Summary
为了证明MR癌分子成像与小肽靶向特定于在小鼠前列腺癌模型的肿瘤间质凝结血浆蛋白的MRI造影剂。
Abstract
肿瘤的细胞外基质具有丰盈癌症相关的蛋白质，可以作为生物标记用于癌症的分子成像的。在这项工作中，我们证明有效MR肿瘤分子影像与靶向的Gd-DOTA单酰胺复合物作为特定于肿瘤间质凝结血浆蛋白有针对性的MRI造影剂的小分子肽。我们进行了评价非侵入性的检测前列腺肿瘤与MRI在小鼠原位PC-3前列腺癌模型中的代理的有效性的实验。靶向造影剂是有效的在0.03毫摩尔GD /公斤的低剂量产生显著肿瘤对比度增强。靶向MRI造影剂的肽前途的前列腺肿瘤MR分子成像。
Introduction
癌症相关的分子靶点有效的成像具有重要的意义，以提高癌症的早期检测和诊断的准确性。磁共振成像（MRI）是一种强有力的临床成像模态的高空间分辨率和无电离辐射1。然而，没有针对性的造影剂可用于临床肿瘤MR分子成像。创新设计有针对性的MRI造影剂的发展将大大推进磁共振肿瘤分子成像的应用。已取得显著致力为表达癌细胞表面上的生物标志物的MR成像靶向造影剂。由于MRI和这些生物标志物的低浓度的敏感性相对较低，这是一个挑战，以产生足够的对比度增强，使用小分子靶向造影剂2,3有效MR分子成像。为了得到足够的提高，各种递送系统SUCH为脂质体，纳米粒，并与顺磁性钆（Ⅲ）螯合物高负载聚合物复合物已准备加大在靶位点4,5造影剂的局部浓度。虽然这些递送系统，也能产生在动物模型显著肿瘤的增强，它们的大尺寸导致缓慢和不完全从体内消除，产生有毒的钆（III）离子，这可能会导致严重的安全问题6的长期积累。最近，一些研究表明，MRI的分子成像的限制可以通过选择合适的分子生物标记物具有高的局部表达的病变，并使用小分子试剂，可以容易地排出体外7,8来克服。这些药物的主要特点是，它们针对大量存在于同一点存在于正常组织中的患病组织的分子标记。高浓度造影剂可以绑定到这些目标，造成suffi为有效MR分子成像古对比度增强。因为它们的尺寸比肾小球滤过阈值时，未结合的造影剂可以很容易地从主体具有减少背景噪声排出体外。我们已经选择了一个普遍的癌症相关的生物标志物，凝结的血浆蛋白，其中大量存在于肿瘤间质，并且很少出现在正常组织9。我们合成了含小靶向肽CGLIIQKNEC（CLT1），这表现出较强的特异性结合到PC3前列腺肿瘤模型10，和四的Gd-DOTA单酰胺螯合物有针对性的造影剂。在这里，我们为MR肿瘤分子成像技术来检测肿瘤的小鼠的方法。
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Protocol
改编自前研究11协议。
1。的Gd-DOTA的共轭CLT1肽
- 使用标准的固相肽合成法，从2 - 氯三苯甲基氯树脂（1.0毫摩尔）的Fmoc-保护的氨基酸合成肽CLT1（CGLIIQKNEC）。
- 加入最后的氨基酸后，环化树脂上的线性肽与铊（III）的三氟乙酸盐（1.09克，2.0毫摩尔，2当量）的DMF（20ml）中，在0℃搅拌2小时。
- 接着，共轭的PEG与赖氨酸的顺序来CLT1肽（1.0毫摩尔）在树脂中的N-末端依次用Fmoc-NH-PEG-COOH（3.0毫摩尔），FMOC-赖氨酸基（Fmoc）-OH（3.0毫摩尔）反应，以及第二批的Fmoc-赖氨酸基（Fmoc）-OH（6毫摩尔）。
- 用哌啶除去Fmoc。添加DOTA-三（叔丁基）（4.58克，8.0毫摩尔，2当量至每氨基基团）与在树脂2小时的赖氨酸树枝状聚合物的四个游离胺进行反应。
- 最后，切割和脱保护产品从树脂用三氟乙酸，水和triisobutylsilane（TIS）（20毫升，95/2.5/2.5）为8小时，在室温的鸡尾酒治疗。通过过滤，然后用三氟乙酸（TFA）洗涤除去树脂。加合并的滤液滴加至冷乙醚（200ml）中，离心，洗涤并用乙醚4倍。在真空下干燥，得到无色固体（1.99克，产率61％）。
- 用0-40％溶剂B（0.1％TFA的乙腈溶液）在溶剂A（0.1％TFA水溶液）梯度洗脱20分钟和40-90％溶剂B在溶剂A为10分钟，使用制备型HPLC纯化粗产物。
- 溶解CLT1-DL-（DOTA）4（250毫克，0.077毫摩尔）在DI水（15毫升），用1M的氢氧化钠将pH调节至6。添加的Gd（醋酸）3·4H 2 O（472毫克，0.462毫摩尔，1.5当量至DOTA单酰胺）中的部分溶液中，同时保持pH在6使用1M的NaOH。在RT搅拌反应溶液48小时。
- 复杂的残余钆（III）的随ethylenediaminetetraacetic乙酸（EDTA）（90毫克，0.31毫摩尔）和纯化粗产物用尺寸排阻柱，得到最终产物CLT1-DL-（钆-DOTA）4（169毫克，57％）。
2。造影剂的表征
- 测量钆（III）的含量与电感耦合等离子体发射光谱法。
- 获得（MALDI-TOF）的飞行时间的基质辅助激光解吸/电离质谱线性模式下与2,5 - 二羟基苯甲酸（2,5-DHB）作为基质。
- 测量CLT1-DL-（钆-DOTA）4的造影剂和非定标控制剂sCLT1-DL-（的Gd-DOTA）4用不同浓度的在60兆赫（1.5 T）的水溶液中的弛豫时间与relaxometer在37°C。使用反转恢复脉冲序列测量T1 和一个卡尔-赛尔Meiboom -吉尔序列500回声测Ŧ2。计算T 1和T 2弛豫次方从1 / T 1与1 / T 2相对于钆浓度曲线的斜率Ë代理商。
3。细胞培养动物模型的原位PC3前列腺肿瘤的形成与发展
- 培养PC3前列腺癌细胞与绿色荧光蛋白（GFP）中以2.5×10 4个细胞/微升PBS密度补充有5％胎牛血清和青霉素/链霉素/两性霉素B，收获通过胰蛋白酶消化并重新悬浮RPMI培养基中组成型表达。
- 根据批准的凯斯西储大学实验动物管理和使用委员会的动物协议的无胸腺动物核心设施，凯斯西储大学（CWRU）维持雄性NIH无胸腺裸鼠（4-5周龄）。
- 手术表面喷以2％洗必泰溶液，然后铺上吸水毛巾。在手术过程中无菌手术手套戴。动物手术前，注射的ip圣阿韦坦（250毫克/千克），以anesthetize为小鼠。或者，氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪可用于在50/5/1毫克/千克的浓度。眼用软膏施加到小鼠的麻醉过程中保持足够的水分。
- 通过切割一个小切口，通过皮肤和腹膜沿下部中线以约1厘米的长度用无菌手术刀开始手术。在生存手术无菌手术单上覆盖切口周围部位。
- 轻轻exteriorize和稳定的前列腺背叶，露出前列腺。注入的PC3-GFP细胞的悬浮液在PBS（20微升）与30号针的前列腺。最后伤口关闭切口autoclip 12。
- 对于后处理过程的监测，监测动物每天两次持续1周。疾病的症状包括缺乏饮食，尿道口周围深色尿收集和步态不稳这可能表明感染膀胱或闭塞的主食。
- 经过10天，除去叔他用主食主食卸妆。监测动物每日以评估肿瘤的大小和疼痛如体重减轻，行为的偏差，并且马达的缺陷的任何证据。安乐死这表明肿瘤大小超过肿瘤生长过程中的道德允许的极限疼痛或证据的动物。
4。荧光成像和组织学的肽的肿瘤结合特异性的确认
- 后肿瘤细胞接种，以便与成像开始之前大概4星期肿瘤生长。在注射前肽探针，获得的GFP荧光图像与活老鼠的荧光成像，以验证肿瘤的存在。
- 四注入德克萨斯红标记的肽对荷瘤小鼠为10 nmol /小鼠的剂量。
- 后来颈椎脱位牺牲小鼠2小时，收集肿瘤和主要器官，并在荧光成像仪马上图像。利用绿色滤光器的GFP（激发：444-490纳米，发射515纳米长通滤波器;采集设置：500-720在10纳米级）和红光滤光片为得克萨斯红（激发：576-621纳米;发射：635纳米长通滤波器;收购设置：630-800在10纳米级）。 10毫秒的曝光时间，GFP和150毫秒德克萨斯红。
- 随即整个组织的荧光测量后，收集肿瘤组织，用福尔马林固定，冰冻切片和成5微米切片。
- 用PBS清洗后，装入与1滴封固剂含有4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI），图像立即在共聚焦激光扫描显微镜。
5。磁共振成像（MRI）
- 之后大概4星期接种肿瘤细胞，使肿瘤长到0.3-0.6厘米，直径。使用7 T MRI扫描仪具有体积射频（RF）线圈MRI研究。
- 麻醉小鼠在异氟烷诱导室中的2％异氟醚 - 氧气混合物。 OPHthalmic软膏施加到小鼠的麻醉过程中保持足够的水分。
- 插入30号针入1.0米长的管道充满肝素生理盐水。将自制导管在小鼠尾静脉。
- 将鼠标放到磁铁，并通过鼻锥不断吸入麻醉用1.5％异氟醚氧。
- 放置连接到腹部以监测速率和呼吸的深度监测系统呼吸传感器。通过一个反馈控制系统，吹热风到磁体保持体温在37℃。
- 使用本地化序列，以确定肿瘤的位置（TR / TE = 200/3.7毫秒，FOV =与矢状切面图像开始3.0厘米，切片厚度为2.2毫米，片数= 16，平均= 2，翻转角= 45°，矩阵= 128×128）。
- 使用2D T1加权梯度脂肪抑制序列获得2D轴位图像获得CE-MRI（TR / TE = 151.2/1.9毫秒，FOV = 3.0厘米×3.0厘米，S虱厚度为1.2毫米，片数= 12，平均= 1，翻转角= 80°，矩阵= 128×128）。
- 注射前基线MR图像采集后，开始在0.03毫摩尔GD /千克的剂量用200微升生理盐水冲洗靶向药物或控制剂注入。
- 继续获取CE-MRI图像在不同时间点多达30分钟。
6。图像处理与分析
- 使用图像处理软件进行图像分析。
- 绘制的利益（投资回报），在整个肿瘤区和肾脏中的二维成像平面和测量平均信号强度。
- 量化CE-MRI数据，测量肿瘤或肾对比度增强（ΔSNR）通过使用下列方程的增加后的对比度信噪比超过预对比度信噪比的计算：ΔSNR=（S 吨/σT） - （S 0 /σ0），其中，S 0和S 吨表示的信号中的量子或或肾前和对比度，σ0，σ吨后是噪声之前和之后的对比从背景气测量的标准偏差。
- 通过计算学生的双尾t检验的P值，假设统计学意义为p <0.05。
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Representative Results
图1示出合成的靶向造影剂CLT1-DL-（钆-DOTA）4和实验的整体方案的。 CLT1-DL-（的Gd-DOTA） 图4示出高得多的弛豫比临床的Gd-DOTA（表1）。在1.5 T，每钆对T 1弛豫CLT1-DL-PBS中（钆-DOTA）4（pH 7.4）中的比的Gd-DOTA 10的高约3倍。大师成像证实了强特异性德克萨斯结合红标记CLT1（CLT1-TR）对肿瘤有小的结合到正常器官和组织，而对非特定加扰的肽（sCLT1-TR）示出了非常小的肿瘤结合（ 图2）。图3显示了典型的前置和后注入造影增强（CE）笔1加权像。靶向剂导致在肿瘤组织中更大和更长的增强相比，非靶向的加扰剂。在膀胱的对比度增强逐渐增大超过时，表明造影剂被通过肾滤过排泄。量化信号的分析表明，靶向剂产生更显著信号增强在肿瘤组织比对照剂（P <0.05）达30分钟。该生物分布研究显示剂具有最小的Gd滞留在主要器官和组织注射后2天。我们的初步数据表明，CLT1靶向MRI造影剂可以特异性地递送到肿瘤在相对低的剂量（临床剂量的三分之一）。
| R 2（毫米-1，-1） | 第1（毫米-1，-1） | Gd含量（毫摩尔钆/克） | |||
| 每个GD | 每个分子 | 每个GD | p呃分子 | ||
| CLT1-（GD-DOTA）4 | 10.1±1.0 | 40.4±3.0 | 13.0±3.1 | 52.0±9.6 | 1.05±0.10 |
| sCLT1-（GD-DOTA）4 | 11.5±1.4 | 46.0±5.0 | 12.4±0.3 | 49.6±1.3 | 0.97±0.08 |
| GD-DOTA 4 | 2.9 * | 2.9 * | 3.2 * | 3.2 * | |
表1中。目标和炒MRI对比剂在1.5T的物理化学性质，37℃（*弛豫进行的Gd-DOTA在水中，在37℃是从参照图10）。
> 图1。合成过程和整体实验的图形化描述。 点击这里查看大图 。
图2。肿瘤CLT1-TR的结合。靶向CLT1-TR（A）和非靶向sCLT1-TR（B）静脉注射到无胸腺裸鼠原位PC3-GFP前列腺为10 nmol /小鼠的剂量。2小时后，肿瘤和各种器官收集和成像。绿色荧光图像是从PC3-GFP的肿瘤细胞。红色荧光图像是从CLT1-TR（A）和sCLT1-TR（B）的探针。 1。肿瘤; 2。脾; 3。心脏; 4。肾; 5。睾丸; 6。肝脏; 7。肺; 8。肌肉; 9。大脑。565fig2highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图3。代表性的T1加权二维轴向梯度原位PC-3人前列腺肿瘤之前和之后静脉注射CLT1-DL-（的Gd-DOTA）4（A）和sCLT1-DL-（钆-DOTA）4（B）中的图像0.03毫摩尔GD /公斤nu / nu小鼠，肿瘤标记为红色的圆圈和膀胱标有绿色圆圈。 点击这里查看大图 。
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Discussion
关键步骤
选择适当的生物标志物和靶向小肽
成功开发小尺寸的靶向造影剂，两个关键点需要考虑。首先，要选择合适的分子生物标志物是大量存在于同一点存在于正常组织中病变组织是重要的。我们选择了与癌症相关的生物标志物，凝结血浆蛋白，符合这一要求。其次，所选择的目标明确的小分子药物应具有的生物标志物高结合亲和力，使足够的造影剂可以绑定到这些目标，造成足够的对比度增强。在这项研究中，我们选择了血块结合肽CLT1，显示较强的特异性结合在肿瘤11凝结的血浆蛋白。
造影剂的合成
肽合成包括牛idizing在直链肽分子具有两个硫醇基团，以形成最终的环状CLT1肽。而肽环化在溶液中以低浓度通常进行的，以尽量减少潜在的聚集，二聚和寡聚化，树脂上的环化采用的伪稀释现象的优点，以及通过简单的洗涤和过滤13去除试剂。在我们的合成过程中，我们发现，在树脂上环化用铊（III）三氟高产小二聚化效果很好，虽然铊（III）三氟非常有毒，必须注意在处理它采取。第二种方法是使用20％DMSO溶液在低肽浓度。但是还需要更多的步骤来删除DMSO和冻干的大量解决方案需要更长的时间。通过使用任一方法中，关键的是要确保完全形成的分子内二硫键的。当络合与钆的肽配体，游离硫醇可诱发大量聚集，因为微量金属在缓冲催化空气氧化，导致半胱氨酸的过氧化，形成聚合14。这通常显着地降低最终产物的收率和纯度。为了确保完整的二硫键带的形成，首先我们需要用温和的氧化条件，以避免形成分子间二硫键导致二聚体或更高的低聚物的形成。其次，足够长的反应时间应保持，以确保所有的硫醇基团的共轭钆步骤之前被氧化。
小鼠尾静脉动物模型和插管
是动物肿瘤模型和尾静脉插管的准备也是这个过程的非常重要的方面。在手术过程中，工具/工作台必须保持清洁和消毒，以避免可能伤害或杀死老鼠潜在的感染。为了避免前后注射移动鼠标化，有必要对导管插入小鼠尾静脉。要准备导管插管，打破来自集线器的30号针头插入钝端插入1.0米长的管道，并连接油管装有1％肝素生理盐水的注射器的另一端。推动注射器来填充管道。扩张尾用温水（〜105°F）。将针头插入静脉。血液回流到管道指示导管插入成功。为了验证该针在静脉，轻轻推注射器和生理盐水可以顺利注入，静脉被清除与注射少量生理盐水。将鼠标移动到扫描仪之前修复导管的位置用胶带。
限制和可能的修改
有几个限制在我们的研究中。首先，从初步结果，我们发现，CLT1洗出非常快速地从目标网站，虽然它的shOWS优秀结合肿瘤在体内的蛋白酶降解可能导致CLT1的不稳定性。 CLT1的修改，以防止蛋白降解，应提高其稳定性并延长其洗出时间在体内 。使用D型氨基酸取代天然的L-型氨基酸是实现这一目标的一个潜在策略。其次，目前的研究并没有明确的凝固的血浆蛋白的CLT1肽结合到它的确切成分。最后，我们合成了造影剂主要是利用固相合成用相对低的产率和高的成本。显影的液相合成方法应提高产量和降低成本。
应用
我们正在开发的技术进行精确探测小恶性肿瘤对比增强MRI检查。 MRI与目标代理提供了一种更有效和更安全的替代对癌症分子成像。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国心脏协会GRA 09春季博士后奖学金（09POST2250268）和NIH R01 CA097465支持的一部分。我们高度赞赏文力博士和维卡斯Gulani博士MRI方案的测试和设置，和Yvonne帕克女士为她的肿瘤植入援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fmoc protected amino acids | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimidyl ester, single isomer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC system | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Imaging System | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI scanner | Bruker | ||
References
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