Summary
Para demonstrar imagem molecular do câncer MR com um pequeno peptídeo alvo MRI agente de contraste específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral em um modelo de câncer de próstata do rato.
Abstract
Matriz extracelular do tumor tem abundância de proteínas relacionadas com o cancro que podem ser utilizados como biomarcadores para imagiologia molecular do cancro. Neste trabalho, nós demonstramos imagem molecular do câncer MR eficaz com um pequeno peptídeo molecular complexa monoamida Gd-DOTA apontado como um agente de contraste MRI alvo específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral. Realizamos a experiência de avaliar a eficácia do agente para detecção não invasiva de tumor de próstata com ressonância magnética em um modelo ortotópico de câncer de próstata do rato PC-3. O agente de contraste de alvo era eficaz para produzir aumento significativo de contraste do tumor com uma dose baixa de 0,03 mmol de Gd / kg. O peptídeo alvo agente de contraste MRI é promissor para ressonância magnética molecular do tumor da próstata.
Introduction
Imagem eficaz de alvos moleculares relacionadas ao câncer é de grande importância para melhorar a precisão de antes detecção e diagnóstico do câncer. A ressonância magnética (RM) é uma modalidade de imagem clínica poderoso com alta resolução espacial e sem radiação de ionização 1. No entanto, nenhum agente de contraste alvo está disponível para imagem molecular do câncer MR clínica. Design inovador e desenvolvimento de agentes de contraste alvo de ressonância magnética avançaria muito a aplicação de imagem molecular do câncer MR. Foram feitos esforços significativos para desenvolver agentes de contraste para ressonância magnética direcionados dos biomarcadores expressas na superfície das células cancerosas. Devido à sensibilidade relativamente baixa ressonância magnética e baixa concentração desses biomarcadores, é um desafio para gerar aumento de contraste suficiente para imagiologia molecular MR eficaz usando pequenos agentes de contraste alvo molecular 2,3. A fim de obter reforço suficiente, vários sistemas de entrega de such como lipossomas, nanopartículas e polímeros conjugados com uma elevada carga de paramagnéticos Gd quelatos (III) foram preparados para aumentar a concentração local de agentes de contraste para os sites de destino 4,5. Embora estes sistemas de entrega eram capazes de gerar melhoria significativa do tumor em modelos animais, os tamanhos grandes resultaram na eliminação lenta e incompleta do corpo, resultando na acumulação prolongada de Gd iões tóxicos (III), que podem causar problemas graves de segurança 6. Recentemente, alguns estudos demonstraram que as limitações de ressonância magnética para imagiologia molecular pode ser superado pela selecção biomarcadores adequados com elevada expressão local das lesões e usando pequenos agentes moleculares que podem ser facilmente excretados 7,8. A principal característica desses agentes é que eles têm como alvo marcadores moleculares abundantemente presentes nos tecidos doentes com pouca presença nos tecidos normais. Uma alta concentração de agentes de contraste pode ligar-se a estes alvos, resultando em sufirealce de contraste ciente para imagiologia molecular MR eficaz. Uma vez que o seu tamanho é mais pequeno do que o limiar de filtração renal, os agentes de contraste não ligados podem ser facilmente eliminados do corpo com a redução do ruído de fundo. Nós selecionamos um biomarcador relacionada ao câncer universal, proteínas do plasma coagulado, que existem em abundância estroma tumoral, e raramente estão presentes em tecidos normais 9. Sintetizamos um agente de contraste de alvo contendo um pequeno péptido de alvejamento CGLIIQKNEC (CLT1), que mostrou uma forte ligação específica para o modelo de tumor de próstata PC3 10, e quatro monoamida quelatos Gd-DOTA. Aqui, nós fornecemos uma metodologia de imagem molecular para detectar câncer MR tumores em camundongos.
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Protocol
Protocolo adaptado de um estudo prévio 11.
1. Conjugação de Gd-DOTA para CLT1 Peptide
- Usando a síntese de péptidos em fase sólida padrão, sintetizar CLT1 péptido (CGLIIQKNEC) a partir de aminoácidos protegidos com Fmoc numa resina de cloreto de 2-clorotritilo (1,0 mmol).
- Após a adição de aminoácido final, ciclizar o péptido linear em-resina com tálio (III), trifluoroacetato (1,09 g, 2,0 mmol, 2 equivalentes) em DMF (20 ml) a 0 ° C durante 2 horas.
- Em seguida, o conjugado de PEG e lisina sequencialmente para o N-terminal do péptido CLT1 (1,0 mmol) de resina por meio de reacção sequencial com Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3,0 mmol), e uma segunda porção de Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
- Retirar Fmoc com piperidina. Adicionar DOTA-tris (t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 equivalentes para cada grupo amino) para reagir com as aminas livres de quatro dendrímero lisina sobre a resina durante 2 horas.
- Finalmente, clivar e desproteger o produtoa partir da resina por tratamento com um cocktail de ácido trifluoroacético, água e triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) durante 8 horas à temperatura ambiente. Remover a resina por filtração, seguida de lavagem com ácido trifluoroacético (TFA). Adicionar os filtrados combinados gota a gota a éter etílico frio (200 ml), centrífuga, e lava-se com éter etílico 4x. Seca-se sob vácuo para dar um sólido incolor (1,99 g, 61% de rendimento).
- Purifica-se o produto em bruto por HPLC preparativa utilizando um gradiente de 0-40% de solvente B (0,1% TFA em acetonitrilo) no solvente A (0,1% de solução aquosa de TFA) durante 20 minutos e 40-90% de solvente B em solvente A durante 10 min .
- Dissolver CLT1-dl-(DOTA) 4 (250 mg, 0,077 mmol) em água Dl (15 ml) e ajustar o pH a 6 usando NaOH 1M. Adicionar Gd (OAc) 3 0,4 H 2 O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 equivalentes a monoamida DOTA), em porções, à solução, enquanto se mantinha o pH a 6 usando NaOH 1M. Agita-se a solução de reacção à temperatura ambiente durante 48 horas.
- Complexo do Gd residual (III) com ethylenediaminetetraacetic ácido acético (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), e purifica-se o produto bruto com uma coluna de exclusão de tamanho para obter o produto final CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).
2. Caracterização de agentes de contraste
- Medir o teor de Gd (III), com a espectroscopia de emissão de plasma indutivamente acoplado-óptico.
- Adquirir laser de dessorção / ionização de tempo-de-voo (MALDI-TOF) os espectros de massa assistida por matriz no modo linear com o ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (2,5-DHB) como uma matriz.
- Medida do tempo de relaxação da solução aquosa dos agentes de contraste de CLT1-dl-(Gd-DOTA) e 4 um agente de controlo de nontargeted sCLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 com diferentes concentrações, a 60 MHz (1,5 T) com um relaxometer a 37 ° C. Use uma seqüência de pulso inversão-recuperação para medir T 1 e uma seqüência de Carr-Purcell-Meiboom-Gill com 500 ecos para medir T 2. Calcule T 1 e T 2 relaxividades of thagentes e das encostas das parcelas de 1 / T 1 e 1 / T 2 versus as concentrações de D'us.
3. Cultura Celular e Desenvolvimento de Modelo Animal com Ortotópico PC3 próstata Tumor
- Cultura PC3 células de cancro da próstata com a expressão constitutiva da proteína de fluorescência verde (GFP) em meio RPMI suplementado com 5% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina / fungizona, colheita por tripsinização e ressuspender a densidade de 2,5 x 10 4 células / ul de PBS.
- Manter NIH ratos pelados atímicos machos (4-5 semanas de idade) no Centro de atímicos animal Core, Case Western Reserve University (CWRU) de acordo com um protocolo de animais aprovado pelo Comitê Animal Care e Use Institucional CWRU.
- As superfícies cirúrgicos foram pulverizadas com uma solução de clorexidina a 2% e, em seguida, coberto com cortinas absorventes. Luvas cirúrgicas estéreis foram usados durante o procedimento. Antes da cirurgia animal, ip injetar Avertin (250 mg / kg) para anesthetizenviar um e ratos. Alternativamente, a cetamina / xilazina / acepromazina pode ser utilizado numa concentração de 50/5/1 mg / kg. Pomada oftálmica foi aplicada ao rato para manter a humidade adequada durante a anestesia.
- Comece a cirurgia por corte de uma pequena incisão através da pele e do peritoneu ao longo da linha média inferior a um comprimento de cerca de 1 cm, usando um bisturi estéril. A cortina cirúrgica estéril foi coberto ao redor do local da incisão durante a cirurgia de sobrevivência.
- Suavemente exteriorizar e estabilizar os lóbulos da próstata dorsal para expor a próstata. Injectar a suspensão de células PC3-GFP em PBS (20 mL) na próstata com uma agulha de calibre 30. Finalmente fechar a incisão com ferida Autoclip 12.
- Para o monitoramento pós-procedimento, monitorar os animais duas vezes por dia durante uma semana. Sinais de doença incluem a falta de alimentação, urina escura coleta em torno da uretra, e marcha instável que pode indicar infecção ou obstrução da bexiga nos grampos.
- Após 10 dias, remover o tele grampos usando um removedor de grampos. Monitorizar os animais diariamente para avaliar o tamanho do tumor e qualquer evidência de dor, tais como a perda de peso, os desvios de comportamento, e defeitos de motor. Eutanásia dos animais que apresentaram um tamanho tumoral superior ao limite permitido eticamente ou evidência de dor durante o crescimento do tumor.
4. Confirmação de Tumor Encadernação Especificidade dos Peptídeos com imagens de fluorescência e Histologia
- Após a inoculação de células tumorais, permitir que cerca de 4 semanas de crescimento do tumor, antes de iniciar a geração de imagens. Antes da injeção das sondas de peptídeos, adquirir imagens de fluorescência de GFP com camundongos vivos em um gerador de imagens de fluorescência para verificar a presença de tumor.
- Iv injectar Texas Red péptidos marcados para a ratinhos portadores do tumor a uma dose de 10 nmol / rato.
- Sacrificar os ratos 2 horas mais tarde por deslocamento cervical, recolher o tumor e órgãos principais, e imediatamente imagem em um gerador de imagens de fluorescência. Use filtros de luz verde para GFP (excitação: 444-490 nm; emissão: 515 nm filtro passa muito tempo; configurações de aquisição: 500-720 em 10 passos nm) e filtros de luz vermelha para o Texas Red (excitação: 576-621 nm; emissão: 635 nm filtro passa muito tempo; aquisição configurações: 630-800 em 10 passos Nm). Tempo de exposição de 10 ms para GFP e 150 ms para vermelho do Texas.
- Imediatamente após a medição da fluorescência do tecido todo, coletar tecidos tumorais, fixar com formalina e criocorte em fatias 5 mícrons.
- Após lavagem com PBS, monte com uma gota de meio de montagem contendo 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), imagem imediatamente em um microscópio de varredura a laser confocal.
5. Imagem por Ressonância Magnética (MRI)
- Cerca de 4 semanas após a inoculação de células tumorais, permitem que os tumores cresçam até 0,3-0,6 cm de diâmetro. Use um scanner de ressonância magnética 7 T com um rádio de freqüência de volume (RF) bobina para estudo de ressonância magnética.
- Anestesiar o rato com uma mistura de isoflurano em oxigênio 2% em uma câmara de indução isoflurano. Ophpomada thalmic foi aplicada ao rato para manter a humidade adequada durante a anestesia.
- Inserir uma agulha de calibre 30 em um tubo de 1,0 m de comprimento cheia com solução salina heparinizada. Colocar o cateter de auto-feito na veia da cauda do rato.
- Posicione o mouse para o ímã e manter sob anestesia inalatória com isoflurano a 1,5% em oxigênio através de um cone do nariz.
- Coloque um sensor respiratório conectado a um sistema de monitoramento no abdômen para monitorar a freqüência ea profundidade da respiração. Manter a temperatura do corpo a 37 ° C por um sopro de ar quente para o íman através de um sistema de controlo de realimentação.
- Comece com imagens de cortes sagital usando uma seqüência de localizações para identificar a localização do tumor (TR / TE = 200/3.7 ms, FOV = 3,0 cm, espessura de corte = 2,2 mm, número fatia = 16, média = 2, o ângulo de inclinação = 45 °, matriz = 128 x 128).
- Use um gradiente seqüência supressão de gordura 2D T1-weighted para adquirir imagens axiais em 2D para CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 ms, FOV = 3,0 centímetros x 3,0 cm, spiolhos espessura = 1,2 mm número fatia = 12, média = 1, o ângulo de inclinação = 80 °, matriz = 128 x 128).
- Depois de pré-injecção de aquisição de imagens MR de linha de base, começam a injectar o agente alvo ou agente de controlo a uma dose de 0,03 mmol de Gd / kg, através de lavagem com 200 mL de solução salina.
- Continuar a aquisição de imagens de ressonância magnética-CE em diferentes pontos de tempo de até 30 min.
6. Processamento de Imagem e Análise
- Use o software de imagens para análise de imagens.
- Desenhe as regiões de interesse (ROI) em todo o tumor e os rins no plano de imagem bidimensional e medir a intensidade média do sinal.
- Para quantificar os dados CE-MRI, medir tumor ou realce de contraste de rim (ΔSNR) por cálculo do aumento da pós-contraste SNR sobre pré-contraste SNR usando a seguinte equação: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), em que R 0 e S t denotar o sinal no tumou ou os rins, antes e depois de contraste, e σ 0 e σ t são o desvio padrão do ruído de medida a partir do fundo do ar antes e depois de contraste.
- Calcule os valores de p usando bicaudal do teste t de Student, assumindo significância estatística de p <0,05.
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Representative Results
A Figura 1 descreve a síntese do agente de contraste alvo CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 e o esquema geral do experimento. CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 mostra muito maior relaxividade do que clínico Gd-DOTA (Tabela 1). A 1,5 T, T 1 relaxividade por gadolínio de CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 em PBS (pH 7,4) é de aproximadamente 3 vezes mais elevada do que a de Gd-DOTA 10. Imagiologia Maestro confirma a forte ligação específica de vermelho do Texas marcado CLT1 (CLT1-TR) de tumor com pouca ligação a órgãos e tecidos normais, enquanto que a não-específica mexidos péptido (sCLT1-TR) apresenta muito pouca ligação tumoral (Figura 2). A Figura 3 mostra pré típico e contraste pós-injeção avançado (CE) T de imagens de 1 ponderados. O agente alvo resulta em maior e mais reforço em tecido de tumor em comparação com os agentes mexidos não-alvo. Realce de contraste na bexiga aumenta gradualmente ao longotempo, o que indica que os agentes de contraste foram excretados por via da filtração renal. A análise quantitativa de sinais revela que o agente de alvo produzido aumento do sinal mais significativo no tecido do tumor do que o agente de controlo (p <0,05) até 30 minutos. O estudo de biodistribuição mostra o agente tem de retenção mínima Gd nos principais órgãos e tecidos 2 dias após a injecção. Nossos dados preliminares mostram que CLT1 alvo agentes de contraste para IRM podem ser especificamente entregue ao tumor na relativamente baixa dose (um terço da dose clínica).
| r2 (mM -1. s -1) | r 1 (mM -1. s -1) | Conteúdo Gd (mmol de Gd / g) | |||
| por Gd | por molécula | por Gd | pmolécula er | ||
| CLT1-(Gd-DOTA) 4 | 10,1 ± 1,0 | 40,4 ± 3,0 | 13,0 ± 3,1 | 52,0 ± 9,6 | 1,05 ± 0,10 |
| sCLT1-(Gd-DOTA) 4 | 11,5 ± 1,4 | 46,0 ± 5,0 | 12,4 ± 0,3 | 49,6 ± 1,3 | 0,97 ± 0,08 |
| Gd-DOTA 4 | 2.9 * | 2.9 * | 3.2 * | 3.2 * | |
Tabela 1. Propriedades físico-químicas dos agentes de contraste para IRM específicas e mexidos no 1.5 T, 37 ° C (* relaxividades para Gd-DOTA em água a 37 ° C são de referência 10).
> Figura 1. Representação gráfica do processo de síntese e experiência geral. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Ligação de CLT1-TR tumor. Targeted CLT1-TR (A) e de não-alvo sCLT1-TR (B) foram injectados por via intravenosa, para ratinhos atímicos nus portadores ortotópico de próstata PC3-GFP a uma dose de 10 nmol / rato. Após 2 horas, os tumores e vários órgãos foram recolhidos e trabalhada. Imagens de fluorescência verde são a partir de células tumorais PC3-GFP. Imagens de fluorescência vermelha são de CLT1-TR (A) e sCLT1-TR (B) sondas. 1. tumoral, 2. baço, 3. coração, 4. rim; 5. testículo, 6. fígado; 7. pulmão; 8. muscular; 9. cérebro."Target =" _blank 565fig2highres.jpg "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 3. Axiais imagens gradiente Representante T1 2D de ortotópico PC-3 tumor da próstata humana, antes e após a injeção intravenosa de CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (A) e sCLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (B) em 0,03 mmol / kg de Gd em nu / nu. tumorais marcadas com círculo vermelho e bexiga marcado com círculo verde. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Etapas críticas
Seleção de Biomarcador adequada e Segmentação pequeno peptídeo
Para desenvolver com sucesso um agente de contraste com o tamanho pequeno alvo, dois pontos principais devem ser consideradas. Em primeiro lugar, é importante seleccionar os biomarcadores moleculares adequados, que são abundantemente presentes em tecidos doentes com pouca ou nenhuma presença nos tecidos normais. Nossa biomarcador relacionada ao câncer selecionados, proteínas do plasma coagulado, atende a esse requisito. Em segundo lugar, os pequenos agentes moleculares orientadas seleccionados devem ter alta afinidade de ligação para os biomarcadores para que os agentes de contraste suficientes se pode ligar a estes alvos, resultando em aumento de contraste suficiente. Neste estudo, optou-se pela CLT1 peptídeo de ligação coágulo que mostra forte ligação específica às proteínas do plasma coagulado do tumor 11.
Agente de Contraste Síntese
A síntese de péptidos envolve boiidizing dois grupos tiol na molécula de péptido linear para formar péptido final CLT1 cíclico. Enquanto que o péptido de ciclização é normalmente realizada em solução a baixa concentração de minimizar o potencial de agregação, a dimerização e a oligomerização, ciclização em-resina leva vantagem de o fenómeno de pseudo-diluição, bem como a remoção de reagentes por lavagem simples e de filtração 13. Em nosso procedimento de síntese, vemos que ciclização on-resina usando tálio (III) trifluoracetato funciona bem com alto rendimento e pouco dimerização, apesar de tálio (III) trifluoracetato é muito tóxico e os cuidados devem ser tomados ao manuseá-lo. Uma segunda abordagem utiliza 20% de DMSO em solução a baixa concentração de péptido. No entanto mais passos são necessários para remover DMSO, e liofilização o grande volume de solução é mais demorada. Ao usar qualquer método, é fundamental certificar-se da formação completa da ponte dissulfeto intramolecular. Quando a complexação do ligando peptídico com Gd, os tióis livres podem induziragregações substanciais, porque vestígios de metais no tampão de catalisar a oxidação ao ar, resultando na superoxidação de cisteína para formar a polimerização 14. Isto diminui geralmente significativamente o rendimento e pureza do produto final. Para tornar a formação da banda dissulfeto completa certeza, em primeiro lugar, precisamos usar condições oxidization leves para evitar a formação de ponte dissulfeto intermolecular resultando em dímeros ou oligômero formação superior. Em segundo lugar, o tempo de reacção suficientemente longo deve ser mantida para assegurar que todos os grupos tiol são oxidados antes do passo de conjugação Gd.
Modelo Animal e canulação do Rato Cauda Veia
Preparação da canulação da veia modelo de tumor animal e cauda também são aspectos muito importantes deste procedimento. Durante a cirurgia, a ferramentas / banco devem ser mantidos limpos e esterilizados para evitar a infecção potencial que poderia ferir ou matar os ratos. A fim de evitar o movimento do mouse, antes e depois de injeçãoção, é necessário para canulação do mouse cauda veia. Para preparar a sonda para a canulação, quebrar uma agulha de calibre 30 a partir do cubo e inserir a extremidade romba em um 1,0 m de comprimento, tubagem, e ligar a outra extremidade do tubo a uma seringa carregada com 1% de soro fisiológico heparinizado. Empurre a seringa para encher a tubulação. Dilatar a cauda com água quente (~ 105 ° F). Insira a agulha na veia. O refluxo de sangue para dentro do tubo indica uma inserção bem sucedida do cateter. Para verificar se a agulha está na veia, empurrar suavemente a seringa e a solução salina pode ser injectada sem problemas, a veia é compensada com a injecção de uma pequena quantidade de solução salina. Fixe o cateter no local com fita adesiva antes de mover o mouse para o scanner.
Limitações e Possíveis Modificações
Há várias limitações em nosso estudo atual. Em primeiro lugar, a partir dos resultados preliminares, notamos que CLT1 lava para fora muito rapidamente a partir do site segmentação embora shows excelente de ligação ao tumor. Em degradação proteolítica in vivo provavelmente provoca a instabilidade do CLT1. Modificação da CLT1 para proteger contra a degradação proteolítica deve melhorar sua estabilidade e prolongar o seu tempo de wash-out in vivo. Usando os aminoácidos do tipo D para substituir os aminoácidos do tipo L naturais é uma estratégia potencial para atingir este objectivo. Em segundo lugar, o presente estudo não esclarece quais componentes exatos nas proteínas do plasma coagulado o peptídeo se liga a CLT1. Finalmente, sintetizamos os agentes de contraste, principalmente, usando a síntese em fase sólida, com rendimento relativamente baixo e alto custo. O desenvolvimento de um método de síntese de fase líquida deve aumentar o rendimento e reduzir o custo.
Aplicações
Estamos a desenvolver técnicas para a detecção precisa de pequenos tumores malignos com contraste aprimorado de ressonância magnética. MRI com o agente alvo fornece uma alternativa mais eficaz e mais seguro para imagem molecular do câncer.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado em parte pela American Heart Association GRA Spring 09 Postdoctoral Clube (09POST2250268) eo NIH R01 CA097465. Nós apreciamos muito Dr. Wen Li e Dr. Vikas Gulani para teste protocolo MRI e configuração, ea Sra. Yvonne Parker por sua assistência na implantação do tumor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fmoc protected amino acids | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimidyl ester, single isomer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC system | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Imaging System | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI scanner | Bruker | ||
References
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