Summary
وقد تم توثيق النشاط السامة للخلايا من phenanthridine PJ-34 في خلايا السرطان الذين يخضعون الانقسام في الوقت الحقيقي من خلال التصوير متحد البؤر الحية. PJ-34 استئصال سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا إيواء خارج centrosomes في الانقسام. على عكس الانقسام ثنائي الوصل العادي، لم تكن متفاوتة المسافات خارج centrosomes في قطبي المغزل في حضور PJ-34.
Abstract
المشتقات فينانثرين بوصفها قوية PARP1 مثبطات تحول دون تجميع ثنائي الوصل من centrosomes الزائدين في خلايا متعددة centrosomal السرطانية البشرية في الانقسام. كان phenanthridine PJ-34 جزيء أقوى. Declustering من خارج centrosomes أسباب فشل الإنقسامية وموت الخلايا في الخلايا المتعددة centrosomal. معظم السرطانات البشرية الصلبة لديها حدوث ارتفاع إضافي، centrosomes. وقد تم توثيق هذا النشاط من PJ-34 في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير متحد البؤر الحية سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا transfected مع ناقلات ترميز لفلوري γ-تويولين، وهي وفيرة للغاية في centrosomes والفلورسنت H2B هيستون في الوقت الحاضر الكروموسومات. تم الكشف عن ترتيبات الكروموسومات الشاذة ودي عنقودية بؤر γ-تويولين تمثل centrosomes declustered في transfected MDA-MB-231 الخلايا بعد العلاج مع PJ-34. الأمم المتحدة عنقودية خارج centrosomes في قطبي المغزل سبقت موت الخلية الخاصة بهم. هذه النتائج مرتبطة FOR للمرة الأولى في النشاط السامة للخلايا الحصري الكشف مؤخرا من PJ-34 في الخلايا السرطانية البشرية مع خارج centrosomes دو المجموعات في الانقسام، وفشل الإنقسامية مما يؤدي إلى موت الخلية. ووفقا لنتائج الدراسة السابقة التي لاحظها التصوير متحد البؤر الخلايا الثابتة، PJ-34 الخلايا السرطانية القضاء حصرا مع متعددة centrosomes دون المساس تمر الخلايا الطبيعية الانقسام مع اثنين من centrosomes ومغزل ثنائي الوصل. لم يشارك هذا النشاط السامة للخلايا من PJ-34 بواسطة أخرى قوية PARP1 مثبطات، ولوحظ في PARP1 ناقصة MEF extracentrosomes إيواء، مما يشير إلى الاستقلالية لها من PARP1 تثبيط. يعيش التصوير متحد البؤر عرضت أداة مفيدة لتحديد جزيئات جديدة القضاء على الخلايا أثناء الانقسام.
Introduction
المستمدة فينانثرين PARP1 مثبطات، بما في ذلك PJ-34، وقد صممت لحماية الخلايا هادئة من موت الخلايا أفكارك الناجمة عن الطاقة المستهلكة PARP1 بوساطة الحمض النووي إصلاح تحت ظروف الإجهاد (احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية) 1. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة اكتشفنا أن PJ-34، في تركيز أعلى مرتين من أن يحفز PARP1 تثبيط، يمكن أن يسبب موت الخلايا حصرا في الخلايا السرطانية البشرية 2،3. كان أكثر سرعة انتشار الخلية، وكان أكثر كفاءة في القضاء على الخلايا. ويعزى النشاط السامة للخلايا من PJ-34 إلى خارج centrosomes دو المجموعات في الانقسام 2. العديد من الخلايا السرطانية البشرية الميناء multicentrosomes 4،5. الحضانة من الخلايا البشرية سرطان الثدي MDA-MB-231، التي تؤوي centrosomes الزائدين، مع 20 ميكرومتر PJ-34 استئصاله كفاءة هذه الخلايا في غضون 72-96 ساعة دون إضعاف الخلايا هادئة أو بعض الخلايا المتكاثرة حميدة بايواء اثنين centrosomes في الانقسام
ثنائي القطب الجسيم المركزي الجمعية هو أمر حاسم لتشكيل مغزل الانقسام بين القطبين في 4،5. ولذلك، وضعت الخلايا مع أكثر من عقدين من centrosomes آلية الجزيئية فهم نادرا، تجميع centrosomes بهم إضافية في قطبين 4-9. قد فشل القطبين جمعية centrosomes قضيتهم متعدد الأقطاب مشوهة مغزل والشاذة الكروموسومات الفصل الذي يسيطر على دورة الخلية في G2 / M الاعتقال، ويؤدي إلى موت الخلايا التي تعزى إلى فشل الإنقسامية 4،5. يتم التحقيق بشكل مكثف الآليات الجزيئية الكامنة وراء خارج centrosomes دو المجموعات <سوب> 10. وفهم آلية موت هذا تمكين القضاء حصرية من الخلايا السرطانية في حين أن يجنب الأنسجة 5،10 صحية.
وهكذا، والمركبات التي تستخدم لتنشيط موت الخلايا الإنقسامية كارثة نقدم طريقة جديدة لعلاج السرطان انتقائية، والتي قد تكون فعالة في مجموعة واسعة من النتائج cancers.Our الصلبة الإنسان تشير إلى أن التصوير متحد البؤر يمكن أن تستخدم لتحديد الجزيئات التي تؤثر خارج centrosomes التجميع في الانقسام 2،3، مما يجعل هذه المركبات سرطان استهداف المرشحين المخدرات.
لقد وثقنا النشاط السامة للخلايا من phenanthridine PJ-34 عن طريق المسح الضوئي خلايا سرطانية بشرية ثابتة وحية (مع حدوث ارتفاع إضافي، centrosomes في الانقسام) مقابل الخلايا الطبيعية. ويرد وصف خطوة خطوة من إجراءات التصوير المستخدمة لتحديد النشاط السامة للخلايا من PJ-34 في خلايا سرطانية بشرية أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد خلية ثقافة
تم شراؤها MDA-MB-231 الخلايا من ATCC (الاميركي نوع من كوكتيل الثقافة) وتخزينها في النيتروجين السائل.
- البذور 10 6 MDA-MB-231 الخلايا في 92 مم طبق بيتري في 10 المتوسطة كاملة مل تحتوي على Dulbeco التعديل النسر متوسطة (DMEM)، و 10٪ مصل الحصان، 1٪ L-الجلوتامين، و 1٪ Penstrep-Amphotericine B. يسمح للخلايا لتتكاثر إلى حوالي 80-100٪ التقاء.
- إزالة مستنبت من صحن وتجاهل.
- غسل طبقة الخلايا لفترة وجيزة مع 0.25٪ (W / V) حل التربسين EDTA-لإزالة كل آثار من المصل.
- إضافة 2.0 مل من محلول التربسين EDTA-إلى طبق ومراقبة الخلايا بواسطة المجهر المقلوب حتى يتم فرقت طبقة الخلايا (عادة في غضون 5 إلى 15 دقيقة).
- إضافة 18 مل كاملة متوسطة النمو ونضح بلطف الخلايا عن طريق ماصة. نقل إلى أنبوب.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 1،200 دورة في الدقيقة.
- إعادة تعليق بيليه خلية في 24 مل من CUlture المتوسطة.
- إضافة 2 مل من تعليق الخلية إلى 35 مم أطباق أسفل الزجاج (حوالي 25٪ التقاء) ووضعت في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C).
- الحلول:
- متوسط كاملة لتكاثر الخلايا: DMEM مع FBS 10٪، والمضادات الحيوية 1٪ (100 وحدة / مل البنسلين G، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، حل القلم بكتيريا-التقابل) و 2 مم L-الجلوتامين.
- حل التربسين EDTA-، التي تحتوي على 0.25٪ التربسين EDTA-.
- الأطباق:
92 مم أطباق بتري.
35 مم بولي-D-يسين أسفل الزجاج المطلي أطباق الثقافة.
2. إعداد الخلايا للتصوير متحد البؤر لايف
- البذور 2 × 10 5 MDA-MB-231 الخلايا في أسفل الزجاج أطباق الثقافة في 2 مل المتوسطة كاملة كما هو مذكور في القسم 1. عندما تصل إلى خلية ثقافة التقاء 60-70٪ (حوالي 3-4 × 10 5 خلايا لكل طبق)، والمضي قدما مع ترنسفكأيشن.
- بالنقل الخلايا مع اثنين من البلازميدات encodجي اندماج البروتينات γ-تويولين-GFP (للكشف الفلورسنت من centrosomes) وهيستون-RED (H2B-RED، للكشف الفلورسنت من الكروموسومات) باستخدام كاشف ترنسفكأيشن الليبوسومال جت PI، بعد بروتوكول التصنيع. لفترة وجيزة، وخلط 2 ميكروغرام من كل البلازميد في أنبوب مع 100 ميكرولتر كلوريد الصوديوم (150 مم). مزج كاشف ترنسفكأيشن (100 ميكرولتر) مع 100 ميكرولتر كلوريد الصوديوم (150 مم) في أنبوب الثاني، واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم الجمع بين الحلين، مزيج (باستخدام دوامة معتدل) وتدور إلى أسفل. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- أثناء الحضانة من خليط ترنسفكأيشن، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني واستبدال خلية متوسطة مع 2 مل من DMEM الدافئة مع عدم وجود ملاحق (37 ° C).
- إضافة بلطف الخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا في DMEM ومن ثم العودة إلى الخلايا الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 8 ساعة.
- بعد 8 ساعات من الحضانة، استبدال DMEM مع 2 مل المتوسطة كاملة واحتضان الخلايا في الحاضنة لمدة 24الموارد البشرية.
- 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، استبدال المتوسطة من الخلايا مع 2 مل المتوسطة كاملة تحتوي على 20 ميكرومتر PJ-34.
- احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة إضافية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
- موضوع الخلايا للعيش التصوير متحد البؤر لمدة 16 ساعة على الأقل في غرفة التصوير والحفاظ على الخلايا في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
- في موازاة ذلك، دراسة فعالية ترنسفكأيشن 36 ساعة آخر ترنسفكأيشن باستخدام المجهر الفلورسنت على النحو التالي:
- البذور 2 × 10 5 MDA-MB-231 الخلايا في لوحة 6 جيدا تحتوي على 1 ساترة لكل بئر في 2 مل المتوسطة كاملة.
- بالنقل الخلايا كما هو مذكور في أقسام 2،2-2،5.
- 36 ساعة آخر ترنسفكأيشن إصلاح الخلايا transfected التي شنت على ساترة من قبل الحضانة في الميثانول الباردة: الأسيتون (1:1) حل، 7 دقائق، -20 درجة مئوية.
- نضح الحل تثبيت والسماح للساترة مع الخلايا التي شنت لتجف في غطاء الكيميائية.
- تطبيق إطالة الذهب antifade كاشف مع دابي وترك اله ساترة لتجف في الظلام لمدة 6 ساعة.
- فحص الشريحة تحت المجهر الفلورسنت وحساب النسبة المئوية من الخلايا transfected (إشارات حمراء وخضراء) من مجموع السكان من الخلايا (تلطيخ DNA بواسطة دابي). النسبة المئوية ترنسفكأيشن المطلوب هو حوالي 20-40٪ عندما يتم عد الخلايا 100-200.
3. المعلمات التقنية لايف متحد البؤر إعدادات الماسح الضوئي التصوير
- ScanMode XYZT؛ الثقب [متجدد الهواء] 1.00؛ زووم 3.5 و 8 بت القرار؛ الليزر DPSS 561 نانومتر؛ أرغون، ليزر مرئية 488 نانومتر؛ الليزر و/ ني مرئية 633 نانومتر؛ الهدف HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL الأشعة فوق البنفسجية؛ العددي الفتحة 1.4؛ سرعة المسح الضوئي 700 هرتز؛ مؤشر الانكسار 1.52.
- تم بواسطة IMARIS التصوير البرمجيات 7.0 إعداد صورة 3-D العرض.
4. التصوير متحد البؤر من الانقسام في الخلايا الثابتة
- البذور 2 × 10 5 MDA-MB-231 خلايا الثدي السرطانية (آي تي سي سي)، والماوس العادي الخلايا الليفية الجنينية (MEF)، أو PARP1 ناقصة MEF (PARP - / -، الدكتور فرنسوا Dantzer استعداد) على coverslips الزجاج في لوحة 6 جيدا في 2 مل المتوسطة كاملة. تم غسلها مع coverslips على 96٪ من الإيثانول، وبعد بواسطة غسل بالماء DD العقيمة، والمجففة لمدة 2 ساعة، ووضعها في كل بئر من صحن 6 جيدا.
- إضافة PJ-34 (10-30 ميكرومتر) إلى المتوسطة واحتضان الخلايا للفترة المطلوبة (عادة ما يصل الى 96 ساعة).
- غسل coverslips مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة)، وإصلاح الخلايا باستخدام الحضانة في الميثانول الجليد الباردة: الأسيتون (1:1) حل، 7 دقائق، -20 درجة مئوية.
- نضح الحل تثبيت والسماح للcoverslips على لتجف في غطاء الكيميائية (في هذه المرحلة، يمكن أن تظل في coverslips على -20 درجة مئوية لعدة أسابيع).
- غسل coverslips مرة واحدة مع PBST (PBS تستكمل مع 0.1٪ توين 20) لpermeabilize أغشية الخلية ومنع الخلايا مع 10٪ NDS (حمار عادي سيروم) في PBST ('عرقلة الحل') لمدة 1 ساعة على RT.
- احتضان الخلايا الثابتة permeabilized مع antibodi الابتدائيوفاق لمدة 2 ساعة على RT (للمغزل وcentrosomes تلطيخ). مخففة الأجسام المضادة في عرقلة الحل على النحو التالي: تويولين مكافحة α (1:250 تمييع) والمضادة للγ تويولين (1:200 تمييع). يتم تطبيق الأجسام المضادة الأولية كما يلي: تطبيق 100 ميكرولتر (في قطرة) من مزيج من الأجسام المضادة في عرقلة الحل لكل ساترة على 6 جيدا غطاء لوحة (الغطاء هو رأسا على عقب). وضع بلطف ساترة على انخفاض الأجسام المضادة وخلايا المصنفة التي تواجه الهبوط. لاحتضان coverslips التي تواجه الأجسام المضادة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- ضع coverslips على العودة في الآبار وغسل الخلايا 3 مرات مع PBST. ثم استخدام نفس الإجراء الموضح في 4.6 لوصفها الخلايا على coverslips مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري. احتضان الخلايا على coverslips مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة، RT، في الظلام. مخففة الأجسام المضادة في عرقلة الحل على النحو التالي: فلور اليكسا 488 (1:1،000 التخفيف؛ الخضراء) واليكسا فلور 568 (1:1،000 التخفيف؛أحمر).
- تحميل coverslips على استخدام الذهب إطالة كاشف antifade مع دابي (الكروموسومات لتلطيخ)، واحتضان بين عشية وضحاها في RT في الظلام لتجف.
- دراسة ينزلق الغطاء بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
5. بقاء الخلية تقاس إنتاج ATP
يتم قياس إنتاج ATP من قبل الانارة ATP كشف عدة مقايسة.
- بذور الخلايا في لوحة 96 جيدا، ما يقرب من 20،000 الخلايا في 800 ميكرولتر المتوسطة في كل بئر. وينبغي أن تستخدم ثلاثة آبار فارغة لتحديد التلألؤ خلفية المتوسطة.
- إعداد ATP القياسية سلسلة التخفيف من حوالي 10 ميكرومتر إلى 100 ميكرومتر والحفاظ على الجليد.
- إضافة 50 ميكرولتر من المنظفات إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 5 دقائق في شاكر المداري، 700 دورة في الدقيقة.
- إعادة كل قارورة من 'الركيزة مجفف بالتجميد' مع 5 مل من 'المخزن المؤقت الركيزة' في المجموعة.
- إضافة 50 ميكرولتر من الحل الركيزة المعاد إلى الآبار، ويهزلوحة لمدة 5 دقائق على شاكر المداري، 700 دورة في الدقيقة.
- الحفاظ على لوحة في الظلام لمدة 10 دقيقة.
- قياس luminiscence من كل بئر بواسطة ELISA قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PJ-34 هو المياه مستقر قابل للذوبان phenanthridine 1 (الشكل 1). كشفت نتائجنا السابقة موت الخلايا ودي عنقودية خارج centrosomes في عدة أنواع من الخلايا السرطانية متعدد centrosomal الثابتة التي كانت تعامل مع PJ-34. في المقابل، لم تضعف الخلايا المتكاثرة العادي 2،3. وقد تم تحديد Centrosomes بواسطة وضع العلامات مزدوج مع الأجسام المضادة الموجهة ضد centrine1 وγ-تويولين في الخلايا خارج centrosomal ثابت 2.
هنا، وقد تم توثيق هذا النشاط السامة للخلايا من PJ-34 في هذه الخلايا خارج centrosomal الحية في الوقت الحقيقي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر الحية. يعيش سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا، والتي لديها حدوث عالية (> 50٪) من خارج centrosomes 4،5، تم مسحها ضوئيا لمدة 16 ساعة على الأقل قبل التصوير متحد البؤر تركز على الخلايا transfected مع γ-تويولين-GFP ( الفلورسنت وصفها من γ-تويولين بؤر 2) ومع هيستون H2B-RED (الفلورسنت ابيلينغ من الكروموسومات). تم مسحها ستة إلى عشرة الخلايا transfected الحية بالتوازي في كل تجربة. وكان الوسم المناعي المزدوج للبؤر γ-تويولين في الخلايا transfected مع centrin1 المستحيل من الناحية التقنية.
ونادرا ما يلاحظ فرقت γ-تويولين البؤر وترتيب الكروموسومات الشاذة في اختيارها عشوائيا دون علاج MDA-MB-231 الخلايا في الانقسام. وقد تم توثيق المجموعات ثنائية البؤرة من بؤر γ-تويولين، يمثلون خارج centrosomes المجموعات ثنائية البؤرة، في غالبية الحية غير المعالجة MDA-MB-231 الخلايا (الشكل 2)، وفي المقابل، centrosomes وترتيب الكروموسومات الشاذة الأمم المتحدة عنقودية تم الكشف في Live transfected MDA-MB-231 الخلايا المحتضنة مع PJ-34 (20 ميكرومتر)، والانقسام في هذه الخلايا انتهت بموت الخلية (الشكل 3). وحضنت هذه الخلايا مع PJ-34 ل18 - 24 ساعة قبل المسح الضوئي ولمدة 16 ساعة إضافية خلال المسح الضوئي (الشكل 3). وثائق في الوقت الحقيقي من الخلية دياته أثناء الانقسام يدعم بقوة وجود علاقة إيجابية المعرفة مسبقا بين عدد من الخلايا الخبيثة الإنسان مع مغزل متعدد الأقطاب في الانقسام ونسبة موت الخلايا في الخلايا المحتضنة مع PJ-34 (20 ميكرومتر) 2.
PJ-34 بمثابة قوية PARP1 المانع 1. ولذلك درسنا إمكانية PARP1 تثبيط يسبب موت الخلايا المرتبطة فشل الإنقسامية. على عكس التصوير الحي، والتصوير من إصلاح الخلايا MDA-MB-231 تمكين فحص عدد كبير من الخلايا في مزارع الخلايا، وبالتالي تمكين التحليل الإحصائي للآثار PARP1 مثبطات في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا السرطانية البشرية. تمت مقارنة النشاط من PJ-34 لنشاط أخرى قوية، غير فينانثرين PARP1 مثبطات في الحالات العادية أو PARP1 الخلايا ناقصة (أي طبيعية وPARP1 (- / -) الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEF)) (الشكل 4). PARP1 ناقصة MEF ميناء متعدد centrosomes في الانقسام، ولكنها ليستتي الخلايا السرطانية 11. والدكتور فرانسواز Dantzer، ستراسبورغ، فرنسا أعدت هذه الخلايا.
تم immunolabeled MEF لα وγ-تويولين التي وصفت مغزل وcentrosomes، على التوالي، كما ذكرت قبل 2 الثابتة العادية وPARP1 (- / -). وعولج بعض الثقافات الخلية بحثت مع PJ-34 أو أخرى قوية، غير فينانثرين PARP1 مثبطات، بما في ذلك ABT-888 وAG01469، التي تمنع نشاط الأنزيمي من PARP1، وBSI-201، وهو مركب يبدو أن خفف PARP1 ملزم لل رصدت DNA 12-14. أيا من اختبار PARP1 مثبطات ضعاف MEF طبيعي بتركيزات تثبيط PARP1 النشاط (الشكل 4). في المقابل، PJ-34 تسبب الجرعة وبشكل تابع من الامم المتحدة وتجميع γ-تويولين البؤر، والتشويه من مغزل وموت الخلايا في PARP1 (- / -) MEF (أرقام 4A و B). لم يكن لوحظ هذا في MEF طبيعي تعامل مع PJ-34 (الارقام ..ه 4B) أو في PARP1 (- / -) MEF تعامل مع غير phenenthrene PARP1 مثبطات ABT-888 أو AG014699 (الشكل 4C). وتجدر الإشارة إلى أن PJ-34 بتركيزات تزيد عن 20 ميكرومتر لم يضعف MEF العادي، على الرغم من MEF العادي كانوا أكثر مقاومة للPJ-34 آخر من PARP1 (- / -) MEF.
حقيقة أن PJ-34 استئصال PARP1 (- / -) MEF على الرغم من PARP1 نقص، والعلاقة بين تشكيل مغزل متعدد التنسيق والقضاء على الخلية في PARP1 (- / -) MEF حضنت مع PJ-34 بتركيزات أعلى من تلك المطلوبة لتثبيط PARP1، لم تكن متسقة مع وجود صلة سببية بين خارج centrosomes دو المجموعات في PARP1 (- / -) MEF وPARP1 تثبيط (الشكل 4A). النشاط السامة للخلايا من PJ-34 في PARP1 (- / -) MEF يمكن تفسير أفضل من خلال نشاطها باعتبارها خارج centrosomes وكيل دي المجموعات في خلايا متعددة centrosomal 2 ( معلومات تكميلية "/> الشكل (3). وثائق التصوير متحد البؤر حية من موت الخلايا في اختيارها عشوائيا MDA-MB-231 خلية في الانقسام مع الأمم المتحدة عنقودية γ-تويولين المسمى خارج centrosomes. وحضنت MDA-MB-231 الخلايا مع PJ-34 لمدة 24 ساعة قبل المسح الضوئي وخلال ساعة 16 من التصوير متحد البؤر الحية. PJ-34 تم تطبيق 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع ناقلات التعبير عن γ-تويولين-GFP (الخضراء، بؤر γ-تويولين وcentrosomes) وH2B-RED (أحمر، الصبغيات). 
الشكل 1. وphenanthridine PJ-34: N-(6 أوكسو-5 ،6-ثنائي هيدرو-phenanthridin-2-YL)-N، N-ثنائي ميثيل-اسيتاميد. 
الشكل 2. تجمع ثنائي الوصل من خارج centrosomes في اختيارها عشوائيا الحية MDA-MB-231 خلية في الانقسام. A. اللوحة العليا: centrosomes إعتبر في اختيارها عشوائيا الحية MDA-MB-231 خلية transfected مع γ-تويولين-GFP اللوحة السفلى:. كروموسوم إعادة ترتيبات خلال الانقسام في اختيارها عشوائيا MDA-MB-231 خلية transfected مع هيستون H2B-RED. B. الانقسام ثنائي الوصل مع متفاوت خارج centrosomes المحددة في عبادة اختيارها عشوائيامحكم MDA-MB-231 خلية. وخلايا من قبل كل من γ-تويولين-GFP (وضع العلامات γ-تويولين بؤر؛ الخضراء) وهيستون H2B-RED (وضع العلامات الكروموسومات، أحمر). 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تعرض الخلايا إلى التصوير مبائر حية لمدة 16 ساعة. تم مسحها ستة خلايا بالتوازي في كل تجربة. أجريت أربع تجارب مختلفة. انظر أيضا المعلومات التكميلية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية . 
الشكل (3). -centrosomes اضافية دي تجميع سبقت موت الخلايا الحية في MDA-MB-231 الخلايا المعالجة مع PJ-34. A اختيارها عشوائيا الحية MDA-MB-231 خلية في الانقسام مع centrosomes متفرقة (1 الإطار شارع على اليسار) انتهت بموت الخلية ( 2 الثانية و 3 إطارات RD). هذا موقد تم اختيار ليرة لبنانية بشكل عشوائي في خلية ثقافة المحتضنة لمدة 24 ساعة مع PJ-34 (20 ميكرومتر) تطبيق 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع ناقلات التعبير عن γ-تويولين-GFP (وضع العلامات بؤر γ-تويولين بما في ذلك centrosomes؛ الخضراء) وهيستون H2B-RED ( الكروموسومات وصفها؛ الحمراء). تم تفحص الخلية لمدة 16 ساعة بواسطة التصوير متحد البؤر الحية. تم مسحها ستة خلايا بالتوازي في كل تجربة. وأجريت ثلاث تجارب مختلفة. انظر أيضا المعلومات التكميلية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية . 
الشكل 4. A النشاط السامة للخلايا من PJ-34 في PARP1 (- / -) الخلايا الليفية الماوس الجنينية. A. (يسار) النسبة المئوية للمغزل متعدد التنسيق المحسوبة في نأرمال (الخط الأسود) وParp1 - / - (خط رمادي) MEF، حضنت لمدة 48 ساعة مع PJ-34 في تركيزات المشار إليه. تم حساب النسبة المئوية للمغزل متعدد الأقطاب من أصل 20 مجموع مغزل الكشف في 3 تجارب مختلفة. (الحق) انخفاض بقاء الخلية المكتشفة في مزارع الخلايا المحتضنة لمدة 72 ساعة مع PJ-34 (20 ميكرومتر) بالنسبة لبقاء الخلايا غير المعالجة التحكم (العادي (الخط الأسود) وParp1 - / - (خط رمادي) MEF). كان يعاير بقاء الخلية من قبل خلايا 'ATP الإنتاج (بروتوكول 5). يتم عرض القيم يعني من 4 قياسات لكل خط الخلية في 3 تجارب مختلفة B. المغازل في اختيارها عشوائيا ثابتة عادية وParp1 - / - MEF في الانقسام، غير المعالجة (السيطرة) أو حضنت مع PJ-34 لمدة 48 ساعة في المشار التركيزات. PJ-34 متعدد الأقطاب تسبب مغزل. تم إصلاح الخلايا، permeabilized وimmunolabeled لα وγ-تويولين (وضع العلامات الخضراء من مغزل و وضع العلامات الحمراء من centrosomes، على التوالي). وصفت الكروموسومات مع دابي كاشف (الازرق). . نتائج ممثل من 3 تجارب مختلفة لم C. قويا لغير فينانثرين PARP1 مثبطات لا يؤثر centrosomes المجموعات في PARP1 (- / -) MEF. / - - يتم عرض MEF مغزل من اختيارها عشوائيا العادية وParp1؛ MEF غير المعالجة (السيطرة) أو MEF المعالجة لمدة 48 ساعة مع مثبطات PARP غير فينانثرين، AG01469 (20 ميكرومتر) أو ABT888 (20 ميكرومتر). وصفت الكروموسومات مع دابي كاشف (الازرق). وقد تم الحصول على نتائج مشابهة في 3 تجارب مختلفة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
انقر هنا لعرض أكبر شخصية . 
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
2B الشكل. الشكل التكميلي. A اختيارها عشوائيا MDA-MB-231 خلية في طور الصعود مع ثنائي الوصل متفاوت γ-تويولين المسمى خارج centrosomes تم مسحها ضوئيا لمدة 16 ساعة بواسطة التصوير متحد البؤر الحية، 48 ساعة بعد أن transfected مع ناقلات التعبير عن γ-تويولين-GFP و H2B-RED (وضع العلامات بؤر γ-تويولين وcentrosomes في الخلايا الثابتة (الخضراء) ووضع العلامات هيستون H2B من الكروموسومات (الأحمر)، على التوالي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعيش المقدمة التصوير متحد البؤر وثائق في الوقت الحقيقي من تأثير السامة للخلايا من PJ-34 في خلايا متعددة centrosomal الحية خلال الانقسام (الشكل 3 و معلومات تكميلية). وكان هذا أول الوثائق الحية عازيا السمسة من PJ-34 في خلايا سرطانية بشرية لcentrosomes اضافية دي تجميع وموت الخلايا، مما يشير إلى تحريض الميتوزى موت الخلايا النكبة عن PJ-34 5-9. في المقابل، لوحظ تجمع ثنائي الوصل من centrosomes فائقة numerary في الحي غير المعالجة MDA-MB-231 الخلايا التي تمر الانقسام طبيعية مع ثنائي focali centrosomes اضافية متفاوت المسافات (الشكل 2، والمعلومات التكميلية).
ووفقا لهذه النتائج، ويعيش التصوير مبائر من الخلايا transfected يمكن أن تكون مفيدة للكشف عن إزفاء من البروتينات المتورطين في خارج centrosomes المجموعات في الخلايا transfected خلال الانقسام 5،9،15،16. تحديد البروتينات تتأثر PJ-34 في متعدد centrosالخلايا العمال قد توفر بعض القرائن لفهم آليات تفعيلها من خلال الموت خارج centrosomes دو المجموعات.
لا بد من الاستفادة من التصوير متحد البؤر الحية في توفير المعلومات في الوقت الحقيقي أثناء الانقسام في الخلايا الحية، وأيضا إلى العديد من القيود. عدد الخلايا مسحها ضوئيا في التجربة محدودة. وبالتالي فرص للكشف عن الخلايا في الانقسام منخفضة، وهناك حاجة لتكرار عدة تجارب وثائق في الوقت الحقيقي من الانقسام في الخلايا الممسوحة ضوئيا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النجاح يعتمد بشكل كبير على كفاءة عالية من ترنسفكأيشن من الخلايا مع ناقلات التعبير عن البروتينات المسمى. وهكذا، على الرغم من كونه موثوق بها، والتصوير متحد البؤر الحية هو مضيعة للوقت ويطالب عمال الصلب من ذوي الخبرة العالية.
في المقارنة، كيمياء سيتولوجية مناعية ومتحد البؤر التصوير من الخلايا الثابتة تمكين فحص عدد كبير من الخلايا في التجربة، وهو مطلوب لإجراء تحليل إحصائي موثوق بها. استخدمنا هذا الأسلوب لمقارنةآثار PJ-34 في الانقسام للخلايا حميدة الطبيعي أن آثاره في خلايا السرطان الذين يخضعون الانقسام مع centrosomes الزائدين 2،3. وبالمثل، تم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة آثار PJ-34 إلى أن من غير فينانثرين PARP1 مثبطات في PARP (- / -) MEF إيواء خارج centrosomes (الخلايا مع حدوث ارتفاع متعدد centrosomes 11) (الشكل 4).
وباختصار، نتائجنا تشير إلى الاستفادة من الجمع بين المعلومات في الوقت الحقيقي الأكثر قيمة التي تقدمها التصوير مبائر من الخلايا الحية في الانقسام (الشكلان 2 و 3) مع الكيمياء الخلوية وتحليل مبائر من الخلايا الثابتة. مزيج من هذه الأساليب قد تكون مفيدة لتحديد النشاط السامة للخلايا من الجزيئات الصغيرة التي، مثل PJ-34، استهداف آليات محددة للغاية لبقاء الخلية. الاعتماد فريدة من العديد من الخلايا السرطانية البشرية في خارج centrosomes التجميع ثنائي القطبية لانتشارها واجل البقاءآل يجعل PJ-34 مرشح محتمل لعلاج السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
مصادر التمويل لهذا البحث: صندوق مشترك لشركة جامعة تل أبيب نقل التكنولوجيا، راموت ومركز سبأ-الطبية (M. CA وSI)، ICRF - سرطان الإسرائيلي البحوث في مؤسسة (M. CA.) ومؤسسة العلوم اسرائيل ( SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II | |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
