Summary
Intravitalmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Abbildung verschiedener biologischer Prozesse in lebenden Tieren ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte Methode zur Abbildung der Dynamik der subzellulären Strukturen, wie den sekretorischen Granula, in den Speicheldrüsen von lebenden Mäusen.
Abstract
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Bild subzelluläre Strukturen in lebenden Nager, die auf der Verwendung von konfokalen Intravitalmikroskopie beruht. Als Modell Organ, verwenden wir die Speicheldrüsen von lebenden Mäusen, da sie mehrere Vorteile. Erstens kann sie leicht freigelegt werden, um den Zugriff auf die Optik zu ermöglichen, und stabilisiert ist, um die Reduzierung der Bewegungsartefakte aufgrund von Herzschlag und Atmung zu erleichtern. Dies erleichtert Bildgebung und Tracking kleine subzellulärer Strukturen. Zweitens, die meisten Zellpopulationen der Speicheldrüsen von der Oberfläche des Organs zu erreichen. Dies ermöglicht die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, die eine höhere räumliche Auflösung als andere Techniken, die für die in vivo-Bildgebung verwendet wurden, wie beispielsweise Zwei-Photonen-Mikroskopie. Schließlich kann Speicheldrüsen leicht pharmakologisch und genetisch manipuliert werden, so dass ein robustes System zur biologischen Prozesse auf molekularer Ebene zu untersuchen.
In dieser Studie konzentrieren wir uns auf ein Protokoll, das die Kinetik der Exozytose von sekretorischen Granula in Azinuszellen und die Dynamik der apikalen Plasmamembran, wo die sekretorischen Granula fusionieren bei Stimulierung der ß-adrenergen Rezeptoren folgen. Insbesondere verwendeten wir eine transgene Maus, die co-exprimiert GFP cytosolische und membranZielPeptid mit dem fluoreszierenden Protein Tandem-Tomato fusioniert. Allerdings können die Verfahren, die wir zur Stabilisierung und Bild die Speicheldrüsen zu anderen Mausmodellen erweitert und an andere Ansätze zur in-vivo-Zellbestandteile zu kennzeichnen, so dass die Visualisierung verschiedener subzellulärer Strukturen, wie Endosomen, Lysosomen, Mitochondrien gekoppelt werden, und das Aktin-Zytoskelett.
Introduction
In den vergangenen zwei Jahrzehnten die Einführung von Live-Mikroskopie und die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen haben große Durchbrüche auf jedem erdenklichen zellulären Prozess geführt, damit unser Verständnis der Zellbiologie ein. Dieses Feld enorm von der Verwendung von Säugetierzellkulturen, die extrem leistungsfähigen Modellsysteme, besonders, wenn es um experimentelle Manipulationen kommt profitiert hat. Allerdings stehen sie nicht oft bieten keine wahre Darstellung der Biologie der komplexen mehrzelligen Organismen 2. Dieses Problem hat damit begonnen, von der Entwicklung der Intravitalmikroskopie (IVM) angesprochen werden, die die Tür zur Untersuchung biologischer Schlüsselfragen in Bereichen wie der Neurobiologie, Immunologie und Tumorbiologie 3 geöffnet wurde. Bisher haben die meisten der Studien, die auf IVM wurden auf der Ebene von Geweben und einzelnen Zellen durchgeführt wurde, ohne Angaben über die Dynamik der subzellulären Kompartimenten. Vor kurzem hat unser Labor und anderes haben IVM Techniken in der Lage, Bild subzellulärer Strukturen in lebenden Nagern 4-7, 13-15 und so pharmakologischen und genetischen Manipulationen in vivo entwickelt. Dieser Ansatz wurde von uns verwendet worden, um Membrantransport in vivo zu untersuchen, und insbesondere Endozytose und Exozytose reguliert 6,7.
Unsere experimentellen Modellsystem wird auf die Entlarvung, die Stabilisierung und die Abbildung der Unterkieferspeichelspeicheldrüsen (DMS) der Nager betäubt basiert. Die Wahl der SGs als Modell für Orgel IVM aufgrund der Tatsache, dass die Drüsen, indem eine kleine Chirurgie leicht zugänglich sind, kann ohne ihre Physiologie externalisiert werden und stabilisiert, um die Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschlag reduzieren. Außerdem SGs selektiv entweder genetisch durch die Injektion von viralen oder nicht-viralen Vektoren auf der Basis durch den Speichelgang 8,9 manipuliert werden. Schließlich SGs sind exokrinen Drüsen des polarisierten epith zusammenElial Zellen, die den Acini und die Kanäle, Myoepithelzellen, und eine komplexe Population von Stromazellen zu bilden. Aus diesem Grund sind sie ein hervorragendes Modell zur Exozytose, Endozytose, Gentransfer und Aktin-Zytoskelett zu studieren, wie in unserem aktuellen Studien 10 markiert ist, und bieten die Möglichkeit, Aspekte der Zellbiologie wie Zellpolarität, Zellteilung, Zell studieren Zellverbindungen und Ionenkanälen.
In diesem Beitrag beschreiben wir im Detail ein Abbildungs Protokoll für die Erreichung subzellulärer Auflösung im Epithel der SGs einer Live-Maus. Insbesondere zeigen wir, wie man die Bild sekretorischen Granula in den Azinuszellen der SGs im regulierten Exozytose. Wie bereits dargestellt, nach Stimulation mit Agonisten des beta-adrenergen Rezeptor, verschmelzen die sekretorischen Granula mit der apikalen Plasmamembran und nach und nach zusammenbrechen, die Freigabe ihrer Inhalte in die Kanälchen acinar 6. Unser Ziel ist es, die grundlegenden Werkzeuge, um die Ermittler mit m bieteninimal Erfahrung in der chirurgischen Verfahren und die Behandlung der Tiere, so dass sie erfolgreich bei einem subzellulärer Auflösung durchführen IVM. Da der schwierigste Teil in IVM ist die Vorbereitung des Tieres, hier konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der grundlegenden chirurgischen Verfahren, die verwendet werden, um zu entlarven und zu immobilisieren die SGs, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Wie bei den Verfahren zur subzellulären Strukturen, verschiedene Strategien, wie systemische Abgabe von Fluoreszenzsonden, die Verwendung von transgenen Tieren, oder eine Kombination von beiden zu markieren, wurden an anderer Stelle beschrieben worden ist 7,11.
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Protocol
Teil 1: Mikroskop und Vorbereitung der Imaging-Setup
- Jede invertiert konfokalen Mikroskop sollte für IVM sein. In dieser Studie eine Olympus IX81 inverses Mikroskop, mit einer FluoView-1000 konfokaler Laser-Scanning-Einheit ausgestattet war. Um die bestmögliche Auflösung zu erreichen, ist der Einsatz von Hoch NA Ziele, wie zB die Wasser-Immersions UPLSAPO 60x/1.20 NA, und der Öl-Immersion-Plan-Apo 60x/1.42 NA empfohlen. Ölimmersionsobjektive haben höhere Sammelwirkungsgrade und obwohl sie die Verwendung eines Deckglases zwischen dem Gewebe und dem Ziel, bieten sie eine bessere Bildqualität bei der Bildbereiche innerhalb von 15-20 &mgr; m von der Oberfläche verwendet. Außerdem ist die Verwendung von Öl beseitigt die Sorge um die Wasserverdampfung bei längeren Imaging-Sitzungen. Um die Temperatur und Feuchtigkeit zu halten, ist das Mikroskop vollständig gekapselt und mit warmen und befeuchteten Luft versorgt werden. Alternativ kann das Tier, der Objekttisch und dieZiel muss es durch andere Mittel erwärmt werden. Zum Beispiel können chemische Heizkissen für das Tier und dem Stadium verwendet werden, und speziell Ziel Heizungen können für das Ziel (Fig. 1A) verwendet werden. Das Ziel Heizung sollte 30 Minuten vor Beginn des Verfahrens eingeschaltet werden. Hinweis: wenn die Wärme-Pads werden verwendet, um das Tier warm halten eine Gaze hat in zwischen dem Kissen und der Haut zu Ort. Die Haut hat, um Verbrennungen zu überwachen.
- Die Standardschritte in den meisten der im Handel erhältlichen konfokale Mikroskope haben eine Öffnung, die verwendet wird, um verschiedene Halterungen, die verwendet werden, um Folien, Petrischalen und Platten unterschiedlicher Größen passen einzufügen. Um IVM, eine Standard-Bühneneinsatz für 35 mm Petrischalen durchführen wird auf den Kopf umgedreht, mit einem 40 mm Glasträger, die dann durch Hochvakuum-Silikonfett oder Klebeband (Abbildung 1A) gesichert abgedeckt. Eine benutzerdefinierte Einsatz kann auch aus 3 mm dicken Aluminiumplatte hergestellt werden. Die Glasoberfläche ist dann clmit 70% Ethanol und eaned swiped mit Kimwipe.
- Herstellung eine maßgeschneiderte Halter für die SGs Immobilisierung (Stabilisator). Der Zweck des Inhabers ist es, die SGs vorhanden und starr koppeln sie auf die Bühne und das Deckglas zu stabilisieren. Der Halter kann aus einer 60 mm Petrischale aus Kunststoff hergestellt sein. Zunächst wird der Boden der Schale von den Wänden gebrochen und in Rechtecke von ca. 15 x 10 mm geschnitten. Dann werden die Kanten mit feinem Schleifpapier gerundet und poliert. Vier Abstandshalter (1,5-2 mm) werden durch Entfernen der Gummispitzen 1 ml Spritzenkolben aufgebaut. Durch die Verwendung von Feinpapier, wobei die Oberfläche der Abstandshalter und die vier Ecken der Kunststoffteil sind poliert. Die Abstandshalter werden dann mit Hilfe gallertSekundenKleber verklebt und mit feinem Schleifpapier auf einer ebenen Fläche später geglättet. Beachten Sie, dass bei älteren Tieren, die Größe der Halter und die Abstandshalter können erhöht werden, um etwas größer Drüsen aufzunehmen.
- Herstellung der optischen Kopplungs Gel. 0,3% Carbomer-940 (Tabelle 2) Gel wird durch Erwärmen 100 ml von ultra-reinem Wasser und löst 5,47 g D-Sorbitol vorbereitet. Dann werden 0,3 g Carbomer-940 zugegeben. Das Becherglas abgedeckt sein sollten und auf einer heißen Platte Rühren (niedrigsten Heizstufe) gelegt für mehrere Stunden oder bis alle Klumpen Carbomer vollständig gelöst sind. Schließlich Triethanolamin wird tropfenweise unter leichtem Rühren, bis ein pH-Wert von etwa 7,4 erreicht ist. Das Gel wird bei 4 ° C 13 gespeichert.
Teil 2: Tiere und Anästhesie
- Vor der Durchführung keine Experimente mit Tieren, sollten die Protokolle, die von Ihrem örtlichen Tierpflege und-Ethik-Kommission genehmigt werden. Wichtig ist, dass die Forscher richtig ausgebildet, um chirurgische Verfahren durchführen und sollten mit ihren lokalen Tierpflegeausschuss oder Institution Tierarzt vor dem Verfahren fortfahren zu konsultieren.
- In dieser Studie wurde ein Maus-Modell (GFP / mTomato-Maus) durch Kreuzung FVB Mäusen löslichen GFP (GFP-Maus) wi ausdrücken abgeleitetth C57B6 Mäusen eine Membran-Targeting-Peptid mit dem fluoreszierenden Protein Tandem-Tomate (mTomato-Maus) 6 fusioniert exprimiert, wurde verwendet. Hinweis: es dauert normalerweise 20-30 min für das Tier vollständig betäubt und für die Bildgebung vorbereitet werden
- Die Mäuse werden in einer kontrollierten Umgebung in der Tiereinrichtung untergebracht und läßt eine Woche vor dem Versuch akklimatisiert. Dieser Schritt ist für die Abbildung des SGs da jegliche Not führt zu einer erhöhten sekretorische Aktivität 12 erforderlich. Wasser und Nahrung sind vorhanden ad libitum. Männer 2 -5 Monate alt sind, für die Bildgebung Experimente (20-30 g) verwendet.
- Vor der Narkose, wiegen die Tiere, um die richtige Dosis des Narkosemittels zu bestimmen.
- Da die Belastung durch die Verabreichung von injizierbaren Anästhetika induzierten kann die sekretorische Aktivität des SGs beeinträchtigen, induzieren Pre-Anästhesie durch Isofluran-Inhalations, gefolgt von der Injektion von Anästhetika. Zu diesem Zweck legen die Mäuse sehr sanft in die Verdampferkammer, undschalten Sie den Sauerstofffluss (800-900 mmHg). Stellen Sie die Isofluran-Ebenen, um 3% auf die Pre-Narkose starten.
- Sobald die Tiere bewusstlos sind, injizieren einer Mischung von 100 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin in der Bauchhöhle (25 G Nadel). Anästhetika werden frisch durch Verdünnen von 100 mg / ml Xylazin und 20 mg / ml in Kochsalzlösung und dann Vermischen mit dem Ketamin bereit. Dieses Gemisch wird weiter verdünnt 1:1 mit Kochsalzlösung und eine geeignete Menge wird auf der Grundlage der Tiergewicht injiziert. Diese Verdünnung hilft bei der Verhinderung versehentlichen Überdosierung. Beachten Sie, dass das Gemisch seine Wirksamkeit nach 20 min.
- Beobachten Sie die Tiere auf Anzeichen von Wachheit und injizieren mehr Betäubung Mischung, wenn sie aus der Narkose kommen (ca. 75% der ursprünglichen Dosis innerhalb von 45 Minuten nach der ersten Injektion und 50% jede Stunde danach). Prüfen Sie die Tiefe der Narkose alle 15 min durch Kneifen der Pfote und die Beobachtung der Reaktion. Hinweis: Immer Augensalbe verabreichen, um zu verhindernAugentrockenheit.
- Anästhetika Hypothermie induzieren, was die Reproduzierbarkeit der Experimente und die Gesundheit des Tieres beeinflussen können. Daher sollten die Mäuse unter Wärmelampe oder einem Heizkissen für die gesamte Dauer des Experiments gehalten. Anmerkung: der Wärmelampe sollte mindestens 12-18 cm von dem Tier um ein Verbrennen zu verhindern
- Die Körpertemperatur der Tiere muss mit einem Thermometer mit einer rektalen Temperatursonde ausgestattet überwacht werden.
Teil 3: Tierchirurgie und Positionierung für die Intravitalmikroskopie
- Bereiten Sie den Arbeitsbereich mit allen chirurgischen Instrumenten (Tabelle 1), die sauber und steril sein sollten.
- Rasieren Sie den Halsbereich der Maus mit einer elektrischen Schermaschine. Wischen Sie die Bauchseite des Halsbereich des narkotisierten Maus mit einem Gaze-Schwamm in 70% Ethanol getränkt. Trocknen Sie den Überschuss mit einem Kimwipe.
- Mit stumpfen Pinzette gebogen heben ein kleines Stück Haut an der Mittellinie (nähemately am unteren Ende der Kaumuskeln), und machen einen kleinen Schnitt (Abbildung 1B).
- Setzen Sie die Schere in die Öffnung und trennen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebes durch Öffnen der Scherenblätter. Vermeiden Sie Schäden am darunter liegenden Drüsengewebe durch Zeigen der Schere bis zur Unterseite der Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt einige Male, bis die Haut von den tieferen Geweben (Abbildung 1B) getrennt.
- Mit einer Schere, schneiden Sie einen Streifen von gelockerten Haut ca. 3 mm breit und 10 mm lang. Die Haut sollte so geschnitten, dass die Öffnung beginnt in der Nähe der Basis der SGs, wo der Nerv, der Kanal und die Blutgefäße verbinden Sie die Verschraubung an den Rest des Körpers werden. Nach der Reinigung der Wundfläche, wird die daraus resultierende Öffnung ovale Form haben und messen ca. 8 x 12 mm. Beide SGs wird nach der Öffnung (1B) sichtbar.
- Mit einer Spritze gelten die optische Kopplung Gel in der Mitte des Schnittes und wischen gegendie Außenseite mit steriler Gaze. Saubere Stücke aus Gaze verwendet werden soll für jedes Tuch, um die Einführung der Haare oder Blut in die freiliegende Gewebe zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Blut und lose Haare entfernt.
- Verwendung einer Pinzette Nr. 7, trennen das Bindegewebe vom rechten Unterkieferspeicheldrüse hin zu dem Boden der Stopfbuchse (alternativ kann dieses Protokoll auf der linken SGs verwendet werden). Suchen Sie zunächst die Spitze des SG und greifen das Bindegewebe ein paar Millimeter über der Spitze der Drüse. Reißen Sie das Bindegewebe um die Drüse ohne Verletzung des Parenchyms. (Fig. 1B). Wenn die Drüse ausgesetzt ist, vorsichtig trennen das Bindegewebe aus der Drüse. Wenn Blutungen auftreten, waschen das Blut weg mit Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass alle Bindegewebe getrennt und die Drüse voll ausgesetzt ist. Halten Sie die Drüse feucht, indem die optische Kopplung Gel regelmäßig.
- Vor dem Ziel, das Tier an das Mikroskop, einen dicken Stück Gaze und heat Pack auf den Mikroskoptisch, um eine Temperatur von 38 ± 2 ° C zu halten Die Temperatur der chemischen Wärmepackung kann durch die Größe der Einschnitte, die den inneren Beutel der Atmosphäre auszusetzen eingestellt werden. Gaze bietet einige Isolierung der Wärmepackung aus der Metall-Bühne. Decken Sie die Oberseite der Wärmepackung mit einem dünnen Stück Gaze als gut.
- Legen Sie das Tier auf die Seite (rechte Seite für die rechte Drüse) und auf die Gaze. Positionieren Sie das Tier mit der Unterkieferspeichelspeicheldrüse in der Mitte des Deckglases (1C) gegeben.
- Das Tier befestigt ist und in dieser Position stabilisiert werden, bevor die Immobilisierung des Drüse. Legen Sie ein Stück Kreppband an der Bauchseite des rechten Vorderpfote der Maus. Haken Sie die Schneidezähne des Maus von einem Seidenfaden (1C, Einschub). Erstelle eine gewisse Spannung zwischen dem Seidenfaden und die Pfote und bringen sie auf der Bühne von Klebeband. Die SG sollte natürlich in der Mitte der AuflageDeckglas. Der Kopf und die Brust sollte zusätzlich durch Kunststoffkeile, die auf der Bühne gekoppelt werden kann stabilisiert werden.
- Legen Sie ein kleines Stück von einem Linsenreinigungstuch über der Drüse (Abbildung 1C). Verlängern Sie die Verschraubung leicht und legen Sie eine kundenspezifische Halterung über dem Drüse. Der Stabilisator Dich Paar auf die Bühne, mit Klebeband. Kopplung kann durch eine Metallklammer an der Stufe (1C) verbunden verbessert werden. Spannung und scharfen Kanten sollten vermieden werden, da sie den Blutfluss beeinträchtigen. Unmittelbar nach der Stabilisierung überprüfen den Blutfluss entweder durch die Untersuchung der Drüse visuell (es sollte rosa Färbung behalten) oder durch Epifluoreszenz. In der GFP / m-Tomaten-Maus können Brutto Veränderungen der Blutfluss einfach ausgewertet werden, da sowohl die Blutgefäße und mehrere von den Blutzellen mit dem m-Tomate bezeichnet.
- Bedecken Sie das Tier mit Gaze und einem Heizkissen. Messen der Temperatur der exponierten gland mit einem Thermometer ausgestattet with eine kleine flexible Thermosonde in Kontakt mit einer Seite des freiliegenden Drüse angeordnet.
Teil 4: Imaging-Parameter
- Mit Epi-Fluoreszenz Beleuchtungsfokus auf der Oberfläche der Drüse entweder über die GFP oder RFP-Filtersatz. Finden Sie die Oberfläche der SG, und bewerten den Blutfluss in den Kapillaren und die gesamte Morphologie der Gewebe. Anzeichen von Gewebeschäden sind Membranblasenbildung oder das Aussehen der großen Vakuolen.
- Beurteilen Sie die Stabilität des Gewebes entweder über Epi-Fluoreszenz oder die Pre-Scan den ausgewählten Bereich. Stabile Zubereitung ist wesentlich, da die meisten der Bewegungsartefakte können nicht entfernt oder korrigiert werden in der Nachbearbeitung Datenanalyse. Wenn die Zubereitung nicht stabil ist, sind Anpassungen erforderlich.
- Um die richtige Bildebene finden die Drüsen in der Vor-Scan-Modus (1X-Zoom), und das Ziel, schrittweise in Richtung auf das Deckglas, bis die acinar Strukturen, die sekretorischen Granula und der pLASMA Membran deutlich sichtbar (Abbildung 2).
- Die Bildaufnahmeparameter für die Zeitraffer hängen von der einzelnen Experiment. Zur Abbildung der Dynamik der sekretorischen Granula mit einem Scan-Geschwindigkeit von 0,5-2 sec / Rahmen, und 256 x 256 Pixel mit einer 0,2 &mgr; m / Pixel räumlichen Skala (Sichtfeld von etwa 50 um x 50 um). Um das Granulat und die Plasmamembran optimal visualisieren, sollte die optische Dicke zwischen 0,9 bis 1,2 um festgelegt werden. Um das GFP und die Tandem-Tomato erregen kann man eine Wellenlänge von 488 nm und 561 nm, auf. Die Spitzenleistung rund 0,5 mW für die 488 nm und 1 mW für die 561 nm eingestellt. Dies sorgt für minimale Photobleaching.
- Die Detektoreinstellungen angepasst werden, um das Signal in den Dynamikbereich zu erhalten und abhängig von der Helligkeit der Probe.
- Wenn alle Parameter eingestellt sind, können bildgebende gestartet werden. Zuerst nehmen Sie einen Schnappschuss von dem Sichtfeld als Referenzpunkt verwendet werden. WährendBildgebung im Zeitablauf kann Driften des Gewebes in XY und Z auftreten. Dies kann manuell durch Einstellung der Scan-Bereich und der Z-Position kompensiert werden. Die Anpassungen sollten allmählich und in kleinen Schritten, um Artefakte zu vermeiden. Darüber hinaus kann das Referenzbild verwendet, um zu bestimmen, ob Bleichen auftritt. Wenn bedeutende Photobleaching erkannt wird (mehr als 15-20% ige Reduktion der Fluoreszenz), reduzieren Sie die Laserleistung von 0,1 mW.
- Zur Stimulierung Exozytose, subkutan injizieren 0,1 mg / kg einer frisch hergestellten Lösung von Isoproterenol in Kochsalzlösung. Exozytose ausgelöst wird ungefähr 1 Minute nach der Injektion. Sekretorischen Granula verschmelzen mit der Plasmamembran wird durch einen Anstieg der GFP-Fluoreszenz um die Körnchen und die Diffusion der Tandem-Tomato Peptide in ihre begrenzende Membran (3) detektiert werden. Wir empfehlen den Erwerb 3-4 Zeitraffer-Sequenzen, die in der gleichen Gegend, jeweils 10 Minuten.
- Nach dem Imaging-Sitzung, die einschläfern anesthetized Tier durch CO 2-Inhalation in einer Euthanasie Kammer (10-12 mmHg für 10 min).
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Representative Results
In der GFP / mTomato Maus, die Acini erscheinen als deutlich verschieden Strukturen, die GFP cytosolische und membran gezielte Tandem-Tomato-Peptid (Abbildung 2, gestrichelte Linie) zum Ausdruck bringen. In einzelnen Acini werden Azinuszellen durch die Tandem-Tomaten-Peptid abgegrenzt. GFP ist auch in den Kernen, die eindeutig in den Azinuszellen sichtbar (Fig. 2, Pfeil) nachgewiesen. Cytosolic GFP wird aus den sekretorischen Granula, die als dunkle kreisförmige Vesikel von etwa 1 bis 1,5 um Durchmesser (Abbildung 2, Einschub, Pfeilspitzen) sind ausgeschlossen. Um Exozytose Ereignisse sichtbar zu machen, konzentrieren wir uns auf einen Bereich der Plasmamembran, die in sekretorischen Granula angereichert ist (Abbildung 3, Stern). Nach der subkutanen Injektion von 0,1 mg / kg Isoproterenol, beobachtet man eine Erhöhung des Niveaus der GFP-Fluoreszenz um einige der sekretorischen Granula, die in der Nähe der Plasmamembran (Fig. 3, grüne Pfeile) sind. Wie previously gezeigt, dieses Granulat mit der Plasmamembran zu rekrutieren geschmolzen und eine dicke Aktin Maschenwerk, die die zytoplasmatische GFP 6 beibehält. Zusätzlich kann nach Fusion mit der Plasmamembran diffundiert das Tandem-Tomato-Peptid in die Begrenzungsmembranen der sekretorischen Granula (Abbildung 3, rote Pfeile). Nach 30-40 sec die sekretorischen Granula allmählich verkleinern und deren Begrenzungsmembranen werden in der apikalen Plasmamembran integriert.
Fig. 1 ist. , Mikroskop einrichten chirurgischen Verfahren und Tier Positionierung. A. Eine Bühneneinsatz entwickelt, um 35 mm Petrischalen halten ist mit einem 40 mm Deckglas abgedeckt. Der Einsatz ist in den Mikroskoptisch, der mit erhitzten Pads (orange Ovale) und einem beheizten Lampe vorgewärmt ist gegeben. Das Ziel ist vor . B. Chirurgische Verfahren, um die Speicheldrüsen freizulegen: eine objektive Heizvorrichtung (38 ° C eingestellten Temperatur) wärmt. Mit einer sauberen Schere wird ein Einschnitt in der Haut über dem Halsbereich gebildet. Die Schere in der Öffnung, um die Haut von dem darunterliegenden Gewebe zu trennen eingesetzt. Die Haut wird dann entfernt und das Bindegewebe wird sanft von einem der Drüsen mit einer Pinzette abgeschält. C. Das Tier wird auf die Seite, auf der vorgeheizten Tisch gelegt und die Stopfbuchse vorsichtig herausgezogen und in der Mitte des Deckglases platziert . Die Schneidezähne sind auf die Bühne, mit Seidenfaden (kleines Bild) eingehängt. Ein kleines Stück des Linsenreinigungstuch zwischen der Drüse und der Orgel Halter eingeklemmt. Die Organhalter wird dann mit einer Klemme, die auf der Bühne mit Klebeband (grün) befestigt ist, stabilisiert.
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2. Repräsentative Bild von einem Bilderzeugungsbereich der Speicheldrüsen eines Live-GFP / mTomato Maus. Acini sind schön in der GFP-Kanal (grüne gestrichelte Linie) markiert. Einzelne Zellen werden durch das td-Tomaten-Peptid, das an der Plasmamembran (rot gestrichelte Linie) lokalisiert ist, abgegrenzt. Das GFP ist im Zytoplasma und die Kerne (Pfeile) lokalisiert ist, sondern von den sekretorischen Granula (Einschub, Pfeilspitzen) ausgeschlossen. Bar, 10 um.
3. Repräsentative Zeitfolge, die die Exozytose von sekretorischen Granula nach Injektion von 0,1 mg / kg Isoproterenol. Sekretorischen Granula wurden abgebildet Nähe der Plasmamembran (Sternchen). Nach der Fusion mit der Plasmamembran, das Niveau der GFP um den sekretorischen Körnchens deutlich erhöhen (grüne Pfeile) und die td-Tomate Peptid diffundiert in ihrer Begrenzung Membranen (rote Pfeile). Die sekretorischen Granula langsam kollabieren und ihre Membranen in der apikalen Plasmamembran integriert. Leiste 5 um.
Tabelle 1. Materials
Tabelle 2. Instrumente
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Discussion
Bisher subzellulärer Strukturen sind meist in in vitro (dh Zellkulturen) oder im ex vivo (dh Organkulturen, Gewebeschnitt, acinar Zubereitungen) Modellsysteme, die oft nicht die Eigenschaften von intakten lebenden Gewebe 6 rekapitulieren abgebildet worden. In dieser Hinsicht ist die hier vorgestellte Ansatz stellt einen wichtigen Durchbruch, da es ermöglicht die Abbildung der Dynamik einer bestimmten Membrantransportschritt (dh geregelt Exozytose) in lebenden Mäusen.
Dieses Protokoll stellt einen bedeutenden Fortschritt mit Hinsicht auf andere Verfahren zur in vivo Bildgebung von DMS oder anderen Organen in der Körperhöhle 10,11,13-15 gestalten. Einige unserer früheren Studien wurden an Ratten, die weniger anfällig für chirurgische Verfahren, haben größere Organe durchgeführt wird, und eine geringere Herzfrequenz im Vergleich zu Mäusen. Obwohl die Verfahren bei Mäusen sind schwerer zu errichten, bieten sie mehrere ADVAntages einschließlich der Möglichkeit, ein breiteres Spektrum von Krankheitsmodellen, transgene und Knockout-Tiere zu verwenden. Darüber hinaus ist dieser Ansatz erfolgreich minimiert die Bewegungsartefakte, die eine bessere Kontrolle über den Druck auf die freiliegenden Organe so die Risiken zu reduzieren angewandt: i) die Verringerung der Durchblutung, ii) Beschädigung der Gewebearchitektur, und iii) die normale Funktion beeinträchtigen des Organs. Dies ist ein großes Problem, das wir durch die Beseitigung der durch die Organhalter erzeugt Einschränkung und die Einführung eines Stabilisators 10,11 gelöst.
Einer der kritischen Schritte in diesem Protokoll ist, um die richtige Temperatur sowohl in der Tier-und in der exponierten Organs zu erhalten. In der Tat induziert Narkose schwere Unterkühlung und die Aufrechterhaltung der entsprechenden Körpertemperatur deutlich die Chancen der Tod vor Beendigung des Experiments reduziert. Darüber hinaus ist die exponierten Organs schnell Wärme mit der äußeren Umgebung während sowohl das chirurgische procedures und die Bildgebung. Da die lokale Reduktion der Temperatur stark nach unten die Kinetik der Exozytose Schritte zu verlangsamen, ist es wichtig, sie mit Hilfe der Wärmelampe, das Ziel, Heizung, und durch die Drüse feucht entweder mit der Kupplung Gel oder warmer Kochsalzlösung halten zu verhindern. Vollabtrennung des Mikroskops mit einer Umgebungskammer ist auch gute Lösung für die Steuerung der Temperatur. Ein weiterer wichtiger Schritt ist es, die richtige Balance zwischen Stabilisierung und Aufrechterhaltung des Blutflusses zu erreichen. Tatsächlich, in einer Zubereitung, die nicht richtig stabilisiert wird, ist es sehr schwierig, die Kinetik der sekretorischen Granula, deren Größen im Mikrometerbereich zu folgen. Andererseits wird die Verringerung der Blutversorgung resultiert in der Bildung von großen Vakuolen oder eine signifikante Hemmung der regulierte Exozytose. Um dieses Gleichgewicht zu erreichen, ist es wichtig, den Blutfluss ständig zu überwachen und auf Anzeichen von Zellschäden während der Anwendung den Druck auf das Organ zu stabilisieren.
Obwohl für diese Studie haben wir eine transgene Maus, die gleichzeitige Phantasie ermöglicht ausgewähltng der sekretorischen Granula und der apikalen Plasmamembran können die hier beschriebenen Verfahren verlängert, um mehrere andere intrazelluläre Vorgänge zu studieren. Dies kann durch Verwendung fluoreszenzmarkierten Moleküle, die spezifische zelluläre Strukturen zu kennzeichnen und kann entweder systemisch oder direkt auf den SGs verabreicht werden erreicht. Alternativ neuen transgenen Mausmodellen fluoreszenzmarkierten-Moleküle exprimieren, entwickelt worden sind, wie der Glukosetransport Glut4, der F-Aktin-Marker LifeAct, dem Kernmarker Histon 2B Maus und der Autophagie Marker LC3-GFP. Schließlich können wir die grundlegende Strategie entwickelt haben, um bei hoher Auflösung und Bild immobilisieren die SGs potenziell auf andere Organe ausgedehnt werden (zB Bauchspeicheldrüse, Leber, Nieren und Brustdrüsen) durch die Einführung paar Änderungen in der Größe oder der Form der Stabilisator.
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Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NIH, National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 | |
References
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