Summary
For å demonstrere MR cancer molekyl avbildning med et lite peptid målrettet MRI-kontrastmiddel som er spesifikk for levret plasmaproteiner i tumor stroma i en musemodell av prostatakreft.
Abstract
Tumor ekstracellulær matriks har overflod av kreftrelaterte proteiner som kan brukes som biomarkører for cancer molekyl avbildning. I dette arbeidet, viste vi effektive MR kreft molekylær avbildning med en liten molekylær peptid målrettet Gd-DOTA monoamide komplisert som en målrettet MR-kontrastmiddel som er spesifikk for klumpete plasmaproteiner i tumor stroma. Vi utførte forsøket for å vurdere effektiviteten av midlet for ikke-invasiv påvisning av prostatatumor med MRI i en mus orthotopic PC-3 prostata cancer-modellen. Den målrettede kontrastmiddel som var effektivt til å produsere betydelig tumorkontrastforbedring ved en lav dose på 0,03 mmol Gd / kg. Peptid målrettede MR-kontrastmiddel er lovende for MR molekylær avbildning av prostata svulst.
Introduction
Effektiv avbildning av kreftrelaterte molekylære mål er av stor betydning for å forbedre nøyaktigheten av tidligere kreft deteksjon og diagnose. Magnetic resonance imaging (MRI) er en kraftig klinisk avbildningsfunksjonalitet med høy romlig oppløsning og ingen ionisering stråling en. Imidlertid er ingen målrettede kontrastmiddel tilgjengelig for klinisk MR cancer molekyl avbildning. Innovativ design og utvikling av målrettede MR kontrastmidler i stor grad vil fremme bruk av MR kreft molekylær avbildning. Betydelige anstrengelser er blitt gjort for å utvikle målrettede kontrastmidler for MR-avbildning av biomarkører som uttrykkes på overflaten av kreftceller. På grunn av relativt lav følsomhet for MRI og lav konsentrasjon av slike biomarkører, er det en utfordring å generere tilstrekkelig kontrastforbedring for effektiv molekylær MR avbildning ved hjelp av små molekylære målrettede kontrastmidler 2,3. For å oppnå tilstrekkelig forbedring, ulike leveringssystemer lykkesh som liposomer, nanopartikler og polymer konjugater med en høy nyttelast på paramagnetiske Gd (III) chelates har vært forberedt på å øke lokal konsentrasjon av kontrastmidler ved målet nettsteder 4,5. Selv om disse avgivelsessystemer var i stand til å generere betydelig tumor forbedring i dyremodeller, deres store størrelser resulterte i langsom og ufullstendig eliminering fra kroppen, noe som resulterer i en forlenget akkumulering av toksiske Gd (III)-ioner, som kan forårsake alvorlige sikkerhetsproblemer 6. Nylig har noen studier vist at begrensningene i MR for molekylær avbildning kan overvinnes ved å velge riktige molekylære biomarkører med høy lokal uttrykk i lesjoner og ved hjelp av små molekylære stoffer som lett kan skilles ut 7,8. Det sentrale trekk ved disse midlene er at de målet molekylære markører rikelig tilstede i sykt vev med liten tilstedeværelse i normalt vev. En høy konsentrasjon av kontrastmidler kan binde seg til disse målene, som resulterer i tilstrekkelig kontrastforbedring for effektiv MR molekylær avbildning. Siden deres størrelse er mindre enn den renal filtrering terskel, kan kontrastmidler ubundne lett kan utskilles fra kroppen med redusert bakgrunnsstøy. Vi har valgt en universell kreftrelaterte biomarkør, levret plasmaproteiner, som rikelig eksisterer i tumor stroma, og er sjelden til stede i normalt vev ni. Vi har syntetisert en målrettet kontrastmiddel inneholdende en liten målretting peptid CGLIIQKNEC (CLT1), som viste en sterk spesifikk binding til PC3 prostatatumormodell 10, og fire Gd-DOTA monoamide chelater. Her gir vi en metodikk for MR kreft molekylær avbildning for å oppdage svulster i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoll tilpasset fra en tidligere studie 11..
En. Bøyning av Gd-DOTA til CLT1 Peptide
- Ved hjelp av standard fast-fase peptidsyntese, syntetisere CLT1 peptid (CGLIIQKNEC) fra Fmoc-beskyttede aminosyrer på et to-chlorotrityl klorid-harpiks (1,0 mmol).
- Etter tilsetning endelige aminosyre, ringsluttes det lineære peptid på harpiksen med tallium (III) trifluoracetat (1,09 g, 2,0 mmol, 2 ekvivalenter) i DMF (20 ml) ved 0 ° C i 2 timer.
- Deretter PEG-konjugat og lysin sekvensielt til N-enden av peptid CLT1 (1,0 mmol) av harpiksen ved omsetning i rekkefølge med Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3,0 mmol), og et andre parti av Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
- Fjern Fmoc med piperidinamid. Legg DOTA-tris (t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 ekvivalenter til hver aminogruppe) for å reagere med de fire frie aminer fra lysin dendrimer på harpiksen i 2 timer.
- Til slutt, holde seg og avbeskytte produktetfra harpiksen ved behandling med en blanding av trifluoreddiksyre, vann og triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) i 8 timer ved romtemperatur. Fjern harpiksen ved filtrering etterfulgt av vasking med trifluoreddiksyre (TFA). Tilsett de kombinerte filtratene dråpevis til kald etyleter (200 ml), sentrifuger og vask med etyleter 4x. Tørk under vakuum for å gi et farveløst faststoff (1,99 g, 61% utbytte).
- Rens det urene produkt med preparativ HPLC ved anvendelse av en gradient av 0-40% løsningsmiddel B (0,1% TFA i acetonitril) i løsningsmiddel A (0,1% TFA vandig løsning) i 20 min, og 40-90% løsningsmiddel B i løsningsmiddel A i 10 min .
- Oppløs CLT1-dl-(DOTA) 4 (250 mg, 0,077 mmol) i DI vann (15 ml), og justere pH til 6 ved anvendelse av 1 M NaOH. Legg Gd (OAc) 3 0,4 H2O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 ekvivalenter til DOTA monoamide) i porsjoner til løsningen, under opprettholdelse av pH ved 6 ved anvendelse av 1 M NaOH. Omrør reaksjonsblandingen i oppløsning ved RT i 48 timer.
- Kompleks rest Gd (III) med ethylenediaminetetraacetic eddiksyre (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol) og rens det urene produkt med en størrelse utelukkelseskolonne for å gi det endelige produktet CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).
2. Karakterisering av kontrastmidler
- Mål Gd (III) innhold med induktivt koplet plasma-optisk emisjonsspektroskopi.
- Innhente matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) massespektra i lineær-modus med 2,5-dihydroksybenzosyre (2,5-DHB) som en matriks.
- Mål avspenningstider av den vandige oppløsning av de kontrastmidler av CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 og en nontargeted kontrollmiddel sCLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 med forskjellige konsentrasjoner ved 60 MHz (1,5 T) med en relaxometer ved 37 ° C. Bruk en inversjon-hvilepulssekvens for å måle T 1 og en Carr-Purcell-Meiboom-Gill sekvens med 500 ekko å måle T 2. Beregn T 1 og T 2 relaxivities av the agenter fra bakken av tomter på 1 / T 1 og 1 / T 2 versus GD konsentrasjoner.
Tre. Cell Culture and Development of Animal Modell med orthotopic PC3 Prostata Tumor
- Kultur PC3 prostatakreftceller med konstitutiv ekspresjon av grønn fluorescens protein (GFP) i RPMI-medium supplert med 5% føtalt bovint serum og penicillin / streptomycin / Fungizone, høsting ved trypsinering og resuspender med densitet på 2,5 x 10 4 celler / mL PBS.
- Oppretthold mannlige athymic nakne mus (4-5 uker gamle) på atymiske Animal Kjerne Facility, Case Western Reserve University (CWRU) i henhold til et dyr protokoll godkjent av CWRU Institutional Animal Care og bruk komité.
- Den kirurgiske overflater ble sprøytet med 2% klorheksidin-løsning, og deretter dekket med absorberende gardiner. Sterile kirurgiske hansker ble slitt under inngrepet. Før dyr kirurgi, ip injisere Avertin (250 mg / kg) til anesthetize musene. Alternativt kan ketamin / xylazin / acepromazin brukes i en konsentrasjon på 50/5/1 mg / kg. Oftalmisk salve ble anvendt på mus for å opprettholde tilstrekkelig fuktighet i løpet av anestesien.
- Starter operasjonen ved å skjære et lite innsnitt gjennom huden og peritoneum langs den nedre midtlinje til en lengde på omtrent 1 cm ved hjelp av en steril skalpell. En steril kirurgisk drapere var dekket rundt snittet området under overlevelses operasjoner.
- Forsiktig exteriorize og stabil prostata rygg fliker å eksponere prostata. Injiser suspensjon av PC3-GFP-celler i PBS (20 pl) inn i prostata med en 30 gauge nål. Til slutt lukker snittet med såret autoclip 12.
- For etter prosedyren overvåking, overvåke dyr to ganger per dag for en uke. Tegn på sykdommen inkluderer mangel på spising, mørk urin innsamling rundt urinrøret, og ustø gange som kunne tyde på infeksjon eller okklusjon av blæren i kramper.
- Etter 10 dager, fjerne than stifter med stiftefjerner. Overvåk dyrene daglig for å vurdere størrelsen på svulsten og noen bevis for smerte slik som vekttap, adferdsavvik, og motorfeil. Avlive dyrene som viste en svulst størrelse som overstiger den etisk tillatt grense eller bevis for smerte under tumorvekst.
4. Bekreftelse på Tumor Binding spesifisitet av Peptider med fluorescens Imaging og histologi
- Etter svulst celle inokulasjon, tillate ca 4 uker med tumorvekst før du begynner med bildebehandling. Før injeksjon av peptid-prober, skaffe GFP fluorescens bilder med levende mus på en fluorescens-imager å verifisere tilstedeværelse av tumor.
- Iv injisere Texas Red merkede peptider til tumorbærende mus ved en dose på 10 nmol / mus.
- Ofre musene 2 hr senere ved halshugging, samle svulsten og viktige organer, og umiddelbart bilde på en fluorescens imager. Bruk grønne lyset filtreres for GFP (eksitasjon: 444-490 nm, emisjon: 515 nm lange-pass filter, kjøp innstillinger: 500-720 i 10 nm trinn) og rødt lys filtre for Texas Red (eksitasjon: 576-621 nm, emisjon: 635 nm lang-pass filter; oppkjøp innstillinger: 630-800 i 10 nm trinn). 10 msek eksponeringstid for GFP og 150 msek for Texas Red.
- Umiddelbart etter måling av hele vev fluorescens, samle tumorvev, fikse med formalin, og cryosection inn 5-mikrometer skiver.
- Etter skylling med PBS, monter med en dråpe av monteringsmedium inneholdende 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), bilde umiddelbart på en konfokal laser scanning mikroskop.
5. Magnetic Resonance Imaging (MRI)
- Ca 4 uker etter svulst celle inokulasjon, la svulstene å vokse opp til 0,3-0,6 cm i diameter. Bruk en 7 T MR-skanner med et volum radiofrekvens (RF) spole for MRI studien.
- Anesthetize musen med en 2% isofluran-oksygen-blanding i et isofluran induksjonskammeret. Ophthalmic salve ble anvendt på mus for å opprettholde tilstrekkelig fuktighet i løpet av anestesien.
- Sett en 30 gauge nål inn i en 1,0 m lang slange fylt med heparinisert saltvann. Plasser self-made kateter i musehalevenen.
- Plasser musen i magneten og holde under inhalasjonsanastesi med 1,5% isofluran-oksygen via en nesekonus.
- Plasser en åndedrettsføler koplet til et overvåkingssystem på magen for å overvåke hastigheten og dybden av respirasjon. Oppretthold kroppstemperaturen på 37 ° C ved å blåse varm luft inn i magnet gjennom en feedback-kontroll-system.
- Begynn med sagittal seksjon bilder ved hjelp av en lokalisering sekvens for å identifisere svulsten plassering (TR / TE = 200/3.7 msek, FOV = 3,0 cm, slice tykkelse = 2,2 mm, skive nummer = 16, gjennomsnittlig = 2, flip vinkel = 45 °, matrise = 128 x 128).
- Bruk en 2D T1-vektet gradient fett undertrykkelse sekvens for å skaffe 2D aksialbilder for CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msek, FOV = 3,0 cm x 3,0 cm, slus tykkelse = 1,2 mm, skive nummer = 12, gjennomsnittlig = 1, flip vinkel = 80 °, matrix = 128 x 128).
- Etter pre-injeksjon baseline MR-bildeopptak, begynner å injisere den målrettede middel eller kontrollmiddel i en dose på 0,03 mmol Gd / kg ved å spyle med 200 ul saltvann.
- Fortsett å skaffe CE-MRI-bilder ved ulike tidspunkt for opp til 30 min.
6. Bildebehandling og analyse
- Bruk bildebehandlingsprogrammer for bildeanalyse.
- Tegn regionene av interesse (ROIs) over hele tumorer og nyrene i de to-dimensjonale bildeplanet og måle gjennomsnittlig signalintensitet.
- Å kvantifisere CE-MRI data, måle svulst eller nyrekontrastforbedring (ΔSNR) ved beregning av økningen i post-kontrast SNR enn pre-kontrast SNR ved hjelp av følgende ligning: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), der S 0 og S t betegner signalet i tumor eller nyrene før og etter kontrast og σ 0 og σ t er standardavviket for støyen målt fra bakgrunnen luften før og etter kontrast.
- Beregn p-verdiene ved hjelp av studentens tosidige t-test, forutsatt statistisk signifikans ved p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser syntesen av den målrettede kontrastmiddel CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 og den generelle ordningen av forsøket. CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 viser mye høyere relaksivitet enn klinisk Gd-DOTA (Tabell 1). På 1,5 T, T 1 relaksivitet per gadolinium av CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 i PBS (pH 7,4) er ca tre ganger høyere enn for Gd-DOTA 10. Maestro avbildning bekrefter sterk spesifikk binding av Texas Red merket CLT1 (CLT1-TR) til tumor med liten binding til normale organer og vev, samtidig som den ikke-spesifikke egge peptid (sCLT1-TR), viser meget liten tumor binding (figur 2). Figur 3 viser typisk pre-og post-injeksjon kontrast forbedret (CE) T 1-vektede bilder. Den målrettede agenten resulterer i større og lengre forbedring i svulstvev sammenlignet med ikke-målrettede egge agenter. Kontrastforbedring i urinblæren øker gradvis i løpettid, noe som indikerer at de kontrastmidler ble utskilt via renal filtrering. Kvantitativ signal analyse viser at den målrettede middel produseres mer betydelig forbedring av signal i svulstvev enn kontrollmiddel (p <0,05) opp til 30 min. Denne studie viser biodistribusjonen agenten har minimal Gd retensjon i hoved organer og vev 2 dager etter injeksjon. Våre foreløpige data viser at CLT1 målrettet agenter MR kontrast kan være spesielt levert til svulsten ved relativt lav dose (en tredjedel av klinisk dose).
| r 2 (mM -1. s -1) | r 1 (mM -1. s -1) | Gd innhold (mmol-Gd / g) | |||
| per Gd | per molekyl | per Gd | peh molekyl | ||
| CLT1-(Gd-DOTA) 4 | 10.1 ± 1.0 | 40,4 ± 3,0 | 13,0 ± 3,1 | 52,0 ± 9,6 | 1.05 ± 0.10 |
| sCLT1-(Gd-DOTA) 4 | 11,5 ± 1,4 | 46,0 ± 5,0 | 12,4 ± 0,3 | 49,6 ± 1,3 | 0.97 ± 0.08 |
| Gd-DOTA 4 | 2,9 * | 2,9 * | 3,2 * | 3,2 * | |
Tabell 1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av den målrettede og egge MR kontrastmidler ved 1,5 T, 37 ° C (* Relaxivities for Gd-DOTA i vann ved 37 ° C er fra referanse 10).
> Figur 1. Grafisk fremstilling av syntesen prosedyre og generell eksperiment. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Tumor binding av CLT1-TR. Målrettet CLT1-TR (A) og ikke-målrettet sCLT1-TR (B) ble injisert intravenøst i atymiske nakne mus som bærer orthotopic PC3-GFP prostatakreft i en dose på 10 nmol / mus. Etter 2 timer, tumorer og forskjellige organer ble samlet og avbildes. Grønne fluorescens bilder er fra PC3-GFP tumorceller. Rød fluorescens bilder er fra CLT1-TR (A) og sCLT1-TR (B) sonder. En. tumor; to. milt; 3. hjerte; 4. nyre; fem. testikkel; seks. leveren; 7. lunge; åtte. muskel; ni. hjernen.565fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 3. Representative T1-vektede aksiale 2D gradient bilder av orthotopic PC-3 human prostatatumor før og etter intravenøs injeksjon av CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (A) og sCLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (B) hos 0,03 mmol Gd / kg i nu / nu mus. Tumor merket med rød sirkel og blære merket med grønn sirkel. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske Steps
Valg av riktig Biomarkør og målretting Small Peptide
For å lykkes med å utvikle en målrettet kontrastmiddel med liten størrelse, to viktige punkter som må vurderes. For det første er det viktig å velge riktig molekyl biomarkører som er rikelig tilstede i syke vev med liten tilstedeværelse i normale vev. Våre utvalgte kreftrelaterte biomarkør, klumpete plasmaproteiner, oppfyller dette kravet. For det andre bør de valgte målrettede små molekylære stoffer har høy bindingsaffinitet for biomarkører slik at midler tilstrekkelig kontrast kan binde seg til disse målene, som resulterer i tilstrekkelig kontrastforbedring. I denne studien, valgte vi blodpropp bindende peptid CLT1 som viser sterk spesifikk binding til de klumpete plasmaproteiner i svulsten 11.
Kontrastmiddel Synthesis
Peptid syntese innebærer oxidizing to tiolgrupper i det lineære peptid-molekyl for å danne endelige CLT1 cyklisk peptid. Mens peptid Cykliseringen blir vanligvis utført i løsning ved lav konsentrasjon for å minimalisere potensiell aggregering, dimerisering og oligomerisering, tar on-harpiks cyklisering fordel av pseudo-fortynning fenomen, så vel som fjerning av reagenser ved enkel vasking og filtrering 13. I vår syntese prosedyre, finner vi at på-resin syklisering hjelp thallium (III) trifluoroacetate fungerer godt med høy avkastning og lite dimerisasjon, selv om thallium (III) trifluoracetatet er svært giftig og forsiktighet må utvises ved håndtering av det. En annen tilnærming bruker 20% DMSO i løsning ved lav peptid konsentrasjon. Imidlertid flere trinn for å fjerne DMSO, og lyofilisering av det store volumet løsningen tar lengre tid. Ved å bruke disse metodene, er det viktig å sørge for en komplett dannelsen av intra disulfidbinding. Når kompleks peptid-ligand med Gd, kan de frie tioler induserebetydelige ansamlinger fordi spormetaller i bufferen katalysere luftoksydasjon, noe som resulterer i overoxidation av cystein for å danne polymeriser 14.. Dette reduserer vanligvis dramatisk utbyttet og renheten av sluttproduktet. For å sørge for komplett disulfide bandet formasjon, først må vi bruke milde oksidering forhold for å unngå dannelse av inter disulfidbinding resulterer i dimer eller høyere oligomer formasjon. For det andre bør lenge nok reaksjonstid opprettholdes for å sikre at alle tiolgrupper er oksydert før Gd konjugering trinn.
Animal Modell og cannulation av Mouse Tail Vein
Fremstilling av dyretumormodell og halevenen kanylering er også meget viktige sider ved denne fremgangsmåten. Under operasjonen, må det verktøy / benk holdes rene og sterile for å unngå potensiell smitte som kan skade eller drepe mus. For å unngå å bevege musen før og etter injeksjon, er det nødvendig å cannulate musehalevenen. For å fremstille kateteret etter kanylering, bryte en 30 gauge nål fra navet og sette den butte enden inn i en 1,0 m lang slange, og kople en annen ende av slangen til en sprøyte fylt med 1% heparinisert saltløsning. Press sprøyten for å fylle opp slangen. Dilate halen med varmt vann (~ 105 ° F). Stikk nålen inn i venen. Blodtilbakestrømning inn i produksjonsrøret indikerer vellykket innsetting av kateteret. For å kontrollere at nålen er i venen, skyv sprøyten og saltvann kan være greit injiseres, venen er klarert med injeksjon av en liten mengde saltvann. Fest kateteret på plass med tape før du flytter musen til skanneren.
Begrensninger og mulige endringer
Det er flere begrensninger i vår nåværende studien. Først fra de foreløpige resultatene ser vi at CLT1 vasker ut veldig raskt fra målretting området selv om det shows utmerket binding til svulsten. In vivo proteolytisk nedbrytning sannsynlig fører til ustabilitet i CLT1. Modifisering av CLT1 å beskytte mot proteolytisk nedbrytning bør forbedre sin stabilitet og forlenge sin utvaskings tid in vivo. Bruk av D-typen aminosyrer for å erstatte naturlige L-type aminosyrer er en potensiell strategi for å oppnå dette målet. For det andre gjør den aktuelle studien avklare ikke hvilke eksakte komponenter i clotted plasmaproteiner den CLT1 peptid binder seg til. Til slutt, syntetisere vi agenter kontrast hovedsakelig ved hjelp av fast fase syntese med relativt lav avkastning og høy pris. Utvikling av en væskefase syntese metoden skal øke utbyttet og redusere kostnadene.
Søknader
Vi er å utvikle teknikker for nøyaktig påvisning av små ondartede svulster med kontrastforsterket MR. MRI med målrettet middel gir en mer effektiv og tryggere alternativ for cancer molekyl avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis av American Heart Association GRA Spring 09 postdoktorstilling (09POST2250268) og NIH R01 CA097465. Vi setter stor pris på Dr. Wen Li og Dr. Vikas Gulani for MRI-protokoll test og oppsett, og Ms Yvonne Parker for hennes assistanse på tumorimplantasjonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fmoc protected amino acids | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimidyl ester, single isomer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC system | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Imaging System | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI scanner | Bruker | ||
References
- Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
- Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
- Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
- Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
- Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
- Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
- Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
- Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
- Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
- Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
- Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
- Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
- McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
- Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).
