica terminales nerviosas (diámetros ~ 1 micras en las neuronas centrales típicos) con grupos de vesículas sinápticas manchadas, no las vesículas sinápticas individuales (diámetros ~ 40 nm). Para simplificar, en este esquema representa una idea general de exo-endocitosis de las vesículas sinápticas. Puede incluir múltiples formas de exo-endocitosis, como la fusión colapso completo seguido por endocitosis mediada por clatrina, el transitorio kiss-and-run exo-endocitosis, y la endocitosis mayor 64. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 3
Figura 3. Tres tipos de actividades sinápticas estudiados por formación de imágenes de FM. Actividad sináptica evocada por lo general requiere, estímulos eléctricos externos. La actividad sináptica espontánea se produce en ausencia de estímulos eléctricos. Actividad sináptica miniatura se produce de forma espontánea y sin estímulos eléctricos y sin potenciales de acción: por lo general el potencial de generación de la acción es suprimida por un bloqueador de voltaje dependiente del canal de Na +, la tetrodotoxina. Actividades adicionales incluyen la actividad evocada cuando la exocitosis se estimula por la solución de alta-K + (despolarización continua), ionomicina (aumento continuo en citoplasmática concentración de Ca2 +), y la solución hipertónica que contiene sacarosa (la obtención de la exocitosis de vesículas en la piscina fácilmente liberable), todos los cuales no requerirá de disparo del potencial de acción de las vesículas sinápticas que someterse a exocitosis. Tenga en cuenta que, en algunos estudios, la actividad espontánea se define ampliamente para incluir la actividad en miniatura también.

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Figura 4. Resultado representativo de decoloración. A. neuronas del hipocampo cultivadas se tiñeron por actividad espontánea con 2,5 M FM4-64 durante 10 min a 37 ° C (etapa 2.3), y se lavaron (Protocolo 3). Las neuronas fueron imágenes durante la decoloración se deben a la actividad espontánea (paso 5.3), y tres rondas de actividades evocados (paso 5.1) (curva continua, promedio de n = 25 terminales nerviosas). Las barras verticales representan SEM. El eje Y representa la intensidad absoluta de FM y "0" representa la intensidad cuando un obturador de la cámara se cierra. La cantidad total de decoloración provocada se indica (ΔFM Evocados). B. Una vista de la fase inicial de la decoloración en el panel A (curva continua, SEM bares omitidas para mayor claridad) se expandió. Durante una observación de 60 segundos, la detenedora se debió principalmente al acto espontáneoividad (ΔFM SPONT), pero fue en parte debido a photobleaching (ΔFM PB). El curso temporal fotoblanqueo de FM4-64 (curva de puntos de espesor) se determinó en un experimento separado por formación de imágenes se puede fijar FM4-64 (Protocolo 6). La tasa fue de 2-3% durante 2 min (una sola función exponencial con una constante de tiempo de 5736 seg, determinada por los accesorios en 9 min curva) 19. La curva de fotoblanqueo se dibuja como una función exponencial con un valor inicial equivalente a la de la intensidad medida de FM4-64. Ver Figura S5 suplementaria en Kakazu et al. 19 para el fotoblanqueo durante el período más largo (9 min), y con una intensidad de excitación variable y tiempo de exposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos descrito protocolos para la tinción y la decoloración se deben vesículas sinápticas en respuesta a evocado, la actividad sináptica espontánea y miniatura, y para formación de imágenes durante la fase de decoloración. Además de los protocolos existentes, se ha incluido un nuevo protocolo de observación de la decoloración FM basado en la actividad sináptica en miniatura. El uso de estos protocolos, hemos identificado previamente anormalidades en las neuronas cultivadas a partir de un modelo de ratón de la distonía trastorno del movimiento. En comparación con sus homólogos en ratones de tipo salvaje, esas neuronas fueron sometidos aceleraron exocitosis de vesículas sinápticas en un 2 + de manera dependiente de Ca mediante la estimulación de alta actividad 20. Esas neuronas mostraron también más frecuente la actividad sináptica en miniatura, como lo confirma-patch clamp grabaciones electrofisiológicas de la liberación de neurotransmisores 19.

El aspecto fundamental del protocolo para el uso de tintes FM en este tipo de análisis es ASSEss y minimizar fotoblanqueo. Los cambios sutiles en la intensidad de fluorescencia de FM se pueden evaluar de forma fiable si los cambios causados ​​por photobleaching son pequeñas en comparación con los provocados por la actividad sináptica. Fotoblanqueo reducido también tiene el potencial de suprimir o eliminar la citotoxicidad. Photobleaching puede ser reducido al minimizar la exposición de los fluoróforos a la excitación de luz, y hay por lo menos dos componentes del equipo para hacer esto en experimentos de formación de imágenes en directo. Un componente importante es un detector sensible de fotones, por ejemplo, una cámara EMCCD. Esto hace que sea posible para reducir al mínimo la duración y la intensidad de la exposición sin afectar negativamente a la detección de emisión de fluorescencia. Un componente asociado es el sistema de la fuente de luz que se limita la exposición de la muestra a la luz de excitación sólo cuando el detector adquiere imágenes. Esto se logra fácilmente por una luz 41 LED que permite un control eficiente del tiempo de exposición a la luz (ON / OFF takes mucho menos de 1 ms). La exposición puede ser activado sólo durante la captura de la imagen, por la salida digital de la cámara (por ejemplo terminal "Fuego" en cámara Andor). Las ventajas adicionales de usar el LED incluyen: la capacidad de controlar la intensidad de la luz sin el uso de filtros de densidad neutra, la estabilidad a largo plazo de la intensidad de la luz, y la ausencia de vibraciones mecánicas que puedan interferir con el manejo preciso de pipetas de vidrio como en la grabación de patch-clamp .

En general, estructuralmente diferentes colorantes foto-blanqueador a diferentes velocidades en las mismas condiciones de formación de imágenes. Por consiguiente, sería ideal para evaluar el grado de fotoblanqueo del fluoróforo utilizado en un experimento particular. Para colorantes FM en los terminales nerviosos en vivo, que es técnicamente difícil de evaluar la tasa de fotoblanqueo independiente de la actividad sináptica, debido a la actividad sináptica espontánea o en miniatura. Una disminución en la intensidad de fluorescencia durante tales activitY podría ser debido a la pérdida biológica de colorantes FM (exocitosis), fotoblanqueo de colorantes FM, o ambos. Afortunadamente, las estructuras de los colorantes de FM se pueden fijar están diseñados para ser casi idénticos a los de los colorantes FM nonfixable. En el protocolo descrito aquí, colorantes FM fijables fueron cargados en las vesículas sinápticas por los mismos métodos como colorantes FM nonfixable, mientras que la actividad sináptica se bloqueó después por la fijación química de la muestra. En particular, la tasa de fotoblanqueo medido utilizando este sistema era tan bajo como 2-3% durante 2 min, cuando las condiciones de formación de imágenes fueron los mismos que los de imágenes de células vivas 19.

Colorantes FM se pueden utilizar con diferentes protocolos para explorar diversos aspectos de reciclado de vesículas sinápticas. Diferentes actividades sinápticas durante la tinción y decoloración se pueden combinar de varias maneras, dependiendo de los objetivos experimentales y las características específicas de reciclado de vesículas sinápticas a ser evaluados. La selección de antagontas también depende de la finalidad de los experimentos. Además, las imágenes de FM puede llevarse a cabo durante la fase de tinción, así como durante la fase de decoloración 9,18,42. También hay que tener en cuenta, sin embargo, que los tintes FM pueden tener efectos inesperados, como el bloqueo de los receptores de acetilcolina muscarínicos 43, e impregnando los canales mechanotransducer 44, tienda que funciona con Ca 2 + canales 45, y los receptores de ATP 46. Las altas concentraciones de colorantes FM potencialmente puede modificar la eficiencia de la misma exocitosis de vesículas sinápticas 47. Por lo tanto se recomienda precaución en el diseño de los experimentos y la interpretación de los resultados en materia de reciclado de vesículas sinápticas. Métodos complementarios a considerar incluirán la captación en vesículas sinápticas de anticuerpos cuyos epítopos son dominios intra-luminales de proteínas de vesículas 22,48. También incluyen expresando GFP sensible al pH variantes dirigidas a lumen de la vesícula 49-51, y la absorciónde conjugados de anticuerpos sensibles al pH 52-54 ambos de los cuales detectan los cambios intra-vesiculares de pH que acompañan exo-endocitosis.

Una vez que se excluyen tales efectos no deseados, colorantes FM tienen amplias aplicaciones. Por ejemplo, pueden ser usados ​​para analizar si las mismas piscinas vesículas sinápticas son compartidos por espontáneas y evocadas comunicados vesícula 17,55, en qué medida la eficiencia del reciclado de vesículas sinápticas pueden ser regulados 56,57, y qué efectos tiene un estado anterior (reposo o estimulado) ejercer en el estado posterior de reciclaje de vesículas sobre la base de, por ejemplo, espontánea y la actividad sináptica en miniatura. Colorantes FM también pueden utilizarse para evaluar el reciclado de vesículas sinápticas en el nivel ultraestructural, mediante la correlación de las observaciones de la luz y microscopía electrónica por el método de fotoconversión de FM 30,58-62. Colorante de FM se puede utilizar para monitorear simultáneamente las funciones sinápticas y intracelular de Ca 2 + Conconcentración 5. Además del etiquetado de las vesículas sinápticas, los colorantes FM y otros marcadores de fluido de fase fluorescentes tales como dextrano fluorescente 7 se puede utilizar para controlar la endocitosis mayor que se desencadena por una intensa actividad neuronal. En conclusión, las aplicaciones de los colorantes de FM ofrecen una valiosa fuente de información sobre el reciclado de vesículas sinápticas y funciones sinápticas adicionales.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Harata útil para los debates a lo largo de la ejecución de este trabajo. Este trabajo fue financiado por becas de la Asociación Americana del Corazón, la Fundación Distonía Investigación Médica, el Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la Fundación Nacional de Ciencias y la Fundación Whitehall a NCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

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References

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