Renal Capsule Xenografting og subkutane Pellet Implantation for Vurdering af prostata Carcinogenesis og benign prostatahyperplasi

Summary

Vi beskriver fremstillingen af ​​komprimerede hormon pellets samt subkutan kirurgisk implantation i mus. Denne strategi kan kombineres med væksten af ​​celler og væv xenotransplantater under nyrekapslen af ​​athymiske nøgne mus for at evaluere hormonal carcinogenese og regulering af benign prostata vækst.

Abstract

Nye behandlingsmetoder til to almindelige prostata sygdomme, prostatakræft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH), afhænger kritisk på eksperimenter evaluering deres hormonelle regulering. Sex steroidhormoner (især androgener og østrogener) er vigtige i PRCA og BPH, vi sonde deres respektive roller i at tilskynde prostata vækst og carcinogenese i mus med eksperimenter ved hjælp af komprimerede hormon piller. Hormon-og / eller narkotika pellets let fremstillet med en pillepresse og kirurgisk implanteres i det subkutane væv i hanmus vært. Vi beskriver også en protokol til evaluering af hormonal carcinogenese ved at kombinere subkutan hormon pille implantation med xenografting af prostatacellelinjer rekombinanter under nyrekapslen af ​​immunsvækkede mus. Desuden subkutan hormon pellet implantation, i kombination med nyrekapsel xenografting BPH væv, er nyttig for bedre at forstå hormonelle regulering af benign prostspiste vækst, og for at afprøve nye behandlingsformer rettet mod sex steroid hormon veje.

Introduction

Prostatakræft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH) er betydelige sundhedsmæssige byrder. PRCA er den anden mest udbredte solid organ kræft hos mænd og en førende årsag til kræft dødsfald ^1. BPH er også meget udbredt blandt ældre mænd, og det skønnes, at den kliniske manifestation af BPH, nedre urinveje (LUTS), vil påvirke 50-90% af mændene ^2. Mens androgener og østrogener er kendt for at være vigtige i PRCA og BPH, vores forståelse af de hormonelle mekanismer, der ligger til grund karcinogenese og vækst stadig ufuldstændig ^3,4. Enkel og genetisk medgørlige dyremodeller understøtter de undersøgelser, der vil tage fat disse prioriteringer i prostata forskning. I hormon responsive sygdomme såsom PRCA og BPH, anvendelse af subkutan, langsom frigivelse hormon pellets, alene eller i kombination med nyrekapsel xenografting (overførsel af celler, væv eller organer fra én art til en anden) i immunocompromised mus vært, giver en enkel og reproducerbar metode til at studere hormonel regulering af vækst og carcinogenese.

Subkutan hormon pellet implantation er en enkel og reproducerbar metode til at studere hormonale regulering af carcinogenese og godartet vækst i prostata ^5. Subkutan implantation af voksne hanmus med 25 mg testosteron (T) og 2,5 mg 17β-østradiol _(E2), medfører en stigning i serum E ₂ og gradvise fald i T, genskabe dynamisk hormonelle miljø aldrende mænd ^5,6. Desuden denne model sammenfatter mange af de kliniske træk ved BPH-LUTS ^5,7. Alternative metoder til hormon administration omfatter oral / tvangsfodring eller intraperitoneal injektion, som forårsager lidelse for den gnaver, er mindre konsekvent i at levere den samme mængde stof over tid, og er mere arbejdskrævende end en engangs-kirurgisk implantation. Andre subkutane tilstande for hormone og / eller drug delivery omfatter silastikkapsler ^8. Mens vi har også erfaring med brug af silastikkapsler, er komprimeret pellets foretrukket for deres brugervenlighed og reproducerbarhed. Desuden frigivelse satser komprimerede hormon piller bedre efterligne de dynamiske sex steroid hormon nøgletal observeret i aldrende mænd ^5,7.

Da udviklingen af genetisk immunkompromitterede mus har adskillige in vivo modelsystemer inkorporerer xenografting teknikker blevet udviklet til undersøgelse af en lang række normale og sygdomsramte væv. Der er flere grundlæggende kategorier af xenografting. Tissue xenotransplantater består af et lille stykke af intakt væv, som kan være en normal struktur, malign tumor eller godartet vækst. Szot et al. (2007) har for nylig belyst nyrekapsel xenografting af pancreasøer ^9. Aamdal et al. (1985) beskrevet nyrekapsel xenografting af 27 menneskelige kræftceller i immunocompromised mus er vært for ^10. Transplantater kan også være sammensat af en enkelt immortaliseret cellelinie (kræft eller ikke-tumorigene) eller kan bestå af en udødeliggjort cellelinie kombineret med celler isoleret fra mesenkym (celle rekombinant graft).

Vi går ind xenografting af celle rekombinanter at sonden respektive roller stroma og epithel i udviklingen af ​​PRCA og BPH. Cunha et al. (1980) var den første til at rapportere, at når voksne murine blære epitel er kombineret med embryonale urogenital sinus mesenchym (UGM) og xenotransplanteret under nyrekapslen af hanmus værter, vævet udvikler sig til strukturer, der ligner prostata acini ^11. Norman et al. (1986) viste, at voksne mus prostata duktalt epitel og UGM, når de kombineres i væv rekombinanter, gennemgå duktalt vækst og forgrening morfogenese ^12. Hayward et al. (1988) viste, at human prostata epithel reagerer på induktiv føtal mesenchyme på lignende måde ^13. En hormonal model af carcinogenese i prostata ved at kombinere immortaliseret human prostata epitelcellelinie BPH 1 med UGM blev først rapporteret af ¹⁴ Wang et al. (2001) og har været anvendt i udstrakt grad i vores laboratorium ^15. Denne model er velegnet til at forstå PRCA progression fordi benign prostata epitel forvandler til metastatisk sygdom, modellering fremskreden PRCA hos mennesker ^5. Fordi specifikke komponenter kan være genetisk manipuleret, celle rekombinant podning er især nyttig som en tilgang til at evaluere stroma-epitelial interaktioner.

Andre steder er egnede til xenografting er intradermal, subkutan og ortotopisk placeringer ^16. Afhængigt af vævet og sygdomsprocessen af ​​interesse, kan disse være egnede alternative tilgange. Til undersøgelse af prostata hormonal carcinogenese og godartet vækstregulering, vælger vi nyrekapslensite for xenografting på grund af sin højere graft tage sats, rigelige blodforsyning, og evne til at implantere et større antal implanteret i en begrænset sted ^16.. Desuden hormonmanipulation af værtens mus, der resulterer i atrofi af prostata begrænser brugen af prostata orthotopisk transplantation ^16.

Denne protokol beskriver teknikker komprimeret hormon / lægemiddel pellet fremstilling og kirurgisk implantation samt nyrekapsel xenografting af human prostata celle-og vævstransplantater. Sammen disse teknikker giver et følsomt assay til bestemmelse af, om en genetisk modificeret mus er mere modtagelige for PRCA og / eller BPH initiering end kontrol stammer. Xenografting er en kraftfuld teknik til in vivo evaluering af potentialet af eksperimentelle celler til at udvikle histologiske og molekylære egenskaber af malignitet, samt et assay for nye behandlingsstrategier til en bred vifte af godartede og ondartede sygdomme.

Protocol

1.. Udarbejdelse af komprimeret Hormone / Drug Pellet

1. Denne procedure bør ske i en kemikaliesikkerhedsrapport hætte, mens iført en laboratoriekittel, handsker, maske, beskyttelsesbriller og motorhjelm. For at undgå krydskontaminering, er det afgørende, at pillen gør udstyr er grundigt rengjort med 70% ethanol før og efter fremstillingen af ​​hver type pellet.
2. Ved hjælp af en analytisk skala og vejer papir, måle ønskede mængde hormon / medicin pulver. Ca. 5% ekstra materiale anbefales at rumme tab under presningen.
3. Nogle hormoner / stoffer kræver et bindemiddel eller fyldstof, som er blandet forud for at pelletere fremstillingen. For eksempel for at fremstille en 2,5 mg pellet af 17β-østradiol, kombinere hormon med 22,5 mg kolesterol, hvilket resulterer i en 25 mg pellet.
4. Overføre forsigtigt ind i die sæt, sted under pressen og skub håndtaget godt ned for at komprimere pellet. Brug konsekvent pres for at opretholde en konstant overflade eret volumen forholdet.
5. Næste vende matriceholderen og skubbe håndtaget ned igen for at frigøre pillen.
6. Efterse pille for integritet og afgøre, om den endelige masse ligger inden for det ønskede område. Et acceptabelt interval er en forskel ± 5% i den endelige masse (for eksempel et acceptabelt interval for en 25 mg pellet 23,8-26,3 mg).
7. Pellets kan gøres forud for operationen og lagret (betingelser og varigheden af ​​lagringen afhænger af stabiliteten af ​​hormon eller stof, der anvendes i tabletform fremstilling). Hormon piller kan købes som et alternativ til pelletering af fremstillingen. Køber pellets undgår anvendelsen af ​​ikke-farmaceutisk kvalitet medicin, da de vil blive formuleret og forværres.

2. Udarbejdelse af Cell Rekombinante xenotransplantater

1. Høst og kultur primær mus urogenital mesenchyme (UGM) stromaceller i mindre end 4 uger før det indsamles til tælling.
2. Kultur udødeliggjort prostata epitelial cellelinjer på sædvanlig fashion og indsamle til tælling. I dette eksempel forberede celle rekombinante transplantater ved at blande 100.000 BPH-1 epitelceller pr graft 250.000 UGM stromaceller pr transplantat i suspension.
3. Pellet celler sammen og re-suspendere i nok neutraliseret type 1 rotte hale kollagen til at gøre det ønskede antal grafts, hver i et volumen på 25 ul til 50 pl.
4. Indstil rekombinante transplantater ved 37 ° C i 15 minutter og derefter dække med vækstmedium til opbevaring ved 37 ° C i op til 48 timer før podning.

3. Udarbejdelse af Tissue xenotransplantater

1. Bevar universelle sikkerhedsforanstaltninger for blodbårne patogener under vævsudtagning og kirurgisk procedure. Efter Institutional Review Board godkendelse og informeret samtykke, få frisk prostata væv fra kirurgisk resektion. For studier af BPH vækst, kan væv høstes fra transuretral prostata eller simple prostatektomi procedurer. Primære implanteret af PRCA eller godartet prostspiste væv kan opnås fra radikal prostatektomi prøver.
2. Opbevares høstede væv i isotoniske buffered celle medier eller saltvand på is. Afhængig af de vævs-og opbevaringsforhold, kan prøverne opbevares i op 24 timer før tilberedning af vævstransplantater. Almindelig praksis er at opdele prøven i tre stykker, med en sektion fikseret i formalin og rutinemæssigt behandlet til histologi, snap et stykke frosset til molekylær analyse og ét stykke yderligere opdeles i væv implanteret (1-3 mm i størrelse).

4.. Udarbejdelse af Fire Poleret glaspipette

1. Bære øjenværn, laboratoriekittel og varmebestandige handsker, sted glas Pasteur pipette spids ind bunsenbrænder flamme på ca en 60 ° vinkel til at starte.
2. Holde en konstant, lille bevægelse til pipetten for at undgå hot spots.
3. Tegn spidsen tyndt og brand-polish med det mål at blive en let buet ende med en afrundet, lukket spids.
5.. Udarbejdelse af Instrumenter og Kirurgisk Suite
1. Autoklavér alle instrumenter. Før operation, inspicere alle instrumenter, der tager sig at opretholde sterile område.
2. Opsæt sterile kirurgiske område med absorberende puder, dissektion omfang, anæstesi næse kegle, kirurgiske instrumenter og varmelampe rettet mod arbejdsområdet. At sterilisere værktøjer mellem mus, forvarm perle sterilisator.
3. Saml og apparater test anæstesi, vejer gas ådselæder.
4. Brug af mikroovn, varme voks pads i op til 5 minutter (i intervaller på 1 min, æltning voks pad for at kombinere smeltet og smeltet voks) på 70-80% effekt, indtil alt vokset jævnt smeltet. Ved berøring, sikre puden ikke er for varmt og sted, under den tomme gnaver opsving bur.
5. Don personlige værnemidler til gnaver kirurgiske procedurer, herunder kirurgisk maske, motorhjelm, handsker og kjole.

6.. Kirurgisk procedure: Renal Capsule Xenografting

1. Alle procedurer, der involverer forsøgsdyr bør udføres med godkendelse af institutionel dyr pleje og brug udvalg. Før induktion af anæstesi, observere musen til at sikre sundhed og trivsel.
2. Placer musen ind kammer til induktion af isofluran anæstesi på 3-5%. Når dyret har stoppet flytte og respirationsfrekvens er faldet, overførsel til næse kegle i bugleje, og opretholde anæstesi på 1-3%.
3. Hvis det er nødvendigt, bruge neglesaks til at barbere bagsiden af ​​musen. Dette er ikke nødvendigt, når der anvendes athymiske nøgne (nu / nu) mus.
4. Påfør fast tryk til gjorden af ​​den udvidede bagben for at evaluere tilstrækkeligheden af ​​anæstesi. Hvis musen reagerer på tryk, mere nødvendige tid til bedøvelse for at træde i kraft. Hvis det er nødvendigt, justeres anæstesi flow lidt for at opnå tilstrækkelig anæstesi.
5. Når musen er tilstrækkeligt bedøvet, desinficere operationsstedet med kirurgisk jod (Betadine) opløsning efterfulgt af70% alkohol.
6. Don sterile handsker og kjole, anvende sterile forhæng til operationsstedet. Løft rygskindet med et par fortandede pincet, og ved hjælp af de grove saks gøre en 2-3 cm dorsal midtlinjeincision.
7. Ved stump saks eller en probe, adskille de underliggende dermis fra kroppen væg (på begge sider af snittet til bilateral podning eller på den ene side til ensidig podning).
8. Flyt musen ind sideleje, og identificere placeringen af ​​nyren ved at se renal profil gennem musklen væg. Anvendelse blid manuel pres med tommel-og pegefinger på maven, kan hjælpe med at visualisere indre organer.
9. Brug fine iris saks, og sørger for at undgå større fartøjer og spinal nerver, lave en 1 cm snit i kroppen væg parallelt med rygsøjlen. Udvide dette snit til 1,5-2,0 cm (lidt længere end den lange akse af nyre) ved forsigtigt at åbne saksen bredere efter at placere dem i den indledende snit.
10. Eksteriorisere nyren ved at anvende et let tryk uden musklen væg på hver side af nyren ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren. Tuck huden kanter under eksterioriseret nyre, som vil hvile på kropsvæggen. Mens nyrerne er blotlagt, vedligeholde hydratisering af den renale kapsel ved anvendelse af sterilt saltvand.
11. Brug fine # 5 pincet forsigtigt løfte nyre kapsel fra parenkym i nyrerne og med en fin skalpel en 2 -4 mm snit i kapslen. Størrelsen af ​​snittet bestemmes af størrelsen af ​​implantatet, men bør minimeres for at opretholde integriteten af ​​kapslen.
12. Manipulere en glas Pasteur-pipette, der er udarbejdet tynd og brand-poleret med en afrundet lukket ende under kapslen, der tangerer overfladen af ​​nyren. Forsigtigt åbne en lille kapsel lomme til de podninger, ved hjælp af stor omhu for ikke at beskadige nyrerne parenkym.
13. Snittet kant nyre kapsel løftes med de fine pincet og graft ir indsat i lommen under kapslen ved hjælp af flammepoleret glaspipette. Flere grafts kan placeres under nyrekapslen og jævnt fordelt på nyrerne overflade.
14. Hvis under podning, bliver dehydreret kapslen, bør det fugtes ved anvendelse af sterilt saltvand.
15. Når podning er fuldstændig, forsigtigt løfte siderne af musklen væg indsnit at erstatte nyre tilbage i kropskaviteten. Bemærk at transplantaterne ikke glider ud under kapslen.
16. Luk musklen væggen med en enkelt sutur (4-0, FS-2 vicryl sutur). Den kirurgiske procedure kan gentages på den kontralaterale nyre ved at flytte musen.
17. Når podning er færdig, kan musen gennemgå subkutan pille implantation under samme kirurgiske indgreb (se protokollen trin 7).
18. Brug tandede pincet, justere huden snitkanter og anvende 2-3 kirurgiske sårklemmer at lukke snittet. Indgiv analgesi (vi bruger 5-10 mg / kg carprofda bruge en subkutan injektion) og placere musen i den laterale liggende stilling i aflåst bur. Sikre vedligeholdelse af kropstemperaturen med varme fra en lampe eller varmepude. Der observeres for fuld tilbagebetaling af musen, som bør forekomme i mindre end 15 minutter.
19. Mus skal observeres for den næste 24 timer for tegn på postoperative smerter, blødning og / eller andre komplikationer. Regelmæssigt inspicere kirurgisk snit for tegn på infektion.
20. Fjern sårklemmer med operationssår klip fjernelse enhed 7-14 dage efter operationen.

7.. Kirurgisk procedure: Subkutan Pellet Implantation

1. Gentag trin 6,1-6,5 fra nyrekapsel xenografting kirurgisk procedure.
2. Løft rygskindet med et par hud pincet, og ved hjælp af de grove saks gøre en 1-2 cm dorsal midtlinjeincision.
3. Ved stump saks eller en probe, adskille de underliggende dermis fra kroppen væg i et kraniel retning.
4. Brug af hud pincet,forsigtigt løfte kranie aspekt af huden indsnit, og holde det hormon pellet forsigtigt med lige, takkede pincet, indsætte pillen og slip på nakkeskindet, i lommen, du har oprettet med den stump sonde.
5. Gentag trin 6,18-6,20 fra nyrekapsel xenografting kirurgisk procedure. Hvis der udføres subkutan pille implantation kun bruge 1 kirurgiske sår klip for at lukke kirurgisk snit.

Representative Results

Afhængigt af den hypotese, der skal testes, kan nyrekapsel xenografting af vævs-eller celle-rekombinanter udføres i isolation eller i kombination med subkutan hormon pellet implantation. En skematisk afbildning af et hypotetisk eksperiment kombinerer nyrekapsel xenografting eksperimentere med subkutan hormon pellet implantation er illustreret i figur 1. En række pulverformige og / eller krystallinske stoffer kan anvendes til fremstilling af komprimerede pellets med pillepressen. Figur 2 viser 25 mg, 12 mg og 6 mg komprimerede hormon pellets.

Figur 3 viser et eksempel på flammepoleret glaspipette anvendes under det kirurgiske indgreb. Flere gennemløb af en glas Pasteur-pipette gennem bunsenbrænder flamme resultere i brand-poleret, afrundet spids, der bruges til at skabe en lomme til transplantater under nyrekapslen og manipulere transplantater under nyrekapslen.

ntent "> Som vist i figur 4, primære væv xenotransplantater fra patienter med BPH, suppleret med exogent testosteron (25 mg subkutan pellet) for at simulere den mandlige humane hormonale miljø, overleve og vævsarkitekturen bevares (figur 4A). Også vist i Figur 4 kan nyrekapsel podning anvendes til at evaluere hormonal carcinogenese. Cell rekombinanter indeholdende benign prostata epitel (BPH-1) og induktiv urogenital mesenkym (UGM) dyrket i ubehandlede mus danne godartede svulster (figur 4B). Samme graft, der dyrkes i en vært, der fik subkutane hormon piller på 25 mg T og 2,5 mg E ₂ i fire måneder, udvikler sig til prostata carcinom, der invaderer nyrekapslen (figur 4C) ^5,14.

upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk af nyrekapsel xenografting og pellet implantation procedure. Renal kapsel xenografting udføres via en dorsal midterlinjen tilgang. I samme kirurgiske procedure, er musen kirurgisk implanteret med langsom frigivelse subkutan komprimeret hormon og / eller narkotika-pellets i nakken lurvet region.

Figur 2. Eksempler på komprimerede hormon piller fremstillet med den nuværende protokol. A. 12 mg pellet. B. 6 mg pellet. C. 25 mg pellet.

Figur 3. Flammepoleret glas Pasteur-pipette. Den færdige pipette er buet, med en glat afrundet spids egnet til at skabe en pocket til xenotransplantat under nyrekapslen. Pipetten også bruges til at manipulere transplantatet under nyrekapslen.

Figur 4.. Eksempel renale kapsel xenotransplantater. A. Tissue xenotransplantater (pilespidser) af human BPH væv dyrkes i en måned under nyrekapslen af en nøgen hanmus. Musen vært er suppleret med 25 mg testosteron pillen simulere hormonale miljø af den menneskelige han. B. Cell rekombinante xenotransplantater (pilespidser) indeholdende humant prostata epithelial cellelinie (BPH-1) og induktiv urogenital mesenkym (UGM) dyrket under de renale kapsel af en nøgen mus, der ikke var implanteret med en subkutan hormon pellet i fire måneder. C. Cell rekombinant xenograft indeholdende BPH-1 og UGM, dyrket under nyrekapslen af en nøgen mus, der også undergik subkutan pellet implantation af 25 mg testosteron og 2,5 mg 17β-østradiol i fire måneder.

Discussion

Dette papir og protokollen beskrevet heri beskriver fremstillingen af ​​komprimerede hormon og / eller narkotika-pellets og den kirurgiske procedure til subkutan pellet implantation af mus. Afhængig af forskning spørgsmål, der skal behandles, kan denne teknik udføres enkeltvis eller i kombination med nedsat kapsel xenografting af prostata celle rekombinante podninger eller prostata væv implanteret, som er teknikker almindeligt anvendt i prostata forskning ^17-19. Tilsammen disse teknikker tilbyder en kraftfuld metode til at studere hormonal carcinogenese og regulering af godartet vækst i mennesker og mus prostata.

Pellet fremstillingen er enkel at udføre, let at reproducere og kræver begrænset udstyr. Det kan anvendes til forskellige hormoner og narkotika præparater. Det er vigtigt at udføre denne teknik i en kemikaliesikkerhedsrapport hætte, og bære passende personlige værnemidler. Til forsøg vurderer prostata carcinogenese ennd induktion af murin blæreafløbshindring vi bruger 25 mg T og 2,5 mg E ₂ ^5,7,15. Disse doser er valgt, fordi de producerer det ønskede in vivo respons, og fordi de skaber serum hormon niveauer, der er fysiologisk relevant for menneskelige mænd med sygdommen processen med interesse ^6. Pellet forme tillade flere forskellige størrelser af piller, der skal fremstilles, vi bruger typisk 25 mg piller til evaluering karcinogenese og godartet vækst. Valg af pillestørrelse afhænger hypotese, der skal behandles, såvel som fremstilling af en ønsket virkning, produktion af ønskede cirkulerende niveauer og varigheden af ​​forsøget. Hvis lægemiddel eller hormon er kombineret med et bindemiddel (såsom kolesterol) anbefaler vi en homogen blanding af hormonet og bindemiddel.

Afhængigt af forsøget kan subkutan pellet implantation udføres følgende kastration af den mandlige vært ^15. Det er vores erfaring,implantation af 25 mg T forårsager feedback inhibering af hypothalamus-hypofyse-testikel akse, inhibering af endogen sekretion. Derfor vælger vi at sammenligne mus behandlet med 25 mg T for at simulere androgen miljø af den menneskelige mandlige intakte, men ubehandlede mænd, med endogent T-sekretion opretholdes. Vi har ikke rutinemæssigt anvende en kastrere vært på grund af atrofisk reaktion af prostata og prostata implanteret til tilbagetrækning androgen.

Denne protokol beskriver også oprettelsen af ​​et stykke specialudstyr til nyrekapsel xenografting, brand-poleret glas Pasteur pipette. Dette kan nemt udføres med udstyr til stede i de fleste laboratorier, hvilket resulterer i en tilpasset kirurgisk instrument kan fremstilles og steriliseres før brug i den kirurgiske procedure end. Iført personlige værnemidler er vigtigt at sikre personalets sikkerhed, når du opretter flammepoleret glas pipette.

Før embarking på nogen af ​​de kirurgiske procedurer, der er skitseret i denne protokol, skal alle teknikker gennemgås og godkendes af den institutionelle Dyrepleje og brug udvalg. Kirurgiske procedurer udføres i gnavere kræver uddannelse og praksis i både de tekniske aspekter af proceduren, samt de principper og praksis af aseptisk teknik. For en introduktion til udstyr og teknikker vigtigt i disse procedurer anbefaler vi personale se videoen manuskriptet nylig rapporteret af Prichett-Corning et al. (2011) ^20. Vi anbefaler også alle medarbejdere modtage hands-on træning i gnaver kirurgiske procedurer og aseptisk teknik.

I vores laboratorium, er disse procedurer typisk udføres med to ansatte. Den kirurgiske assistent administrerer anæstesi, bemærker dyr under opsving, hjælper kirurgen med ikke-sterile aspekter af proceduren og dokumenterer alle procedurer. Kirurgen fastholder det sterile område, administrerer analgesi ennd udfører kirurgiske procedurer, der er skitseret i denne protokol. Med korrekt planlægning og uddannelse, den kirurgiske procedure af subkutan hormon pille implantation er enkel og let at udføre.

Der er flere eksperimentelle design overvejelser for celle rekombinant xenografting. Som med enhver eksperimenter udnytte udødeliggjort cellelinjer, forurening er vigtigt at minimere og opdage. For forsøg med BPH-1-cellelinjer, anbefaler vi et lavt passage nummer (mindre end 25). For at kontrollere for effekten af ​​stroma, vi udnytter podninger, der kun indeholder BPH-1-celler for en nyre og podninger indeholder BPH-1 og UGM på den kontralaterale nyre. Til forsøg designet til at løse hormonal carcinogenese, vi typisk har en ubehandlet kontrol tilstand (mus er ikke implanteret med en pille, eller er implanteret med en kolesterol pellet). Positive kontroller (vært mus implanteret med T + E ₂ piller) er lige så vigtige, når de evaluerer andre forhold that kan fremme carcinogenese med denne model system. Afhængig af forskning spørgsmål, der skal behandles, kan varigheden af ​​pellet implantation og / eller xenograft vækst spænder fra flere uger til fire måneder, til forsøg planlagt at overstige fire måneder, anbefaler vi ekstra pille implantation at opretholde eksogene hormon niveauer. For forsøg med benign prostata væv implanteret, er det vigtigt at bære personlige værnemidler og vedligeholde universelle sikkerhedsforanstaltninger for blodbårne patogener. Frisk høstet væv kan opbevares, inden det xenografting for 12-72 timer.

Den kirurgiske teknik til nyrekapsel xenografting kræver planlægning, praksis og nogle håndelag. Minimering af varigheden af ​​den kirurgiske procedure, at opretholde legemstemperatur og omhyggelig kirurgisk teknik kan afbøde perioperative dødelighed og kirurgiske komplikationer. Chancen for perioperativ død i vores erfaring stiger med varigheden af ​​surgical procedure, derfor vi begrænser det kirurgiske indgreb ikke længere end 20-25 min. Anvendelse af en varmelampe og varmes voks pad under operationen og nyttiggørelse er ideel til at opretholde kroppens temperatur. Rutinemæssig postoperativ pleje er et andet vigtigt aspekt af succesen af ​​denne teknik. Mus skal overholdes under anæstesi opsving, og dagen efter operationen for tegn på smerte og lidelse. Indgiv passende analgetika for at minimere post-processuelle smerte og lidelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pellet press	PARR Industries	2815	3mm Punch & Die set
Analytical Balance	Ohaus	1918302	Voyager or other
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-962Q
Dissecting microscope	Leica	L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)	Braintree Scientific	39DP	Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer	F.S.T.	18000-45
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
Induction Chamber	Supera Anesthesia Innov	RES644
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Innov	ACC526
Sterile surgical gown	Midwest Vet Supply	350.79866.2
Surgical mask	Midwest Vet Supply	350.50111.2	2-ply w/ earloops
Sterile gauze	Midwest Vet Supply	001.14100.2	2 x 2 inches
Sterile Gloves	Kimberly Clark	55092
Bouffant	Midwest Vet Supply	001.27100.2
Cotton Tip Applicator	Midwest Vet Supply	001.06220.2
Surgical Scrub Wash	Midwest Vet Supply	733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated)	General Econopak, Inc	88VCSTF
REAGENTS
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-3292
Testosterone Proprionate	Sigma-Aldrich	T-1875
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E-2758
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Carprofen	Midwest Vet Supply	193.70200.3	Injectable (Rimadyl)
Betadine	Webster Veterinary	07-836-3379
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T.)	14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)	F.S.T.	11055-10
Fine Iris scissors	F.S.T.	14090-09
Graefe Scalpel	F.S.T.	10071-12
Dumont #5 forceps	F.S.T.	11251-20
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	S67050	5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved)	F.S.T.	11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Vicryl Suture	Midwest Vet Supply	295-92100.2	4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action	F.S.T.	12002012
Wound Clips	Braintree Scientific	ACS CS	May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper	F.S.T.	12031-09	Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover	F.S.T.	12033-00	Universal
Sterilization Container	F.S.T.	20810-01	Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle	BD	148292C	1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator	National Band Tag Co.	1005s1	Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags	National Band Tag Co.	1005-1