Summary
Intramikroskopi er et kraftig verktøy som gjør det mulig å avbilde ulike biologiske prosesser i levende dyr. I denne artikkelen presenterer vi en detaljert fremgangsmåte for avbildning av dynamikken i subcellulære strukturer, slik som de sekretoriske granuler, i spyttkjertlene hos levende mus.
Abstract
Her beskriver vi en prosedyre for å image subcellulære strukturer i levende gnagere som er basert på bruk av confocal intramikroskopi. Som en modell organ, bruker vi spyttkjertler av levende mus siden de gir flere fordeler. For det første kan de lett utsettes for å muliggjøre adgang til optikken, og stabilisert for å lette reduksjon av bevegelsesartifakter på grunn av hjerteslag og åndedrett. Dette forenkler bildebehandling og sporing små subcellulære strukturer betydelig. For det andre har de fleste av cellepopulasjoner i spyttkjertlene er tilgjengelig fra overflaten av organet. Dette tillater bruk av konfokal mikroskopi som har en høyere romlig oppløsning enn andre teknikker som har vært brukt for in vivo avbildning, slik som to-fotonmikroskopi. Endelig kan spyttkjertler lett manipuleres farmakologisk og genetisk, og dermed gi et robust system for å undersøke biologiske prosesser på et molekylært nivå.
I denne studien fokuserer vi på en protokoll utviklet for å følge kinetikken i eksocytose av sekresjonsgranuler i akinærceller og dynamikken i den apikale plasma membran der sekresjonsgranuler sikringen ved stimulering av beta-adrenerge reseptorer. Spesielt brukte vi en transgen muse som co-uttrykker cytosolisk GFP og en membran-målrettet peptid smeltet sammen med den fluorescerende protein tandem-tomat. Imidlertid kan fremgangsmåten som vi benyttet til å stabilisere og bildespyttkjertlene bli utvidet til andre musemodeller og er koplet til andre fremgangsmåter for å merke i vivo cellulære komponenter, gjør det mulig å visualiseringen av forskjellige subcellulære strukturer, slik som endosomer, lysosomer, mitokondrier og aktin cytoskjelettet.
Introduction
I de siste to tiårene bruk av levende mikroskopi og bruk av fluorescerende proteiner har ført til store gjennombrudd på hver cellulære prosessen tenkelige, og dermed fremme vår forståelse av cellebiologi en. Dette feltet har dratt nytte enormt fra bruk av pattedyrcellekulturer som er ekstremt kraftige modellsystemer, spesielt når det kommer til eksperimentelle manipulasjoner. Men gjør de ikke ofte gi et sant bilde av biologien til komplekse flercellede organismer to. Dette problemet har begynt å bli ivaretatt av utviklingen av intramikroskopi (IVM) som har åpnet døren for å undersøke viktige biologiske spørsmål innen områder som nevrobiologi, immunologi og tumorbiologi tre. Så langt har de fleste av studiene basert på IVM er utført på nivåene av vev og individuelle celler, uten å gi noe informasjon om dynamikken i subcellulære avdelinger. Nylig, vårt laboratorium og andres har utviklet IVM teknikker som kan bildebehandling subcellulære strukturer i levende gnagere 4-7, 13-15 og tillater farmakologiske og genetiske manipulasjoner in vivo. Denne tilnærmingen har vært brukt av oss å studere membran trafficking in vivo, og mer spesifikt endocytose og regulert eksocytose 6,7.
Vår eksperimentelle modellsystem er basert på å avsløre, stabilisere og bildebehandling submandibular spyttkjertler (SGS) av bedøvet gnagere. Valget av SGS som en modell organ for IVM skyldes det faktum at kjertlene er lett tilgjengelige ved å utføre en mindre operasjon, kan externalized uten å svekke deres fysiologi, og stabilisert for å redusere bevegelsesartifakter på grunn av hjerteslag og åndedrett. I tillegg kan SGS selektivt genetisk manipulert ved å injisere enten virale eller ikke-virale vektorer basert gjennom spyttkanalen 8,9. Endelig, SGS er eksokrine kjertler sammensatt av polarisert epithelial celler, som danner acini og kanalene, korg celler, og en kompleks populasjon av stromale celler. Av denne grunn, de er en utmerket modell for å studere eksocytose, endocytose, genet levering, og aktin cytoskjelettet, som fremhevet i våre nyere studier 10, og tilbyr muligheten til å studere deler av cellebiologi som celle polaritet, celledeling, celle- celle veikryss, og ionekanaler.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj en avbildning protokoll for å oppnå subcellulære oppløsning i epitel SGS av en levende mus. Konkret viser vi hvordan du bilde de sekresjonsgranuler i akinærceller av SGS under regulert eksocytose. Som tidligere vist, ved stimulering med agonister av beta-adrenerge reseptorer, de sekresjonsgranuler fusjonere med apikale plasma membran og kollapse gradvis, ut sitt innhold inn i acinar canaliculi seks. Vårt mål er å gi grunnleggende verktøy for å etterforskere med minimal erfaring i kirurgiske prosedyrer og dyr behandling, slik at de kan lykkes utføre IVM på en subcellulære oppløsning. Siden den mest utfordrende delen i IVM er utarbeidelsen av dyret, her fokuserer vi på beskrivelsen av de grunnleggende kirurgiske prosedyrer som benyttes for å avdekke og immobilisere SGS uten å svekke deres funksjon. Når det gjelder fremgangsmåtene for å etiketten subcellulære strukturer, flere strategier, for eksempel systemisk levering av fluorescerende prober, bruk av transgene dyr, eller en kombinasjon av begge deler, er blitt beskrevet andre steder 7,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Del 1: Mikroskop og klargjøring av Imaging Setup
- Enhver invertert konfokal mikroskop bør være egnet for IVM. I denne studien ble en Olympus IX81 invertert mikroskop, som er utstyrt med en Fluoview-1000 laser scanning confocal enhet ble brukt. For å oppnå best mulig oppløsning, er bruk av høye NA mål, som for eksempel vann-nedsenking UPLSAPO 60x/1.20 NA, og neddyppingsobjektivet Plan-Apo 60x/1.42 NA anbefales. Olje nedsenking mål har høyere innsamlingseffektiviteten, og selv om de krever anvendelse av et dekkglass mellom vevet og målet, gir de en bedre bildekvalitet når det brukes til bildeområder innen 15 til 20 mikrometer fra overflaten. I tillegg er bruken av olje eliminerer bekymring for vann fordamper under lengre bildebehandling økter. For å opprettholde den temperatur og fuktighet, bør mikroskopet være fullstendig lukket og forsynt med varme-og fuktet luft. Alternativt dyret, objektbordet, ogMålet må bli varmet av andre midler. For eksempel kan kjemisk varmeputer anvendes for dyret og scenen, og er spesielt utformet objektiv ovner kan anvendes for formålet (figur 1A). Formålet Varmeren skrus på 30 min før man starter prosedyren. Merk: når varmeputene er bruk for å holde dyret varme en gasbind har å plassere i mellom puten og huden. Huden må overvåkes for brannskader.
- De vanlige trinn i de fleste av de kommersielt tilgjengelige confocal mikroskoper har en åpning som blir brukt til å sette inn en rekke holdere som brukes til å passe lysbilder, petriskåler, og plater av forskjellige størrelser. For å kunne utføre IVM, en standard stadium innsats for 35 mm petriskåler er invertert opp-ned, dekket med et 40 mm glass-slide, som deretter festes ved høyvakuum silikonfett eller maskeringstape (figur 1A). En tilpasset innsats kan også være fremstilt av 3 mm tykk aluminiumsplate. Den glassflaten er da cleaned med 70% etanol og rappet med en Kimwipe.
- Produsere en tilpasset holder for SGS immobilisering (stabilisator). Formålet med innehaveren er å stabil SGS på plass og stivt par dem til scenen og dekkglass. Holderen kan være laget av et 60 mm plast petriskål. Først blir bunnen av fatet brutt vekk fra veggene og skåret i rektangler med omtrent 15 x 10 mm. Deretter blir kantene avrundet og polert ved bruk av et fint sandpapir. Fire avstandsstykker (1,5-2 mm) er bygget ved å fjerne gummi tips av en ml sprøyte stempler. Ved å bruke et fint sandpapir, overflaten av avstandsstykkene, og de fire hjørnene av plastdelen er polert. Avstandsstykkene blir deretter limt ved hjelp av gelatin superlim, og senere glattet med fint sandpapir på et flatt underlag. Legg merke til at for eldre dyr, kan størrelsen av holderne, og avstandsstykkene må økes for å få plass til litt større kjertler.
- Fremstilling av den optiske kopling gel. 0,3% Karbomer-940 (Tabell 2) gel ble fremstilt ved å varme opp med 100 ml ultrarent vann og oppløser 5,47 g D-sorbitol. Deretter blir 0,3 g Karbomer-940 tilsatt. Den begerglass bør være tildekket og plassert på en rørevarmeplate (laveste kokenivå) i flere timer, eller inntil alle CarboMer klumper er fullstendig oppløst. Endelig er Trietanolamine tilsettes dråpevis under forsiktig omrøring, til en pH på omtrent 7,4 er nådd. Gelen ble lagret ved 4 ° C 13.
Del 2: Dyr og Anesthesia
- Før gjennomføre eventuelle forsøk med dyr, bør protokollene være godkjent av din lokale dyr omsorg og etikkomité. Viktigere, bør forskerne være skikkelig opplært til å utføre kirurgiske prosedyrer og bør rådføre seg med sin lokale dyr omsorg komiteen eller institusjon veterinær før du fortsetter med prosedyren.
- I denne studien, en musemodell (GFP / mTomato-mus) utledet ved å krysse FVB mus uttrykker løselig GFP (GFP-mus) with C57B6 mus uttrykker en membran-målrettet peptid smeltet sammen med den fluorescerende protein tandem-tomat (mTomato-mus) 6 ble brukt. Merk: Det tar vanligvis 20-30 min for dyret å bli helt bedøvet og preparert for bildebehandling
- Mus blir plassert i et kontrollert miljø i dyrefasilitet og får lov til å akklimatisere seg i én uke før eksperimentet. Dette trinnet er nødvendig for å avbilde SGS siden eventuelle nød resulterer i forbedret sekretorisk aktivitet 12. Vann og mat er tilgjengelig ad libitum. Hanner fra 2 -5 måneder gamle brukes til bildebehandling eksperimenter (20-30 g).
- Før anestesi, veie dyrene å finne den riktige dosen av bedøvelse.
- Siden stress indusert ved administrering av injiserbare bedøvelsesmidler kan svekke sekretoriske aktivitet av SGS indusere pre-anestesi med isofluran inhalering, etterfulgt av injeksjon av anestetika. Til dette målet, plasserer musene svært forsiktig inn i vaporizer kammeret, ogslå på oksygen (800-900 mmHg). Sett isofluran nivåene til 3% for å starte pre-anestesi-induksjon.
- Når dyrene er bevisstløs, injiserer en blanding av 100 mg / kg ketamin og 20 mg / kg xylazin i bukhulen (25 G nål). Anestetika er tilberedes ved å fortynne 100 mg / ml xylazin 20 mg / ml i saltløsning, og deretter blande den med ketamin. Denne blandingen blir videre fortynnet 1:1 med saltløsning og en passende mengde er blitt injisert basert på dyrets vekt. Dette fortynning bidrar til å hindre utilsiktet overdose. Legg merke til at blandingen taper sin effektivitet etter 20 min.
- Observer dyrene for tegn på våkenhet og injisere mer bedøvelse blanding hvis de kommer ut av anestesi (ca. 75% av den første dosen innen 45 minutter etter første injeksjon, og 50% hver time etterpå). Kontroller dybden av anestesi hvert 15 min ved å klemme labben og observere responsen. Merk: Alltid administrere ophthalmic salve for å hindreøye tørrhet.
- Anestetika indusere hypotermi, som kan påvirke reproduserbarheten av forsøkene og helsen til dyret. Derfor bør mus holdes under varmelampe eller på en oppvarmet pute for hele varigheten av forsøket. Merk: varme-lampe bør være minst 12 til 18 inches fra dyret for å forhindre brenning
- Kroppstemperaturen til dyrene har til å bli overvåket med et termometer utstyrt med en rektal temperaturprobe.
Del 3: Animal Surgery og posisjonering for Intravital Mikros
- Klargjør arbeidsområdet med alle kirurgiske instrumenter (tabell 1) som skal være rene og sterile.
- Barbere nakken av musen med en elektrisk klippemaskinen. Tørk den ventrale side av nakkeområdet hos en bedøvet mus med et gasbind svamp dyppet i 70% etanol. Tørk av overflødig med en Kimwipe.
- Med kjedelig buet pinsett løfte opp en liten bit av huden på midtlinjen (calag ved den nedre ende av tygge muskler), og lage et lite snitt (fig. 1B).
- Sett saksen inn i åpningen og separere huden bort fra det underliggende vevet ved å åpne saksebladene. Unngå å skade den underliggende kjertelvevet ved å peke saksen opp mot undersiden av huden. Gjenta dette flere ganger inntil huden er adskilt fra de dypere vev (Figur 1b).
- Ved hjelp av saks, klippe ut en stripe av løsnet huden ca 3 mm bred og 10 mm lange. Huden skal kuttes, slik at åpningen som begynner nær bunnen av SGS hvor nerven, kanalen og blodkar forbinder pakkboksen til resten av kroppen. Etter rengjøring av sårområdet, vil den resulterende åpningen være oval i form og utgjøre ca 8 x 12 mm. Begge SGS vil være synlig etter åpningen (Figur 1B).
- Med en sprøyte bruke optisk kopling gel inn i midten av kuttet og tørk den motutsiden med sterilt gasbind. Rene stykker av gasbind som skal brukes for hver tørker for å hindre innføring av håret eller blod inn i det eksponerte vev. Gjenta dette trinnet til alle blod og løse hår er fjernet.
- Bruke # 7 pinsett, skille bindevev bort fra høyre submandibular kjertel hele veien til bunnen av kjertelen (alternativt denne protokollen kan brukes på venstre SGS). Først finner spissen av SG og ta tak i bindevev noen få millimeter over spissen av pakkboksen. Riv bindevevet rundt kjertelen uten å skade parenchyma. (Figur 1B). Når kjertelen er utsatt, forsiktig skille bindevev fra kjertelen. Hvis blødningen oppstår, vaske blodet vekk med saltvann. Sørg for at alle bindevev blir separert og kjertelen er fullt eksponert. Hold kjertelen fuktig ved å bruke optisk kopling gel regelmessig.
- Før bringe dyret til mikroskopet, legg et tykt stykke gasbind og heat pakke på objektbord for å opprettholde en temperatur på 38 ± 2 ° C. Temperaturen av den kjemiske varmepakning kan reguleres ved størrelsen av de kutt som utsetter den indre posen til atmosfæren. Gasbind gir noen isolering av varmepakken fra metall scenen. Dekk til toppen av varmepakning med et tynt stykke av gasbind i tillegg.
- Plasser dyret på sin side (høyre side for høyre kjertel) og inn på gasbind. Plasser dyret med kjevespyttkjertel plassert i midten av dekkglass (figur 1C).
- Dyret skal være sikret og stabilisert i denne posisjonen før immobilisering av kjertelen. Legg et stykke maskeringstape på ventral side av fremre høyre labben på musen. Hekt fortenner av musen ved en silke sutur (figur 1C, innfelt). Lag noen spenning mellom silketråd og labben og legge dem inn på scenen av maskeringstape. Den SG skal hvile naturlig i midten avdekkglass. Hodet og thorax bør i tillegg stabiliseres med plastkiler som kan kobles til scenen.
- Plasser et lite stykke linsepapir over kjertel (figur 1C). Utvide kjertel lett og sett en tilpasset holderen over kjertelen. Tett par stabilisatoren til scenen med maskeringstape. Koplingen kan forbedres ved en metallklemme som er koblet til fasen (figur 1C). Tension og skarpe vinkler bør unngås da disse kan kompromittere blodstrømmen. Umiddelbart etter stabilisering inspisere blodstrømmen enten ved å undersøke kjertelen visuelt (det bør beholde rosa farge) eller ved epifluorescence. I GFP / m-tomat mus, kan grove endringer av blodstrømmen kan lett evalueres da både i blodårer og flere av de blodlegemer merket med m-tomat.
- Dekk dyret med gasbind og en oppvarmet pad. Måle temperaturen på den eksponerte kjertel ved hjelp av et termometer utstyrt wed en liten fleksibel termo sonde plassert i kontakt med den ene siden av eksponerte kjertel.
Del 4: Imaging Parametere
- Ved hjelp av epifluorescence belysning fokus på overflaten av glanden ved enten å bruke de GFP eller RFP filtersettet. Finn overflaten av SG, og vurdere blodstrømmen i kapillærene og den totale morfologi av vevet. Tegn på vevsskade inkluderer membran blebbing eller utseendet på store vakuoler.
- Vurdere stabiliteten av vev, enten via epifluorescence eller ved forhåndsskanne valgte området. En stabil forberedelse er viktig, siden de fleste av bevegelsesartefakter kan ikke fjernes eller korrigeres for i etterbehandling dataanalyse. Dersom preparatet er ikke stabil, er justeringer som kreves.
- For å finne riktig fokusplanet image kjertlene i pre-skannemodus (1X zoom), og gradvis bevege seg målet mot dekk inntil acinar strukturer, de sekresjonsgranuler og plasma membran blir godt synlig (figur 2).
- Det tenkelig parametere for time-lapse avhenge av den enkelte forsøk. Til image dynamikken i sekresjonsgranuler bruke en skannehastighet på 0,5-2 sek / ramme, og 256 x 256 piksler med en 0,2 mikrometer / pixel romlig skala (synsfelt på ca 50 mikrometer x 50 mikrometer). For optimalt å visualisere granulene og plasma membran, bør den optiske tykkelsen være mellom 0,9 til 1,2 mikrometer. For å eksitere GFP og tandem-tomat, kan man bruke en bølgelengde på 488 nm og 561 nm, hhv. Toppeffekten ligger rundt 0,5 mW for 488 nm og en mW for 561 nm. Dette sikrer minimal fotobleking.
- Detektoren innstillinger må justeres for å opprettholde signal innenfor det dynamiske området og er avhengig av lysstyrken av prøven.
- Når alle parametere er satt, kan bilde startes. Først tar et bilde av synsfeltet som skal brukes som et referansepunkt. Mensavbildning i tidsforløp, kan avdrift av vevet i XY og Z oppstå. Dette kan manuelt kompenseres ved justering av skanneområdet og Z stilling. Justeringene bør gjøres gradvis og med små mengder, for å unngå artefakter. Videre kan referansebildet brukes til å bestemme hvorvidt det oppstår fotobleking. Hvis det oppdages betydelig fotobleking (mer enn 15-20% reduksjon i fluorescens), reduserer lasereffekten med 0,1 mW.
- For å stimulere eksocytose, injiserer subkutant 0,1 mg / kg av en nylaget løsning av isoproterenol i saltvann. Eksocytose utløses ca ett minutt etter injeksjonen. Sekresjonsgranuler smeltet med plasmamembranen vil bli detektert av en økning av GFP fluorescens rundt granulene og diffusjonen av de tandem-Tomat peptider i deres begrensende membraner (figur 3). Vi anbefaler å anskaffe 3-4 time-lapse-sekvenser i samme område, 10 min hver.
- Etter bildebehandling økten, avlive anesthetized animalske CO 2 inhalasjon i et dødshjelp kammer (10-12 mmHg for 10 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I GFP / mTomato mus, vises acini så klart forskjellige strukturer, som uttrykker cytosolic GFP og membran-målrettet tandem-Tomato peptid (Figur 2, stiplet linje). I enkelte acini, er akinærceller avgrenset av tandem-Tomato peptid. GFP er også påvist i kjernene som er godt synlig inne i akinærceller (Figur 2, piler). Cytosolic GFP er ekskludert fra de sekresjonsgranuler som vises som mørke sirkulære vesikler på ca 1-1,5 mikrometer i diameter (figur 2, innfelt, pilspisser). For å visualisere exocytic hendelser, har vi fokus på ett område av plasma membranen som er beriket i sekresjonsgranuler (Figur 3, stjerne). Etter subkutan injeksjon av 0,1 mg / kg isoproterenol, observerer vi en økning i nivåene av GFP fluorescens rundt noen av de sekretoriske granuler som er i umiddelbar nærhet av plasmamembranen (fig. 3, grønne piler). Som previously vist, disse granulater er smeltet sammen med plasmamembranen og rekruttere en tykk aktin meshwork som beholder den cytoplasmatiske GFP seks. I tillegg, etter fusjon med plasmamembranen, diffunderer de tandem-tomat peptid inn i de begrensende membraner av sekretoriske granuler (figur 3, røde piler). Etter 30-40 sek sekretoriske granuler gradvis kollapse og deres begrensende membraner er integrert i den apikale plasma membran.
Figur 1. Mikroskop satt opp, kirurgiske prosedyrer, og dyr posisjonering. A. En stadium innsats utformet for å holde 35 mm petriskåler er dekket med et 40 mm dekkglass. Innsatsen er plassert i objektbord som er forvarmet med varmeputer (oransje ovaler) og en oppvarmet lampe. Målet er pre -Oppvarmet med en objektiv varmeapparat (temperatur sett: 38 ° C). B. Kirurgiske prosedyrer for å avsløre spyttkjertlene. Bruk av ren saks, er et snitt i huden over halsområdet. Saksen blir satt inn i åpningen for å skille huden fra underliggende vev. Huden blir deretter fjernet, og bindevevet blir forsiktig presses fra en av de kjertler ved hjelp av en pinsett. C. dyret plassert på sin side på den forvarmede fase og pakkboksen er trukket forsiktig og plassert i midten av dekk . Fortennene er hekta på scenen med silketråd (innfelt). Et lite stykke linsepapir er klemt mellom kjertelen og orgelet holderen. Orgelet holder deretter stabilisert med en klemme som er sikret på scenen med maskeringstape (grønn).
oad/50558/50558fig2.jpg "/>
Figur 2. Representant bilde av en tenkelig område av spyttkjertlene av en live GFP / mTomato mus. Acini er pent markert i GFP kanalen (grønn stiplet linje). Enkelt celler er avgrenset av den td-tomat peptid som er lokalisert på plasmamembranen (rød stiplet linje). Er lokalisert GFP i cytoplasma og kjerner (piler), men ekskludert fra sekresjonsgranuler (innfelt, pilspisser). Bar, 10 mikrometer.
Fig. 3. Representative tidssekvens som viser exocytose i sekretoriske granuler ved injeksjon av 0,1 mg / kg isoproterenol. Sekretoriske granuler ble fotografert i nærheten av plasmamembranen (stjerne). Etter fusjon med plasmamembranen, nivåene av GFP rundt sekretoriske granulers signifikant økning (grønne piler), og td-Tomato peptid diffunderer inn sine begrensende membraner (røde piler). De sekretoriske granuler langsomt kollapse og deres membraner er integrert i den apikale plasma membran. Bar, 5 mikrometer.
Tabell 1. Materialer
Tabell 2. Instruments
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så langt subcellulære strukturer har blitt fotografert det meste i in vitro (dvs. cellekulturer) eller i ex vivo (dvs. organ-kulturer, vev skiver, acinar preparater) modellsystemer som ofte ikke rekapitulere hva som kjennetegner intakte levende vev seks. I denne forbindelse, tilnærmingen presenteres her representerer et stort gjennombrudd siden det gjør bildebehandling dynamikken i en bestemt membran trafficking trinn (dvs. regulert eksocytose) i levende mus.
Denne protokollen representerer et betydelig fremskritt med henseender til andre prosedyrer utformet for in vivo avbildning av SGS eller andre organer i kroppen hulrom 10,11,13-15. Noen av våre tidligere studier utført på rotter som er mer motstandsdyktige mot kirurgiske prosedyrer, har større organer, og en redusert hjertefrekvens sammenlignet med mus. Selv om prosedyrene i mus er vanskeligere å sette opp, gir de flere Advantages inkludert muligheten til å bruke et bredere spekter av sykdomsmodeller, transgene og knockout-dyrene. I tillegg er denne fremgangsmåten med hell kunne minimalisere bevegelsesartifakter, og gir en bedre kontroll over trykket som påføres på de eksponerte organer og dermed redusere risikoen for: i) å redusere blodstrømmen, ii) å skade vevet arkitektur, og iii) å svekke den normale funksjon av organet. Dette er et stort problem at vi løst ved å eliminere den begrensning som genereres av organholderen og innføre en stabilisator 10,11.
En av de mest kritiske trinn i denne protokollen, er å opprettholde riktig temperatur både i dyr og i det eksponerte organ. Faktisk induserer anestesi alvorlig hypotermi og opprettholde den riktige kroppstemperaturen reduserer sjansene for døden før fullføring av forsøket. Videre utveksler det eksponert organ raskt varme med det ytre miljø både under kirurgiske procedures og bildebehandling. Siden den lokale nedsettelse av temperaturen sterkt avta kinetikken i exocytic trinn, er det viktig å hindre at det ved hjelp av varme-lampe, den objektive varmeapparat, og ved å holde kjertelen fuktig med enten koplings gel eller varm saltløsning. Fullstendig innelukking av mikroskopet med et miljøkammer er også god løsning for å kontrollere temperaturen. Et annet kritisk punkt er å oppnå den riktige balanse mellom stabilisering og opprettholdelse av blodstrøm. Faktisk, i et preparat som ikke er riktig stabilisert seg, er det meget vanskelig for å følge kinetikken til den sekretoriske granuler som har størrelser er i mikron området. På den annen side reduksjonen av blodtilførselen resulterer i dannelse av store hulrom, eller en betydelig hemming av regulert exocytose. For å oppnå denne balansen er det viktig å hele tiden overvåke blodstrøm og se etter tegn på celleskader mens du påfører press for å stabilisere organ.
Selv for denne studien har vi valgt en transgen mus som muliggjør samtidig imaging av de sekretoriske granuler og den apikale plasma membran, kan fremgangsmåtene beskrevet her bli utvidet for å studere flere andre intracellulære prosesser. Dette kan oppnås ved hjelp av fluorescerende merkede molekyler som merke spesifikke cellulære strukturer, og kan administreres enten systemisk eller direkte på SGS. Alternativt, har nye transgene musemodeller uttrykker fluorescently tagget-molekyler er utviklet, slik som glukose transport GLUT4, F-aktin markør LifeAct, atom markør histone 2B mus, og autofagi markør LC3-GFP. Endelig, kan den grunnleggende strategi har vi utviklet for å immobilisere og bilde SGS med høy oppløsning bli potensielt utvidet til andre organer (f.eks bukspyttkjertel, lever, nyre, og melkekjertler) ved å innføre noen endringer i størrelsen eller formen av stabilisatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av NIH, National Institute of Dental og kraniofaciale Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 | |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., et al. Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. Najman, S. , Intech. (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
