Summary
पिंजरे का बँटवारा के दौर से गुजर कैंसर की कोशिकाओं में phenanthridine पी.जे.-34 के साइटोटोक्सिक गतिविधि जीना confocal इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में लिखा गया था. पीजे -34 नाश मानव स्तन कैंसर एमडीए MB-231 बँटवारा में अतिरिक्त centrosomes शरण कोशिकाओं. सामान्य द्वि फोकल पिंजरे का बँटवारा के विपरीत, अतिरिक्त centrosomes पी.जे.-34 की उपस्थिति में दो धुरी खंभे में क्लस्टर नहीं थे.
Abstract
शक्तिशाली PARP1 inhibitors के रूप में अभिनय Phenanthrene डेरिवेटिव बँटवारा में बहु centrosomal मानव कैंसर कोशिकाओं में अधिसंख्य centrosomes की द्वि फोकल क्लस्टरिंग रोका. phenanthridine पी.जे.-34 सबसे शक्तिशाली अणु था. अतिरिक्त centrosomes की Declustering बहु centrosomal कोशिकाओं में mitotic विफलता और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है. सबसे ठोस मानव कैंसर अतिरिक्त centrosomes की उच्च घटना है. पीजे -34 की गतिविधि जीवित मानव स्तन कैंसर centrosomes में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है जो फ्लोरोसेंट γ-ट्यूबिलिन, के लिए एन्कोडिंग वैक्टर के साथ और में फ्लोरोसेंट histone H2B उपस्थित लिए ट्रांसफ़ेक्ट एमडीए MB-231 कोशिकाओं के confocal इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में लिखा गया था गुणसूत्रों. न्यायपालिका गुणसूत्रों की व्यवस्था और declustered centrosomes का प्रतिनिधित्व डे क्लस्टर γ-ट्यूबिलिन foci पी.जे.-34 के साथ उपचार के बाद ट्रांसफ़ेक्ट एमडीए MB-231 कोशिकाओं में पाया गया. दो धुरी खंभे में संयुक्त राष्ट्र क्लस्टर अतिरिक्त centrosomes उनके कोशिका मृत्यु से पहले. इन परिणामों के लिए जुड़ा हुआआर पहली बार अतिरिक्त centrosomes बँटवारा में डे क्लस्टरिंग, और कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी mitotic विफलता के साथ मानव कैंसर कोशिकाओं में पीजे -34 के हाल ही में पता चला अनन्य साइटोटोक्सिक गतिविधि. दो centrosomes और द्वि फोकल spindles के साथ पिंजरे का बँटवारा के दौर से गुजर सामान्य कोशिकाओं आई. बिना तय कोशिकाओं, बहु centrosomes साथ पीजे -34 विशेष रूप से नाश कैंसर कोशिकाओं के confocal इमेजिंग द्वारा मनाया पिछले निष्कर्षों के अनुसार. पीजे -34 के इस साइटोटोक्सिक गतिविधि अन्य शक्तिशाली PARP1 अवरोधकों द्वारा साझा नहीं किया गया था, और PARP1 निषेध की अपनी स्वतंत्रता है, सुझाव PARP1 कमी MEF शरण extracentrosomes में मनाया गया. Confocal इमेजिंग लाइव बँटवारा दौरान कोशिकाओं उन्मूलन नए अणुओं की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण की पेशकश की.
Introduction
Phenanthrene, पीजे -34 सहित PARP1 इनहिबिटर व्युत्पन्न तनाव की स्थिति (स्ट्रोक या रोधगलन) 1 के तहत ऊर्जा खपत PARP1 मध्यस्थता डीएनए की मरम्मत से प्रेरित apoptotic कोशिका मृत्यु से मौन कोशिकाओं की रक्षा के लिए डिजाइन किए गए थे. हालांकि, हाल ही में हम पी जे -34, कि उत्प्रेरण PARP1 निषेध की तुलना में दो बार उच्च एकाग्रता में, विशेष रूप से मानव कैंसर कोशिकाओं 2,3 में कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है की खोज की. सेल का अधिक तेजी से प्रसार था, कोशिकाओं के अधिक कुशल उन्मूलन था. पीजे -34 के साइटोटोक्सिक गतिविधि अतिरिक्त centrosomes बँटवारा 2 में डे क्लस्टरिंग के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. कई मानव कैंसर कोशिकाओं बंदरगाह 4,5 multicentrosomes. कुशलता से पिंजरे का बँटवारा में दो centrosomes शरण मौन कोशिकाओं या कुछ सौम्य proliferating कोशिकाओं आई. बिना 72-96 घंटे के भीतर इन कोशिकाओं नाश 20 माइक्रोन पी.जे.-34 के साथ, अधिसंख्य centrosomes बंदरगाह जो मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को एमडीए MB-231, के ऊष्मायन
द्विध्रुवी तारककाय विधानसभा बँटवारा 4,5 में द्विध्रुवी धुरी गठन के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, अधिक से अधिक दो centrosomes साथ कोशिकाओं के दो ध्रुवों 4-9 पर उनके अतिरिक्त centrosomes क्लस्टरिंग, एक शायद ही समझ आणविक तंत्र विकसित किया है. उनके centrosomes की द्विध्रुवी विधानसभा की विफलता गिरफ्तारी जी 2 / एम गिरफ्तारी में सेल चक्र, और कोशिका मृत्यु हो जाती है 4,5 mitotic विफलता को जिम्मेदार ठहराया है कि बहुध्रुवीय विकृत spindles और न्यायपालिका गुणसूत्रों अलगाव का कारण बन सकता है. अतिरिक्त centrosomes डे क्लस्टरिंग अंतर्निहित आणविक तंत्र अधिकता की जांच कर रहे हैं <> 10 समर्थन. स्वस्थ ऊतकों 5,10 बख्शते हुए इस मौत तंत्र को समझना कैंसर कोशिकाओं के अनन्य उन्मूलन सक्षम हो जाएगा.
इस प्रकार, mitotic तबाही कोशिका मृत्यु को सक्रिय यौगिकों कि confocal इमेजिंग अतिरिक्त centrosomes क्लस्टरिंग में प्रभावित करने वाले अणुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सुझाव है कि मानव ठोस cancers.Our परिणामों की एक विस्तृत श्रृंखला में कुशल हो सकता है जो एक चयनात्मक कैंसर के उपचार की एक नई विधा है, की पेशकश पिंजरे का बँटवारा 2,3, दवा उम्मीदवारों को लक्षित इन यौगिकों कैंसर प्रतिपादन.
हम निश्चित और जीने मानव कैंसर कोशिकाओं (बँटवारा में अतिरिक्त centrosomes की उच्च घटना के साथ) की तुलना में सामान्य कोशिकाओं को स्कैन करके phenanthridine पी.जे.-34 के साइटोटोक्सिक गतिविधि दस्तावेज है. एक कदम दर मानव कैंसर कोशिकाओं में पीजे -34 के साइटोटोक्सिक गतिविधि की पहचान करने के लिए इस्तेमाल इमेजिंग प्रक्रियाओं के कदम विवरण नीचे शामिल है.
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Protocol
1. सेल संस्कृति तैयारी
एमडीए MB-231 कोशिकाओं ATCC (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह) से खरीदा और तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया.
- Dulbeco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% घोड़े सीरम, 1% एल glutamine, और 1% Penstrep-Amphotericine बी युक्त 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम में 92 मिमी व्यास पेट्री डिश में बीज 10 6 एमडीए MB-231 कोशिकाओं कोशिकाओं की अनुमति दें 80-100% के बारे में संगम के लिए पैदा करना है.
- पकवान से संस्कृति के माध्यम से निकालें और त्यागें.
- 0.25% सीरम के सभी निशान को दूर करने के लिए (w / वी) ट्रिप्सिन-EDTA समाधान के साथ संक्षिप्त सेल परत धो लें.
- सेल परत (आमतौर पर 5 से 15 मिनट के भीतर) छितरी हुई है जब तक उलटा माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं पकवान और निरीक्षण करने के लिए ट्रिप्सिन-EDTA समाधान के 2.0 मिलीलीटर जोड़ें.
- 18 मिलीलीटर पूरा मध्यम विकास जोड़ें और धीरे विंदुक द्वारा कोशिकाओं aspirate. एक ट्यूब पर स्थानांतरण.
- 1,200 rpm पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
- घन के 24 मिलीलीटर में सेल गोली पुनः निलंबितमध्यम LTURE.
- 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन (25% संगम के बारे में) और इनक्यूबेटर में जगह (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
- समाधान:
- कोशिकाओं के प्रसार के लिए पूरा मध्यम: 10% FBS के साथ DMEM, 1% एंटीबायोटिक्स (100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन जी, 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, पेन Strep-Ampho समाधान) और 2 मिमी एल glutamine.
- 0.25% trypsin-EDTA युक्त trypsin-EDTA समाधान,.
- व्यंजन:
92 मिमी व्यास पेट्री डिश.
35 मिमी व्यास पाली डी lysine लेपित गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन.
2. लाइव confocal इमेजिंग के लिए कक्ष की तैयारी
- बीज 2 एक्स 10 धारा 1 में वर्णित के रूप में 2 मिलीलीटर पूरा मध्यम में गिलास नीचे संस्कृति बर्तन में 5 एमडीए MB-231 कोशिकाओं. सेल संस्कृति 60-70% का संगम (पकवान प्रति 3-4 x 10 5 कोशिकाओं के बारे में) तक पहुँच जाता है, अभिकर्मक के साथ आगे बढ़ना.
- दो प्लास्मिडों encod साथ कोशिकाओं transfectनिर्माण प्रोटोकॉल के बाद, लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक जेट गड़बड़ी का उपयोग कर संलयन प्रोटीन γ-ट्यूबिलिन-GFP (centrosomes की फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए) और histone लाल (H2B लाल, गुणसूत्रों की फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए) आईएनजी. संक्षेप में, 100 μl NaCl (150 मिमी) के साथ एक ट्यूब में प्रत्येक प्लाज्मिड से 2 ग्राम मिश्रण. एक दूसरे ट्यूब में 100 μl NaCl (150 मिमी) के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक (100 μl) मिक्स, और कमरे के तापमान (आर टी) पर 5 मिनट सेते हैं. फिर दो समाधान, मिश्रण (हल्के भंवर का उपयोग) गठबंधन और स्पिन डाउन. आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- अभिकर्मक मिश्रण की ऊष्मायन के दौरान, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोने और कोई खुराक के साथ गर्म DMEM के 2 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ सेल मध्यम जगह.
- धीरे DMEM में कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण जोड़ने और फिर 8 घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) इनक्यूबेटर में कोशिकाओं वापसी.
- 24 के लिए ऊष्मायन के 8 घंटे के बाद, 2 मिलीलीटर पूरा मध्यम के साथ DMEM की जगह और इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेतेघंटा.
- 24 घंटा अभिकर्मक के बाद, 2 मिलीलीटर पूरा मध्यम 20 माइक्रोन पीजे -34 युक्त के साथ कोशिकाओं के मध्यम जगह.
- अतिरिक्त 18 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखने इमेजिंग कक्ष में कम से कम 16 घंटे के लिए confocal इमेजिंग जीना विषय कोशिकाओं
- समानांतर में, पालन के रूप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग अभिकर्मक प्रभावकारिता 36 घंटे बाद अभिकर्मक की जांच:
- बीज 2 एक्स 10 1 coverslip प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर पूरा माध्यम युक्त 6 अच्छी तरह से थाली में 5 एमडीए MB-231 कोशिकाओं.
- वर्गों 2.2-2.5 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं transfect.
- 36 घंटे बाद अभिकर्मक ठंड मेथनॉल में ऊष्मायन द्वारा एक coverslip पर मुहिम शुरू की कोशिकाओं को ठीक: एसीटोन (1:1) समाधान, 7 मिनट, -20 डिग्री सेल्सियस
- नियतन समाधान महाप्राण और एक रासायनिक हुड में सूखे की मुहिम शुरू की कोशिकाओं के साथ coverslip करते हैं.
- DAPI के साथ गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा और वें चलो लागू करेंई coverslip के 6 घंटे के लिए अंधेरे में सूखे के लिए.
- फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे स्लाइड की जांच करने और कोशिकाओं की कुल जनसंख्या (DAPI के द्वारा डीएनए धुंधला) से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (लाल और हरे रंग का संकेत) के प्रतिशत की गणना. 100-200 कोशिकाओं गिना जाता है जब वांछित अभिकर्मक प्रतिशत 20-40% के बारे में है.
3. लाइव confocal इमेजिंग स्कैनर सेटिंग्स की तकनीकी पैरामीटर
- ScanMode XYZT; पिनहोल [हवादार] 1.00, ज़ूम 3.5; संकल्प 8 बिट, लेजर DPSS 561 एनएम, आर्गन, दिखाई लेजर 488 एनएम, लेजर वह / ने दिखाई 633 एनएम, उद्देश्य HCX पी एल एपीओ सीएस 63X 1.40 तेल यूवी, संख्यात्मक एपर्चर 1.4; अपवर्तन सूचकांक 1.52, गति 700 हर्ट्ज स्कैन करें.
- छवि 3 डी प्रस्तुति Imaris इमेजिंग सॉफ्टवेयर 7.0 द्वारा तैयार किए गए थे.
4. फिक्स्ड कोशिकाओं में सूत्रीविभाजन की confocal इमेजिंग
- बीज 2 एक्स 10 5 एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं (ATCC), सामान्य माउस भ्रूण fibroblasts (MEF), या PARP1 कमी इ2 मिलीलीटर पूरा मध्यम में 6 अच्छी तरह से थाली में कांच coverslips पर एफ (, डॉ. फ्रैंकोइस Dantzer द्वारा तैयार PARP - / -). Coverslips 2 घंटे के लिए सूख गया, और 6 अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक कुएं में रखा, बाँझ डीडी पानी से धोने से निम्नलिखित, 96% इथेनॉल के साथ धोया गया.
- मध्यम करने पी.जे.-34 (10-30 माइक्रोन) जोड़ें और आवश्यक अवधि (आमतौर पर अप करने के लिए 96 घंटे) के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- पीबीएस के साथ एक बार coverslips धो लें (फॉस्फेट खारा बफर), और बर्फ ठंड मेथनॉल में ऊष्मायन का उपयोग कोशिकाओं को ठीक: एसीटोन (1:1) समाधान, 7 मिनट, -20 डिग्री सेल्सियस
- नियतन समाधान महाप्राण और coverslips रासायनिक हुड में सूखे के लिए करते हैं (इस स्तर पर, coverslips के कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में रखा जा सकता है).
- कोशिका झिल्ली permeabilize और आरटी पर 1 घंटे के लिए PBST में 10% एनडीएस (सामान्य गधा सीरम) ('अवरुद्ध समाधान') के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए PBST (पीबीएस 0.1% बीच 20 के साथ पूरक) के साथ एक बार coverslips धो लें.
- प्राथमिक antibodi साथ permeabilized तय कोशिकाओं सेतेआरटी पर 2 घंटे के लिए तों (spindles और centrosomes धुंधला के लिए). विरोधी α ट्यूबिलिन (1:250 कमजोर पड़ने) और विरोधी γ ट्यूबिलिन (1:200 कमजोर पड़ने): एंटीबॉडी पालन के रूप में अवरुद्ध समाधान में पतला कर रहे हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में निम्न प्रकार लागू कर रहे हैं: 6 अच्छी तरह से थाली आवरण (कवर उल्टा है) पर प्रत्येक coverslip के लिए अवरुद्ध समाधान में एंटीबॉडी का एक मिश्रण की 100 μl (एक बूंद में) लागू होते हैं. धीरे एंटीबॉडी ड्रॉप पर coverslip डाल, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं ड्रॉप का सामना करना पड़. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एंटीबॉडी का सामना करना पड़ coverslips सेते हैं.
- कुओं में वापस coverslips प्लेस और PBST के साथ कोशिकाओं 3 बार धो लो. तब फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ coverslips पर कोशिकाओं लेबलिंग के लिए 4.6 में वर्णित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें. अंधेरे में, 1 घंटा, आरटी के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ coverslips पर कोशिकाओं को सेते हैं. एंटीबॉडी पालन के रूप में अवरुद्ध समाधान में पतला कर रहे हैं:; और एलेक्सा Fluor 568 (1:1,000 कमजोर पड़ने एलेक्सा Fluor 488 (हरा 1:1,000 कमजोर पड़ने);लाल).
- का उपयोग कर coverslips DAPI (गुणसूत्रों धुंधला के लिए) के साथ गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा और सुखाने के लिए अंधेरे में आरटी पर रातोंरात सेते माउंट.
- Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कवर फिसल जाता है जांच करते हैं.
5. सेल व्यवहार्यता एटीपी प्रोडक्शन द्वारा मापा
एटीपी उत्पादन एक luminescent एटीपी परख का पता लगाने किट से मापा जाता है.
- 96 अच्छी तरह से थाली, प्रत्येक कुएं में 800 μl मध्यम में लगभग 20,000 कोशिकाओं में बीज कोशिकाओं. तीन खाली कुओं माध्यम की पृष्ठभूमि luminescence के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- लगभग 10 माइक्रोन से 100 माइक्रोन से एटीपी मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार है और बर्फ पर रख.
- प्रत्येक अच्छी तरह से साबुन के 50 μl जोड़ें और कक्षीय प्रकार के बरतन, 700 आरपीएम में 5 मिनट के लिए थाली हिला.
- किट में 'सब्सट्रेट बफर' के 5 मिलीलीटर के साथ 'lyophilized सब्सट्रेट' की पुनर्गठित प्रत्येक शीशी.
- कुओं के पुनर्गठन सब्सट्रेट समाधान के 50 μl जोड़ें, और हिलाकक्षीय प्रकार के बरतन, 700 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए थाली.
- 10 मिनट के लिए अंधेरे में थाली रखें.
- एलिसा microplate रीडर द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से luminiscence उपाय.
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Representative Results
पीजे -34 phenanthridine 1 घुलनशील एक स्थिर पानी (चित्रा 1) है. हमारे पिछले परिणाम कोशिका मृत्यु का पता चला और पी.जे.-34 के साथ इलाज किया गया है कि निश्चित बहु centrosomal कैंसर कोशिकाओं के कई प्रकार में अतिरिक्त centrosomes डे क्लस्टर. इसके विपरीत, सामान्य proliferating कोशिकाओं 2,3 बिगड़ा नहीं थे. Centrosomes निश्चित अतिरिक्त centrosomal कोशिकाओं 2 में centrine1 और γ-ट्यूबिलिन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ डबल लेबलिंग द्वारा की पहचान की गई.
इधर, पीजे -34 के साइटोटोक्सिक गतिविधि जीना confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में इन जीना अतिरिक्त centrosomal कोशिकाओं में लिखा गया था. , मानव स्तन कैंसर अतिरिक्त centrosomes 4,5 के एक उच्च घटना (> 50%) है जो एमडीए MB-231 कोशिकाओं, जीते γ-ट्यूबिलिन-GFP (साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पर केंद्रित confocal इमेजिंग द्वारा कम से कम 16 घंटे के लिए स्कैन किया गया फ्लोरोसेंट γ-ट्यूबिलिन foci 2 की लेबलिंग) और histone H2B लाल (फ्लोरोसेंट labe साथगुणसूत्रों का लिंग). छह से दस जीवित कोशिकाओं प्रत्येक प्रयोग में समानांतर में स्कैन किया गया. Centrin1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में γ-ट्यूबिलिन foci के डबल immunolabeling तकनीकी रूप से असंभव था.
बिखरे γ-ट्यूबिलिन foci और न्यायपालिका गुणसूत्रों व्यवस्था शायद ही कभी बँटवारा में बेतरतीब ढंग से चुनी अनुपचारित एमडीए MB-231 कोशिकाओं में पाया गया. अतिरिक्त centrosomes बाइफोकल क्लस्टरिंग का प्रतिनिधित्व γ-ट्यूबिलिन foci, के द्विनाभित क्लस्टरिंग रहते इलाज एमडीए MB-231 कोशिकाओं (चित्रा 2) के बहुमत में लिखा गया था, इसके विपरीत, centrosomes और गुणसूत्रों की न्यायपालिका व्यवस्था संयुक्त राष्ट्र के क्लस्टर रहते हैं में पाया गया ट्रांसफ़ेक्ट एमडीए MB-231 पी.जे.-34 (20 माइक्रोन), और कोशिका मृत्यु (चित्रा 3) के द्वारा समाप्त इन कोशिकाओं में बँटवारा साथ incubated कोशिकाओं. इन कोशिकाओं को 18 के लिए पी.जे.-34 के साथ incubated रहे थे - 24 घंटे स्कैनिंग से पहले और अतिरिक्त 16 घंटे के लिए (चित्रा 3) स्कैनिंग के दौरान. सेल डे की वास्तविक समय प्रलेखनपिंजरे का बँटवारा दौरान एथलीट दृढ़ता से पिंजरे का बँटवारा में बहु - ध्रुवीय spindles के साथ मानव घातक कोशिकाओं की संख्या और पी जे -34 (20 माइक्रोन) 2 के साथ incubated कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का प्रतिशत के बीच एक पहले से परिभाषित सकारात्मक संबंध का समर्थन करता है.
पीजे -34 एक शक्तिशाली PARP1 अवरोध 1 के रूप में कार्य करता है. इसलिए हम mitotic विफलता के साथ जुड़े कोशिका मृत्यु के कारण PARP1 निषेध की संभावना की जांच की. रहते इमेजिंग के विपरीत, निश्चित एमडीए MB-231 कोशिकाओं की इमेजिंग जिससे मानव कैंसर कोशिका लाइनों की एक किस्म में PARP1 inhibitors के प्रभाव का सांख्यिकीय विश्लेषण को सक्षम करने, सेल संस्कृतियों में कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी की परीक्षा सक्षम. (चित्रा 4) पीजे -34 की गतिविधि सामान्य में अन्य शक्तिशाली, गैर phenanthrene PARP1 inhibitors या PARP1 कमी कोशिकाओं (- / -) माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEF) यानी सामान्य और PARP1 () की गतिविधि की तुलना में था. PARP1 कमी MEF बंदरगाह बँटवारा में बहु centrosomes, लेकिन वे नहीं कर रहे हैंटी ट्यूमर कोशिकाओं 11. इन कोशिकाओं को डॉ. फ्रैंकोइस Dantzer, स्ट्रासबर्ग, फ्रांस द्वारा तैयार किए गए थे.
(- / -) सामान्य फिक्स्ड और PARP1 MEF के रूप में 2 से पहले सूचना दी क्रमशः उनके spindles और centrosomes लेबल कि α और γ-ट्यूबिलिन,, के लिए immunolabeled थे. जांच सेल संस्कृतियों में से कुछ ABT-888 और AG01469, PARP1 के enzymatic गतिविधि को रोकना है, जो और बीएसआई-201 सहित पीजे -34 या अन्य शक्तिशाली, गैर phenanthrene PARP1 inhibitors, जाहिरा तौर पर करने के लिए PARP1 बाध्यकारी attenuates कि एक परिसर के साथ इलाज किया गया डीएनए 12-14 nicked. सांद्रता बाधा PARP1 गतिविधि (चित्रा 4) में सामान्य MEF बिगड़ा परीक्षण PARP1 अवरोधकों से कोई नहीं. इसके विपरीत, पीजे -34 खुराक-dependently PARP1 में γ-ट्यूबिलिन foci, spindles की विकृति और कोशिका मृत्यु का संयुक्त राष्ट्र क्लस्टरिंग कारण (- / -) MEF (आंकड़े -4 ए और बी). इस पी.जे.-34 के साथ इलाज सामान्य MEF में नहीं मनाया गया (Figurई 4 बी) या PARP1 में (- / -) MEF के साथ इलाज गैर phenenthrene PARP1 अवरोधकों ABT-888 या AG014699 (चित्रा 4C). (- / -) MEF यह सामान्य MEF PARP1 से पीजे -34 गतिविधि के लिए प्रतिरोधी थे हालांकि 20 माइक्रोन से अधिक सांद्रता में पी.जे.-34, सामान्य MEF ख़राब था कि ध्यान दिया जाना चाहिए.
तथ्य यह है कि पी जे -34 नाश PARP1 की तुलना में उच्च सांद्रता में पी.जे.-34 के साथ incubated MEF (- / -) अपने PARP1 कमी, और मल्टी फोकल स्पिंडल के गठन और PARP1 में सेल उन्मूलन के बीच संबंध के बावजूद MEF (- / -) (- / -) MEF और PARP1 निषेध (चित्रा -4 ए) PARP1 निषेध के लिए आवश्यक उन, अतिरिक्त centrosomes PARP1 में डे क्लस्टरिंग के बीच एक कारण संबंध के अनुरूप नहीं थे. PARP1 में पीजे -34 के साइटोटोक्सिक गतिविधि (- / -) MEF बेहतर बहु centrosomal कोशिकाओं 2 में एक अतिरिक्त centrosomes डे क्लस्टरिंग एजेंट (के रूप में अपनी गतिविधि से समझाया जा सकता है अनुपूरक सूचना "/> चित्रा 3. संयुक्त राष्ट्र क्लस्टर γ-ट्यूबिलिन लेबल अतिरिक्त centrosomes साथ पिंजरे का बँटवारा में एक बेतरतीब ढंग से चुनी एमडीए MB-231 कोशिका में कोशिका मृत्यु का एक जीवित confocal इमेजिंग प्रलेखन. एमडीए MB-231 कोशिकाओं स्कैनिंग से पहले और जीने confocal इमेजिंग के 16 घंटे के दौरान 24 घंटे के लिए पी.जे.-34 के साथ incubated रहे थे. पीजे -34 γ-ट्यूबिलिन-GFP (हरा, γ-ट्यूबिलिन foci और centrosomes) और H2B लाल (लाल, गुणसूत्रों) व्यक्त वैक्टर साथ अभिकर्मक के बाद 24 घंटे लागू किया गया था. 
चित्रा 1. phenanthridine पी.जे.-34: एन (6 oxo-5 ,6-Dihydro-phenanthridin-2-YL) एन, एन डाइमिथाइल-acetamide. 
चित्रा 2. पिंजरे का बँटवारा में एक बेतरतीब ढंग से चुनी रहते एमडीए MB-231 सेल में अतिरिक्त centrosomes की द्विपक्षीय फोकल क्लस्टरिंग. ए ऊपरी पैनल:. Γ-ट्यूबिलिन-GFP के निचले पैनल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक बेतरतीब ढंग से चुनी रहते एमडीए MB-231 सेल में लेबल centrosomes: histone H2B-लाल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक बेतरतीब ढंग से चुनी एमडीए MB-231 सेल में बँटवारा दौरान क्रोमोजोम फिर से व्यवस्था. एक बेतरतीब ढंग से चुनी पंथ में पहचान क्लस्टर अतिरिक्त centrosomes साथ बी द्विपक्षीय फोकल पिंजरे का बँटवाराured एमडीए MB-231 सेल. और histone H2B लाल (लेबलिंग गुणसूत्रों, लाल), कोशिकाओं दोनों γ-ट्यूबिलिन-GFP (हरी लेबलिंग γ-ट्यूबिलिन foci) द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट थे. 48 घंटा अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए एक जीवित confocal इमेजिंग से अवगत कराया गया. छह कक्षों प्रत्येक प्रयोग में समानांतर में स्कैन किया गया. चार अलग प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया. अनुपूरक सूचना भी देखें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . 
चित्रा 3. अतिरिक्त centrosomes डे क्लस्टरिंग पी.जे.-34 के साथ इलाज किया जीना एमडीए MB-231 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु से पहले. कोशिका मृत्यु के द्वारा समाप्त बिखरे centrosomes (बाईं ओर 1 सेंट फ्रेम) (साथ पिंजरे का बँटवारा में एक बेतरतीब ढंग से चुनी रहते एमडीए MB-231 सेल 2 एन डी और 3 फ्रेम). इस CE केऔर (histone H2B लाल, टू बेतरतीब ढंग γ-ट्यूबिलिन-GFP (हरी centrosomes सहित लेबलिंग γ-ट्यूबिलिन foci) व्यक्त वैक्टर साथ अभिकर्मक के बाद 24 घंटा लागू पी.जे.-34 (20 माइक्रोन) के साथ 24 घंटे के लिए incubated एक सेल संस्कृति में चुना गया था लेबलिंग गुणसूत्रों, लाल). सेल जीना confocal इमेजिंग द्वारा 16 घंटे के लिए स्कैन किया गया था. छह कक्षों प्रत्येक प्रयोग में समानांतर में स्कैन किया गया. तीन अलग प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया. अनुपूरक सूचना भी देखें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . 
4 चित्रा. PARP1 में पीजे -34 के एक साइटोटोक्सिक गतिविधि (- / -) माउस भ्रूणीय fibroblasts. N में गणना की मल्टी फोकल spindles की ए (बाएं) प्रतिशतormal (काला लाइन) और Parp1 - / - संकेत सांद्रता में पी.जे.-34 के साथ 48 घंटे के लिए incubated (ग्रे लाइन) MEF,. बहु - ध्रुवीय स्पिंडल का प्रतिशत 3 अलग प्रयोगों में पाया 20 कुल स्पिंडल के बाहर गणना की गई. (सही) नियंत्रण अनुपचारित कोशिकाओं के अस्तित्व के सापेक्ष पी.जे.-34 (20 माइक्रोन) के साथ 72 घंटे के लिए incubated सेल संस्कृतियों में पाया सेल अस्तित्व कम (- / - सामान्य (काला लाइन) और Parp1 (ग्रे लाइन) MEF). सेल अस्तित्व 'कोशिकाओं एटीपी उत्पादन (प्रोटोकॉल 5) द्वारा assayed किया गया था. संकेत से कम 48 घंटे के लिए इलाज का बँटवारा में MEF, (नियंत्रण) या पी.जे.-34 के साथ incubated -. 3 अलग प्रयोगों में प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए 4 माप का मतलब मूल्यों बेतरतीब ढंग से चुनी तय सामान्य में बी Spindles प्रस्तुत और Parp1 रहे हैं - / सांद्रता. पीजे -34 बहुध्रुवीय स्पिंडल का कारण बना. सेल, तय permeabilized और के लिए immunolabeled थे α और γ-ट्यूबिलिन (हरा spindles की लेबलिंग और क्रमशः centrosomes की लाल लेबलिंग). गुणसूत्रों DAPI अभिकर्मक (नीला) के साथ लेबल रहे थे. . 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम सी. शक्तिशाली गैर phenanthrene PARP1 अवरोधकों PARP1 में centrosomes क्लस्टरिंग को प्रभावित नहीं किया था (- / -) MEF. बेतरतीब ढंग से चुनी सामान्य की spindles और Parp1 - / - MEF प्रस्तुत कर रहे हैं, अनुपचारित MEF (नियंत्रण) या MEF गैर phenanthrene PARP inhibitors, AG01469 (20 माइक्रोन) या ABT888 (20 माइक्रोन) के साथ 48 घंटे के लिए इलाज किया. गुणसूत्रों DAPI अभिकर्मक (नीला) के साथ लेबल रहे हैं. इसी तरह के परिणाम 3 अलग प्रयोगों में प्राप्त किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 2 बी. पूरक चित्रा. द्वि फोकल क्लस्टर γ-ट्यूबिलिन अतिरिक्त centrosomes γ-ट्यूबिलिन-GFP व्यक्त वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट होने के बाद जीना confocal इमेजिंग, 48 घंटे से 16 घंटे के लिए स्कैन किया गया और लेबल के साथ गतिस्थिति में एक बेतरतीब ढंग से चुनी एमडीए MB-231 सेल H2B लाल (लेबलिंग γ-ट्यूबिलिन foci और centrosomes तय कोशिकाओं में (हरा) और गुणसूत्रों की H2B हिस्टोन लेबलिंग (लाल), क्रमशः).
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Discussion
Confocal इमेजिंग पिंजरे का बँटवारा के दौरान रहते बहु centrosomal कोशिकाओं (चित्रा 3 और अनुपूरक जानकारी) में पीजे -34 के साइटोटोक्सिक प्रभाव की एक वास्तविक समय प्रलेखन प्रदान जीते. इस पीजे -34 5-9 से mitotic तबाही कोशिका मृत्यु के शामिल होने का सुझाव, अतिरिक्त centrosomes डे क्लस्टरिंग और कोशिका मृत्यु के लिए मानव कैंसर कोशिकाओं में पीजे -34 के cytotoxicity हवाले पहली रहते प्रलेखन था. इसके विपरीत, सुपर संख्यांक centrosomes की द्वि फोकल क्लस्टरिंग द्वि focali क्लस्टर अतिरिक्त centrosomes (चित्रा 2, अनुपूरक जानकारी) के साथ सामान्य पिंजरे का बँटवारा के दौर से गुजर रहते इलाज एमडीए MB-231 कोशिकाओं में मनाया गया.
इन परिणामों के अनुसार, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के confocal इमेजिंग बँटवारा 5,9,15,16 दौरान कोशिकाओं में अतिरिक्त centrosomes क्लस्टरिंग में फंसा प्रोटीन के स्थानान्तरण का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है रहते हैं. बहु centros में पीजे -34 से प्रभावित प्रोटीन की पहचानomal कोशिकाओं अतिरिक्त centrosomes डे क्लस्टरिंग से सक्रिय मौत तंत्र को समझने के लिए कुछ सुराग प्रदान कर सकता है.
जीवित कोशिकाओं में बँटवारा दौरान वास्तविक समय की जानकारी प्रदान करने में जीना confocal इमेजिंग, का लाभ भी कई सीमाओं के लिए बाध्य है. प्रयोग के प्रति स्कैन कोशिकाओं की संख्या सीमित है. इसलिए बँटवारा में कोशिकाओं का पता लगाने के अवसरों को कम कर रहे हैं, और कई दोहराए जाने वाले प्रयोगों स्कैन की कोशिकाओं में बँटवारा की एक वास्तविक समय प्रलेखन के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, सफलता लेबल प्रोटीन व्यक्त वैक्टर के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक की उच्च क्षमता पर निर्भर है. इस प्रकार, विश्वसनीय होने के बावजूद, जीना confocal इमेजिंग समय लगता है और बेहद अनुभवी कठिन कार्यकर्ताओं की मांग है.
तय कोशिकाओं की तुलना, immunocytochemistry और confocal इमेजिंग में एक विश्वसनीय सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक है जो प्रयोग, प्रति कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के परीक्षा सक्षम. हम तुलना करने के लिए इस विधि का इस्तेमालअधिसंख्य centrosomes 2,3 के साथ पिंजरे का बँटवारा के दौर से गुजर कैंसर की कोशिकाओं में इसके प्रभाव को सामान्य सौम्य कोशिकाओं का बँटवारा में पीजे -34 का प्रभाव. इसी प्रकार, इस विधि PARP में गैर phenanthrene PARP1 अवरोधकों की है कि पीजे -34 के प्रभाव की तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था (- / -) MEF अतिरिक्त centrosomes (बहु centrosomes 11 के उच्च घटना के साथ कोशिकाओं) (चित्रा 4) शरण.
संक्षेप में, हमारे परिणाम cytochemistry और तय कोशिकाओं के confocal विश्लेषण के साथ पिंजरे का बँटवारा में जीवित कोशिकाओं (आंकड़े 2 और 3) के confocal इमेजिंग द्वारा प्रदान की सबसे मूल्यवान वास्तविक समय की जानकारी के संयोजन के लाभ का संकेत मिलता है. इन तरीकों का एक संयोजन पीजे -34 की तरह, सेल अस्तित्व के लिए विशिष्ट तंत्र महत्वपूर्ण लक्ष्य है कि, छोटे अणुओं की साइटोटोक्सिक गतिविधि की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है. उनके प्रसार और surviv के लिए अतिरिक्त centrosomes द्वि ध्रुवीय क्लस्टरिंग पर कई मानव कैंसर कोशिकाओं का अनूठा निर्भरताअल पी.जे.-34 कैंसर के उपचार के लिए एक संभावित उम्मीदवार renders.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस शोध के धन स्रोतों: तेल अवीव विश्वविद्यालय के प्रौद्योगिकी हस्तांतरण कंपनी, Ramot और शेबा मेडिकल सेंटर (एम. सीए और एसआई.), ICRF का एक संयुक्त कोष - इजरायल कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (एम. सीए.) और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन ( एसआई).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II | |
References
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