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Medicine

MR Molekulare Bildgebung von Prostatakrebs mit einem kleinen Molecular Targeted CLT1 Peptid-Kontrastmittel

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50565
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Translational Hematology & Oncology Research, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University, 3Department of Molecular Biology & Microbiology, Case Western Reserve University

Summary

Um MR Krebs molekulare Bildgebung mit einem kleinen Peptid gezielte MRT-Kontrastmittel spezifischen geronnen Plasmaproteine ​​in Tumorstroma in einem Mausmodell zeigen, Prostata-Krebs.

Abstract

Tumorextrazellulären Matrix hat Fülle von Krebs-verwandte Proteine, die als Biomarker für Krebs molekularen Bildgebung verwendet werden können. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, effektive MR Krebs molekularen Bildgebung mit einer kleinen molekulares Peptid gezielt Gd-DOTA monoamid komplex wie eine gezielte MRT-Kontrastmittel spezifischen geronnen Plasmaproteinen in Tumor Stroma. Wir führten den Versuch, die Wirksamkeit des Mittels zum nicht-invasiven Nachweis von Prostata-Tumor in einer Maus MRI orthotopen PC-3-Prostatakrebs-Modell. Die gezielte Kontrastmittel wirksam war, um signifikante Tumorkontrastverstärkung bei einer niedrigen Dosis von 0,03 mmol Gd / kg zu produzieren. Das Peptid gezielte MRT-Kontrastmittel ist vielversprechend für MR molekularen Bildgebung der Prostata-Tumor.

Introduction

Effektive Bildgebung bei Krebserkrankungen molekulare Ziele ist von großer Bedeutung, um die Richtigkeit der früheren Erkennung und Diagnose von Krebs verbessern. Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein leistungsfähiges klinischen Bildgebungsverfahren mit hoher räumlicher Auflösung und ohne ionisierende Strahlung ein. Allerdings ist keine gezielte Kontrastmittel für die MR klinischen Krebs molekulare Bildgebung zur Verfügung. Innovatives Design und Entwicklung von gezielten MRI-Kontrastmittel würde die Anwendung der MR-Bildgebung der molekularen Krebs stark voranzutreiben. Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen, um gezielte Kontrastmittel für die MR-Bildgebung der Biomarker auf der Oberfläche von Krebszellen exprimiert zu entwickeln. Aufgrund der relativ geringen Sensitivität der MRT und niedriger Konzentration dieser Biomarker, ist es eine Herausforderung, genügend Kontrastverstärkung für eine effektive MR molekulare Bildgebung mit kleinen molekulare zielgerichtete Kontrastmittel 2,3 generieren. Um eine ausreichende Verstärkung zu erhalten, erfolg verschiedenen Delivery-Systemeh, wie Liposomen, Nanopartikel und Polymer-Konjugate mit einer hohen Nutzlast von paramagnetischen Gd (III)-Chelate sind vorbereitet, um lokale Konzentration von Kontrastmitteln an den Zielstellen 4,5 zu erhöhen. Obwohl diese Abgabesysteme konnten signifikante Tumorverstärkung in Tiermodellen zu erzeugen, in Folge ihrer großen Größen in langsame und unvollständige Ausscheidung aus dem Körper, was zu einer verlängerten Akkumulation toxischer Gd (III)-Ionen, die schwere Sicherheitsbedenken 6 verursachen kann. Kürzlich haben einige Studien gezeigt, dass die Grenzen der MRT für die molekulare Bildgebung kann durch Auswahl der richtigen molekularen Biomarkern mit hoher Orts Ausdruck in den Läsionen und mit kleinen molekularen Mittel, die leicht ausgeschieden werden können 7,8 überwunden werden. Das Schlüsselmerkmal dieser Mittel ist, dass sie molekulare Marker reichlich in den erkrankten Geweben mit geringer Anwesenheit in normalen Geweben vorhanden Ziel. Eine hohe Konzentration von Kontrastmittel können auf diese Ziele zu binden, was ausreiziente Kontrastverstärkung für eine effektive MR molekularen Bildgebung. Seit ihrer Größe kleiner als die renale Filtration Schwellenwert ist, kann ungebundenes Kontrastmittel leicht aus dem Körper mit reduziertem Hintergrundrauschen ausgeschieden werden. Wir haben eine universelle krebsbezogenen Biomarker geronnenen Plasma-Proteine, die in großen Mengen in Tumorstromas bestehen, ausgewählt, und werden selten in normalen Geweben 9 vorhanden. Wir synthetisierten eine gezielte Kontrastmittel, das eine kleine Zielpeptid CGLIIQKNEC (CLT1), die eine starke spezifische Bindung an das PC3 Prostata-Tumor-Modell 10, und vier Gd-DOTA Monoamid Chelate zeigten. Hier bieten wir eine Methodik für die MR-Bildgebung zur molekularen Krebstumoren in Mäusen zu erkennen.

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Protocol

Protokoll angepasst aus einer früheren Studie 11.

1. Konjugation von Gd-DOTA, um CLT1 Peptide

  1. Verwendung von Standard-Festphasenpeptidsynthese synthetisiert CLT1 Peptid (CGLIIQKNEC) von Fmoc-geschützten Aminosäuren an einer 2-Chlortritylchloridharz (1,0 mmol).
  2. Nach Zugabe von endständigen Aminosäure, cyclisieren des linearen Peptids auf dem Harz mit Thallium (III) trifluoracetat (1,09 g, 2,0 mmol, 2 Äquivalente) in DMF (20 ml) bei 0 ° C für 2 Stunden.
  3. Weiter, PEG-Konjugat und Lysin sequentiell an den N-Terminus des Peptids CLT1 (1,0 mmol) auf, das durch Umsetzung sequentiell mit Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol) Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3,0 mmol), und eine zweite Charge von Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
  4. Entfernen Fmoc mit Piperidin. Hinzufügen DOTA-Tris-(t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 Äquivalente zu jeder Aminogruppe), mit den vier freien Amine der Lysin Dendrimer auf das Harz für 2 Stunden reagieren.
  5. Schließlich spalten und Entschützen das Produktvon dem Harz durch Behandlung mit einer Mischung aus Trifluoressigsäure, Wasser und Triisobutylsilan (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) für 8 h bei RT. Entfernen des Harzes durch Filtration, gefolgt von Waschen mit Trifluoressigsäure (TFA). Fügen die vereinigten Filtrate tropfenweise zu kaltem Ethylether (200 ml), Zentrifuge, und Waschen mit Ethylether 4x. Trocknen unter Vakuum zu einem farblosen Feststoff (1,99 g, 61% Ausbeute).
  6. Das Rohprodukt wird mit präparativer HPLC unter Verwendung eines Gradienten von 0-40% Lösungsmittel B (0,1% TFA in Acetonitril) in Lösungsmittel A (0,1% wässriger TFA-Lösung) für 20 min und 40-90% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A für 10 min .
  7. Auflösen CLT1-DL-(DOTA) 4 (250 mg, 0,077 mmol) in DI-Wasser (15 ml) und auf pH 6 unter Verwendung von 1 M NaOH. Hinzufügen Gd (OAc) 3 · 4H 2 O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 Äquivalente DOTA Monoamid) in Portionen zu der Lösung, während der pH bei 6 unter Verwendung von 1 M NaOH. Das Reaktionslösung bei Raumtemperatur für 48 Stunden.
  8. Komplexe der Rest Gd (III) mit Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), und das rohe Produkt mit einer Größenausschlusssäule, um das Endprodukt zu erhalten CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).

2. Charakterisierung von Kontrastmittel

  1. Messen Gd (III)-Gehalt mit induktiv gekoppelten Plasma-optische Emissionsspektroskopie.
  2. Erwerben Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF)-Massenspektren im linearen Modus mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB) als Matrix.
  3. Messen Relaxationszeiten der wässrigen Lösung der Kontrastmittel von CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 und einem Steuermittel nontargeted sCLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 mit verschiedenen Konzentrationen bei 60 MHz (1,5 T) mit einem Relaxometer bei 37 ° C. Verwenden Sie eine Inversion-Recovery-Pulssequenz zu T 1 und eine Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Sequenz mit 500 Echos messen, um T 2 zu messen. Berechnen T 1 und T 2-Relaxivität des thE Mittel von den Pisten der Grundstücke von 1 / T 1 und 1 / T 2 im Vergleich zu den Gd-Konzentrationen.

3. Zellkultur und Entwicklung von Tiermodell mit Orthotopische PC3 Prostata-Tumor

  1. Kultur PC3-Prostatakrebszellen mit konstitutiver Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in RPMI-Medium mit 5% fötalem Rinderserum und Penicillin / Streptomycin / Fungizon Ernte durch Trypsinierung und resuspendieren supplementiert Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen / &mgr; l PBS.
  2. Pflegen NIH männlichen Nacktmaus (4-5 Wochen alt) an der Athymische Tier Core Facility, Case Western Reserve University (CWRU) nach einem von der CWRU Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt Tier-Protokoll.
  3. Die chirurgischen Oberflächen wurden mit 2% Chlorhexidin-Lösung besprüht und dann mit saugenden Tüchern abgedeckt. Sterile OP-Handschuhe wurden während des Verfahrens tragen. Vor der Tierchirurgie, ip injizieren Avertin (250 mg / kg) zu anesthetize die Mäuse. Alternativ kann Ketamin / Xylazin / Acepromazin in einer Konzentration von 50/5/1 mg / kg verwendet werden. Augensalbe wurde in der Maus aufgetragen, um während der Narkose ausreichende Feuchtigkeit beizubehalten.
  4. Startet die Operation, indem ein kleiner Einschnitt durch die Haut und Bauchfell entlang der unteren Mittellinie auf eine Länge von etwa 1 cm mit einem sterilen Skalpell. Eine sterile Operationstuch wurde um das Überleben während der Einschnittstelle Operationen abgedeckt.
  5. Sanft exteriorisieren und stabilisieren die Prostata dorsalen Lappen, um die Prostata aus. Die Suspension wird von PC3-GFP-Zellen in PBS (20 ul) in die Prostata mit einer 30-Gauge-Nadel. Schließlich schließen Sie den Schnitt mit Wund Pusher 12.
  6. Für post-Verfahren Überwachung, Überwachung Tiere zweimal pro Tag für 1 Woche. Zeichen der Krankheit gehören der Mangel an Essen, dunkler Urin Sammel um Harnröhre, und unsicherer Gang, die Infektion oder Verschluss der Blase in den Klammern geben könnte.
  7. Nach 10 Tagen entfernen ter Heftklammern mit einer Heftklammer-Entferner. Überwachen Sie die Tiere täglich zu Tumorgröße und keine Anzeichen von Schmerzen wie Gewichtsverlust, Verhaltensabweichungen und Motor Mängel zu beurteilen. Euthanize die Tiere, die eine Tumorgröße über dem zulässigen Grenzwert ethisch oder Nachweis von Schmerzen beim Tumorwachstum zeigten.

4. Bestätigung der Tumorbindungsspezifität der Peptide mit Fluoreszenz-Imaging und Histologie

  1. Nach Inokulation der Tumorzellen ermöglichen ca. 4 Wochen nach Tumorwachstum vor Beginn der Bildgebung. Vor der Injektion der Peptid-Sonden erfassen GFP-Fluoreszenzbilder mit lebenden Mäusen auf einem Fluoreszenz-Imager, um die Gegenwart eines Tumors zu verifizieren.
  2. Iv injizieren Texas Red markierten Peptide in den Tumor-tragenden Mäusen in einer Dosis von 10 nmol / Maus.
  3. Opfere die Mäuse zwei Stunden später durch Genickbruch, sammeln den Tumor und wichtigsten Organe, und sofort Bild auf einem Fluoreszenz-Imager. Verwenden Sie grünes Licht Filter für GFP (Anregung: 444-490 nm, Emission: 515 nm Langpassfilter; Erwerb Einstellungen: 500 bis 720 in 10 nm-Schritten) und Rotlichtfilter für Texas Red (Anregung: 576-621 nm; Emission: 635 nm Langpassfilter; Erwerb Einstellungen: 630 bis 800 in 10 nm-Schritten). 10 ms Belichtungszeit für GFP und 150 ms für Texas-Rot.
  4. Sofort nach der Messung von ganzen Gewebefluoreszenz, sammeln Tumorgewebe, fix mit Formalin und Kryoschnitt in 5 um Scheiben schneiden.
  5. Nach dem Spülen mit PBS, montieren mit 1 Tropfen Eindeckmedium mit 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI), Bild sofort auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop.

5. Magnetic Resonance Imaging (MRI)

  1. Etwa 4 Wochen nach Inokulation der Tumorzellen ermöglichen die Tumoren auf 0,3 bis 0,6 cm im Durchmesser wachsen. Verwenden Sie eine 7 T-MRT mit einem Volumen Radiofrequenz (RF)-Spule für die MRT-Studie.
  2. Anesthetize die Maus mit einer 2% Isofluran-Sauerstoff-Gemisch in einer Isofluran Induktionskammer. Ophthalmic Salbe wurde auf die Maus aufgetragen, um während der Narkose ausreichend Feuchtigkeit zu halten.
  3. Legen Sie eine 30-Gauge-Nadel in einem 1,0 m langen Schlauch mit Heparin-Kochsalzlösung gefüllt. Legen Sie die Self-made-Katheter in der Maus Schwanzvene.
  4. Platzieren Sie die Maus in den Magneten und unter Inhalationsnarkose mit Isofluran 1,5%-Sauerstoff-halten über eine Nasenkegel.
  5. Legen einen Atmungssensor mit einem Überwachungssystem auf dem Bauch, um Frequenz und Tiefe der Atmung überwachen. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37 ° C durch Einblasen von Warmluft in den Magneten durch ein Rückkopplungssteuersystem.
  6. Beginnen Sie mit Sagittalschnitt Bilder mit einem Lokalisierungssequenz, um die Tumorlokalisation (TR / TE = 200/3.7 ms, FOV = identifizieren 3,0 cm, Schichtdicke = 2,2 mm, Slice-Nummer = 16, Durchschnitts = 2, Flip-Winkel = 45 °, Matrix = 128 × 128).
  7. Verwenden Sie ein 2D-T1-Gradienten Fettunterdrückung Sequenz 2D Axialbilder für die CE-MRI (TR / te = 151.2/1.9 ms FOV = 3,0 x 3,0 cm cm, s erwerbenLäuse Dicke = 1,2 mm, Slice-Nummer = 12, Durchschnitts = 1, Flip-Winkel = 80 °, Matrix = 128 x 128).
  8. Nach Voreinspritzung Grundbild MR-Aufnahme, beginnen die zielorientierte Agens oder Kontrollmittel in einer Dosis von 0,03 mMol Gd / kg injiziert durch Spülen mit 200 ul Kochsalzlösung.
  9. Weiterhin CE-MRI-Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 30 Minuten erhalten.

6. Bildverarbeitung und-analyse

  1. Verwenden Imaging-Software für die Bildanalyse.
  2. Zeichnen Sie die Regionen von Interesse (ROI) über den gesamten Tumor und die Nieren in der zweidimensionalen Bildebene und messen durchschnittliche Signalintensität.
  3. Um die CE-MRT-Daten zu quantifizieren, messen Tumor-oder Nierenkontrastverbesserung (ΔSNR) durch Berechnung der Erhöhung der Post-Kontrast-SNR über Vor-Kontrast-SNR nach der folgenden Gleichung: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), wobei S 0 und S t bezeichnen das Signal in der TUModer oder die Nieren vor und nach dem Kontrast und σ 0 und σ t die Standardabweichung des Rauschens von der Hintergrundluft vor und nach dem Kontrast.
  4. Berechnen Sie die p-Werte mit Hilfe der Schüler zweiseitigen t-Test, unter der Annahme, statistisch signifikant, p <0,05.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Synthese des gezielten Kontrastmittel CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 und dem Gesamtkonzept des Experiments. CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 zeigt deutlich höhere Relaxivität als klinische Gd-DOTA (Tabelle 1). 1,5 T, ist die T 1-Relaxivität des Gadolinium pro CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 in PBS (pH 7,4) etwa 3-mal höher als die von Gd-DOTA 10. Maestro Abbildungs ​​bestätigt die starke spezifische Bindung von Texas Red markierten CLT1 (CLT1-TR), Tumor mit wenig Bindung an normale Organe und Gewebe, während die nicht-spezifischen verschlüsselten Peptid (sCLT1-TR) zeigt sehr geringe Tumorbindungs ​​(Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt typische Vor-und Nacheinspritzung kontrastverstärkten (CE) T 1-gewichtete Bilder. Das zielorientierte Agens führt zu einer höheren und mehr Verstärkung in Tumorgewebe im Vergleich zu Nicht-Zielmittel verschlüsselt. Kontrastverstärkung in der Harnblase allmählich überZeit, die anzeigt, dass die Kontrastmittel wurden durch renale Filtration ausgeschieden. Quantitative Signalanalyse zeigt, dass das zielorientierte Agens hergestellt signifikanter Signalverstärkung im Tumorgewebe als die Kontrollmittel (p <0,05) bis zu 30 min. Die Studie zeigt, biologische Verteilung der Agent hat minimale Gd Einlagerungen in den wichtigsten Organen und Geweben, 2 Tage nach der Injektion. Unsere vorläufigen Daten zeigen, daß CLT1 gezielte MRI-Kontrastmittel kann spezifisch auf den Tumor bei relativ niedrigen Dosis (ein Drittel der klinischen Dosis) geliefert werden.

r 2 (mm -1. s -1) R 1 (mM -1. s -1) Gd-Gehalt (mmol-Gd / g)
pro Gd pro Molekül pro Gd per Molekül
CLT1-(Gd-DOTA) 4 10,1 ± 1,0 40,4 ± 3,0 13,0 ± 3,1 52,0 ± 9,6 1,05 ± 0,10
sCLT1-(Gd-DOTA) 4 11,5 ± 1,4 46,0 ± 5,0 12,4 ± 0,3 49,6 ± 1,3 0,97 ± 0,08
Gd-DOTA 4 2,9 * 2,9 * 3.2 * 3.2 *

Tabelle 1. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gezielte und Rührei MRI-Kontrastmittel bei 1,5 T, 37 ° C (* Relaxivitäten für Gd-DOTA in Wasser bei 37 ° C sind von Referenz 10).

Figur 1
> Abbildung 1. Grafische Darstellung der Syntheseverfahren und der Gesamt Experiment. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Figur 2
2. Bindung von Tumor CLT1-TR. Gezielte CLT1-TR (A) und Nicht-Ziel sCLT1-TR (B) wurden intravenös injiziert, um Nacktmäusen orthotopen PC3 Prostata-GFP in einer Dosis von 10 nmol / Maus athymischen. Nach 2 Stunden Tumoren und verschiedene Organe wurden gesammelt und abgebildet. Grüne Fluoreszenz-Bilder sind von PC3-GFP-Tumorzellen. Rote Fluoreszenz Bilder sind von CLT1-TR (A) und sCLT1-TR (B)-Sonden. 1. Tumor; 2. Milz; 3. Herz, 4. Niere; 5. Hoden; 6. Leber; 7. Lunge; 8. Muskel; 9. Gehirn.565fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Fig. 3
3. Repräsentative T1-gewichtete axiale 2D-Bilder der Gradient orthotopen PC-3 menschlichen Prostatatumor vor und nach der intravenösen Injektion von CLT1-DL-(Gd-DOTA), 4 (A) und sCLT1-DL-(Gd-DOTA), 4 (B) 0,03 mmol Gd / kg in nu / nu Mäusen. Tumor mit rotem Kreis und Blase mit grünen Kreis markiert ist. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Kritische Schritte

Die richtige Auswahl der Biomarker und auf kleine Peptide

Um erfolgreich zu entwickeln eine gezielte Kontrastmittel mit geringen Abmessungen, müssen zwei wichtige Punkte beachtet werden. Zunächst ist es wichtig, die richtige molekulare Biomarker, die reichlich in erkrankten Geweben mit wenig Präsenz in normalen Geweben vorhanden sind, zu wählen. Unsere ausgewählten krebsbedingte Biomarker, geronnen Plasmaproteine, erfüllt diese Anforderung. Zweitens sollten die ausgewählten zielgerichtete, niedermolekulare Agenten hohe Bindungsaffinität für die Biomarker haben, so dass genügend Kontrastmittel können zu diesen Zielen zu binden, was genug Kontrastverstärkung. In dieser Studie haben wir uns für das Gerinnsel-Bindungspeptid CLT1, die starke spezifische Bindung an die geronnenen Plasmaproteinen in den Tumor 11 zeigt.

Kontrastmittel-Synthese

Das Peptid Synthese beinhaltet oxidizing zwei Thiol-Gruppen in der linearen Peptidmolekül zur endgültigen zyklischen CLT1 Peptid zu bilden. Während Peptid Cyclisierung wird normalerweise in Lösung bei niedrigen Konzentrationen durchgeführt, um mögliche Aggregation, Dimerisierung und Oligomerisierung zu minimieren, nimmt Harz Cyclisierung Vorteil der Pseudo-Verdünnungsphänomen als auch die Entfernung von Reagenzien durch einfaches Waschen und Filtration 13. In unserer Syntheseverfahren, finden wir, dass auf dem Harz-Cyclisierung mit Thallium (III) Trifluoracetats gut mit hoher Ausbeute und wenig Dimerisierung funktioniert, obwohl Thallium (III)-trifluoracetat ist sehr giftig und muss darauf geachtet werden, während Handhabung. Ein zweiter Ansatz nutzt 20% DMSO in Lösung bei niedrigen Peptidkonzentration. Jedoch weitere Schritte erforderlich, um DMSO zu entfernen, und das Lyophilisieren der Lösung großvolumigen länger dauert. Durch die Verwendung von beiden Methoden ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass der vollständige Bildung des intramolekulare Disulfidbrücken. Wenn Komplexierung des Peptidliganden mit Gd, die freien Thiole induzieren kann,wesentliche Aggregationen weil Spurenmetalle in der Pufferluftoxidation zu katalysieren, was in der Überoxidation von Cystein, um die Polymerisation 14 zu bilden. Dies verringert in der Regel deutlich die Ausbeute und Reinheit des Endprodukts. Um sicher zu Disulfid komplette Bandbildung zu machen, müssen wir zuerst milden Oxidationsbedingungen zu verwenden, um die Bildung von intermolekularen Disulfidbrücke was Dimer oder höheres Oligomer Bildung zu vermeiden. Zweitens sollte lang genug Reaktionszeit beibehalten werden, um sicherzustellen, dass alle Thiolgruppen vor der Gd Konjugationsschritt oxidiert.

Tiermodell und Kanülierung Mausschwanzvene

Herstellung des Tiertumormodell und Schwanzvene Kanülierung sind ebenfalls sehr wichtige Aspekte dieses Verfahrens. Während der Operation muss die Werkzeuge / Sitzbank sauber und steril gehalten werden, um eine mögliche Infektion, die die Mäuse verletzen oder töten könnte. Um zu vermeiden, bewegen Sie die Maus vor und nach der Injektiontion, ist es notwendig, Mausschwanzvene kanülieren. Um den Katheter für Kanülen vorzubereiten, brechen sie ein 30-Gauge-Nadel von der Nabe und legen Sie die stumpfen Ende in einen 1,0 m langen Schlauch, und verbinden Sie das andere Ende des Schlauches mit einer Spritze mit 1% Heparin Kochsalzlösung geladen. Schieben Sie die Spritze zu füllen, die Schläuche. Dilatation der Schwanz mit warmem Wasser (~ 105 ° F). Führen Sie die Nadel in die Vene. Blutrückfluss in der Rohrleitung zeigt die erfolgreiche Einführung des Katheters. Um sicherzustellen, dass die Nadel in die Vene, schieben die Spritze und die Salzlösung gleichmßig eingespritzt werden, die Vene mit der Injektion einer kleinen Menge Kochsalzlösung gelöscht. Befestigen Sie den Katheter mit Klebeband, bevor Sie die Maus auf den Scanner.

Einschränkungen und mögliche Änderungen

Es gibt einige Einschränkungen in der aktuellen Studie. Erstens aus den vorläufigen Ergebnissen, die wir feststellen, dass CLT1 wäscht sehr schnell von der Website Targeting obwohl es shows ausgezeichnete Bindung an den Tumor. In vivo proteolytischen Abbau wahrscheinlich bewirkt, dass die Instabilität der CLT1. Änderung der CLT1 gegen proteolytischen Abbau zu schützen sollte seine Stabilität zu verbessern und zur Verlängerung der Wash-out-Zeit in vivo. Verwendung von D-Aminosäuren die natürliche L-Aminosäuren zu ersetzen, ist eine mögliche Strategie, um dieses Ziel zu erreichen. Zweitens hat die aktuelle Studie nicht klären, welche genauen Komponenten in den geronnenen Plasmaproteine ​​der CLT1 Peptid bindet an. Schließlich synthetisieren wir die Kontrastmittel vor allem unter Verwendung von Festphasensynthese mit relativ geringen Ausbeute und hohen Kosten. Die Entwicklung einer Flüssigphasensynthese-Methode sollte die Ausbeute zu erhöhen und die Kosten senken.

Anwendungen

Wir entwickeln Techniken für die genaue Erfassung von kleinen bösartigen Tumoren mit kontrastverstärkten MRT. MRT mit der gezielten Agent bietet eine effizientere und sicherere Alternative für Krebs der molekularen Bildgebung.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird teilweise von der American Heart Association GRA Frühling 09 Postdoctoral Fellowship (09POST2250268) und dem NIH R01 CA097465 unterstützt. Wir schätzen Dr. Wen Li und Dr. Vikas Gulani für MRI-Protokoll Test-und Setup, und Frau Yvonne Parker für ihre Unterstützung bei der Tumorimplantation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Fmoc protected amino acids EMD Chemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu) TCI America
PyBOP, HOBt, HBTU Nova Biochem
DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS Sigma-Aldrich Corp.
Texas Red, succinimidyl ester, single isomer Invitrogen T20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 HPLC system Agilent
ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column Agilent
ICP-–S Optima 3100XL Perkin-Elmer
MALDI-TOF mass spectrometer Bruker AutoflexTM Speed
Maestro FLEX In Vivo Imaging System Cambridge Research Instrumentation, Inc.
Biospec 7T MRI scanner Bruker

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References

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