Summary
Wir beschreiben die Herstellung von Druckhormonpellets sowie subkutane chirurgischen Implantation in Mäuse. Diese Strategie kann mit dem Wachstum von Zellen und Geweben Xenotransplantate unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen ohne Thymus hormonelle Regulation der Karzinogenese und der gutartigen Prostatawachstum zu beurteilen kombiniert werden.
Abstract
Neue Therapien für zwei gemeinsame Prostataerkrankungen, Prostata-Krebs (PRCA) und gutartige Prostata-Hyperplasie (BPH), hängen entscheidend von der Bewertung ihrer Experimente hormonellen Regulation. Sex Steroidhormone (vor allem Androgene und Östrogene) sind wichtig, PRCA und BPH, wir sondieren ihre jeweilige Rolle bei der Induktion Wachstum der Prostata und Krebsentstehung bei Mäusen mit Experimenten mit Druckhormon Pellets. Hormon-und / oder Drogen-Pellets sind leicht mit einer Pelletpresse hergestellt und operativ in das subkutane Gewebe der männlichen Maus Wirt implantiert. Wir beschreiben auch ein Protokoll für die Bewertung der hormonellen Karzinogenese durch Kombinieren subkutane Implantation Hormon Pellet mit xenografting Prostatazell Rekombinanten unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen. Darüber hinaus subkutane Implantation Hormon Pellet, in Kombination mit Nierenkapsel xenografting der BPH Gewebe, ist nützlich, um die hormonelle Regulation der gutartigen prost besser zu verstehenaß Wachstum und neue Therapien, die auf Sexualsteroidhormon Wege zu testen.
Introduction
Prostatakrebs (PRCA) und gutartige Prostata-Hyperplasie (BPH) sind erhebliche gesundheitliche Belastungen. PRCA ist die zweithäufigste Organkrebserkrankung bei Männern und eine der häufigsten Ursachen bei Krebserkrankungen ein. BPH ist auch sehr weit verbreitet unter älteren Männern, und es wird geschätzt, dass die klinische Manifestation der BPH, Symptome der unteren Harnwege (LUTS), wird von 50 bis 90% der Männer, 2 beeinflussen. Während Androgene und Östrogene bekannt, in PRCA BPH und wichtig zu sein, unser Verständnis der hormonellen Mechanismen, die Krebsentstehung und das Wachstum zugrunde liegen, ist noch unvollständig 3,4. Einfach und genetisch manipulierbaren Tiermodellen untermauern die Studien, die diese Prioritäten in Prostata-Forschung adressieren. In hormonabhängigen Krankheiten wie PRCA und BPH, die Verwendung von subkutanen, langsame Freisetzung Hormon Pellets, isoliert oder in Kombination mit Nierenkapsel xenografting (die Übertragung von Zellen, Geweben oder Organen von einer Spezies in eine andere) in die immunocompromised Mäusewirt, ein einfaches und reproduzierbares Verfahren zur Untersuchung der hormonellen Regulation des Wachstums und der Krebsentstehung.
Die subkutane Implantation Hormon Pellet ist eine einfache und reproduzierbare Technik zur hormonellen Regulation der Krebsentstehung und gutartige Wachstum in der Prostata 5 zu studieren. Subkutane Implantation von erwachsenen männlichen Mäusen, die mit 25 mg Testosteron (T) und 2,5 mg 17β-Estradiol (E 2), bewirkt eine Erhöhung der Serum-E 2 und allmählichen Abnahme der T, wieder die dynamische hormonelle Milieu der alternden Männern 5,6. Zudem rekapituliert dieses Modell viele der klinischen Merkmale der BPH-LUTS 5,7. Alternative Methoden der Hormongabe orale / Magensonde Verwaltung oder intraperitoneale Injektion, die Leiden verursachen, um den Nager sind weniger konsequent bei der Bereitstellung der gleichen Menge der Droge im Laufe der Zeit, und sind arbeitsintensiver als eine einmalige chirurgische Implantation. Andere Modi für subkutane hormone und / oder Medikamentenabgabe sind Silastic Kapseln 8. Zwar haben wir auch Erfahrung mit der Nutzung der Silastic Kapseln, werden komprimiert Pellets für ihre Benutzerfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit begünstigt. Außerdem Freisetzungsraten von Druckhormon Pellets besser imitieren die bei alternden Männern 5,7 beobachtet dynamische Sexualsteroidhormonverhältnisse.
Seit der Entwicklung von genetisch immungeschwächten Mäusen wurden zahlreiche in-vivo-Modellsysteme, die xenografting Techniken für die Untersuchung einer Vielzahl von normalen und erkrankten Geweben entwickelt worden. Es gibt einige grundlegende Kategorien von xenografting. Gewebe Xenotransplantate bestehen aus einem kleinen Stück von intaktem Gewebe, das eine normale Struktur, bösartiger Tumor, oder gutartige Wachstum sein kann. Szot et al. (2007) haben vor kurzem beleuchtet Nierenkapsel xenografting der Langerhans-Inseln 9. Aamdal et al. (1985) beschrieben Nierenkapsel xenografting von 27 menschlichen Tumorzelllinien in immunocompromised Maus beherbergt 10. Grafts kann auch aus einem einzigen immortalisierten Zelllinie (Krebs oder nicht-tumor) bestehen, oder aus einer immortalisierten Zelllinie kombiniert mit Zellen aus Mesenchym (Zelltransplantat rekombinanten) isoliert bestehen.
Wir bevorzugen xenografting von Zell Rekombinanten, die jeweiligen Rollen von Stroma und Epithel in der Entwicklung von PRCA und BPH zu sondieren. Cunha et al. (1980) war der erste, zu berichten, dass bei erwachsenen Mäuse-Blase Epithel mit embryonalen Urogenitalsinus Mesenchym (UGM) und xenografted unter die Nierenkapsel des männlichen Mäusen Gastgeber kombiniert, entwickelt das Gewebe in die Strukturen ähnlich Prostata acini 11. Norman et al. (1986) zeigten, dass erwachsenen Maus Prostata-duktalen Epithel und UGM, wenn im Gewebe Rekombinanten kombiniert, unterziehen duktalen Wachstum und Verzweigung Morphogenese 12. Hayward et al. (1988) zeigte, dass die menschliche Prostata-Epithel reagiert auf fetale m induktivesenchyme in ähnlicher Weise 13. Ein hormonelles Modell der Karzinogenese in der Prostata, indem die immortalisierte humane epitheliale Prostatazelllinie BPH-1 mit AWS, wurde zuerst von 14 (2001), Wang et al. Berichtet und wurde ausführlich in unserem Labor 15 verwendet. Dieses Modell ist für das Verständnis PRCA Progression gut geeignet, da die gutartigen Prostata-Epithel verwandelt, um Metastasen, erweiterte Modellierung PRCA bei Menschen 5. Da die spezifischen Komponenten können genetisch manipuliert werden, ist die Zelltransplantation rekombinanten besonders nützlich als ein Ansatz zur Stroma-Epithel-Wechselwirkungen zu beurteilen.
Andere Websites sind für xenografting intradermale, subkutane und orthotopen 16 Standorten. Je nach Gewebe und Krankheitsverlauf von Interesse sind, können diese geeignete alternative Ansätze. Für die Studie von Prostata-Krebsentstehung und gutartige hormonelle Wachstumsregulation, wählen wir die NierenkapselStandort für xenografting aufgrund seiner höheren Graft nehmen Rate, reichlich Blutversorgung und die Fähigkeit, eine größere Anzahl von Fremdtransplantaten in einem geschlossenen Ort 16 implantieren. Außerdem hormonelle Manipulation der Wirtsmaus, die in Prostataatrophie Ergebnisse beschränkt die Verwendung von Prostata-orthotope Transplantation 16.
Dieses Protokoll beschreibt Techniken der Druck Hormon / Arzneimittelpelletherstellung und chirurgische Implantation sowie Nierenkapsel xenografting der menschlichen Prostata Zell-und Gewebetransplantaten. Zusammen bilden diese Techniken bieten eine empfindliche Assays zu bestimmen, ob eine gentechnisch veränderte Maus ist anfälliger für PRCA und / oder BPH Initiierung als Kontrollstämme. Xenografting ist eine leistungsfähige Technik für die in vivo-Bewertung des Potentials der experimentellen Zellen histologischen und molekularen Eigenschaften von malignen Erkrankungen zu entwickeln, sowie ein Assay für neue Behandlungsstrategien für eine Vielzahl von gutartigen und bösartigen Erkrankungen.
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Protocol
1. Aufbereitung von Druck Hormone / Drug Pellet
- Dieses Verfahren sollte in einem Stoffsicherheitsabzug erfolgen, während das Tragen eines Labormantel, Handschuhe, Maske, Schutzbrille und Haube. Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, ist es entscheidend, dass die Pelletherstellung Ausrüstung wird gründlich mit 70% igem Ethanol vor und nach der Herstellung jeder Art von Pellet gereinigt.
- Mit Hilfe eines analytischen Maßstab und wiegen Papier, messen gewünschte Menge des Hormons / Drogenpulver. Etwa 5% Extra-Material wird empfohlen, um den Verlust beim Pressen zubringen.
- Einige Hormone / Medikamente erfordern ein Bindemittel oder Füllstoffe, die vor der Herstellung Pellet vermischt wird. Zum Beispiel, um eine 2,5 mg Tablette aus 17β-Östradiol herzustellen, verbinden das Hormon mit 22,5 mg Cholesterin, das in einer 25 mg Tablette führt.
- Vorsichtig in Werkzeugsatz, Ort übertragen unter der Presse und schieben Hebel fest nach unten, um Pellets zu komprimieren. Verwenden Sie den Druck konstant zu halten sind konstante Oberflächenein Volumenverhältnis.
- Die Stempelhalter Next umzukehren und drücken Sie den Hebel wieder nach unten, um das Pellet zu lösen.
- Überprüfen Pellet für Integrität und festzustellen, ob endgültige Masse innerhalb gewünschten Bereich. Ein akzeptabler Bereich ist ± 5% Unterschied in der endgültigen Masse (beispielsweise ein akzeptabler Bereich für eine 25 mg Tablette ist von 23,8 bis 26,3 mg).
- Pellets können vor der Operation gemacht und gespeichert (Bedingungen und die Dauer der Speicherung hängt von der Stabilität des Arzneimittels oder Hormons in Pelletherstellung verwendet) werden. Hormon Pellets können als Alternative zur Herstellung pelle erworben werden. Einkauf Pellets vermeidet die Verwendung von nicht-pharmazeutischer Qualität Medikamente, da sie formuliert und zusammengesetzt werden.
2. Herstellung von Zell Rekombinante Xenografts
- Ernte und Kultur primären Maus urogenitalen Mesenchym (UGM) Stromazellen für weniger als 4 Wochen vor dem für die Zählung gesammelt.
- Kultur immortalisierten epithelialen Prostatazelllinien in der üblichen ModeIonen und sammeln für die Zählung. Für dieses Beispiel vorzubereiten rekombinante Zelltransplantate durch Mischen von 100.000 BPH-1-Epithel-Zellen pro Transplantat mit 250.000 UGM Stromazellen pro Graft in Suspension.
- Pellet-Zellen zusammen und resuspendieren in genügend neutralisiert Typ 1 Rattenschwanzkollagen, um die gewünschte Anzahl von Transplantaten, die jeweils in einem Volumen von 25 &mgr; l bis 50 &mgr; l zu machen.
- Eingestellt rekombinanten Transplantate bei 37 ° C für 15 Minuten und dann die Abdeckung mit Wachstumsmedium für die Lagerung bei 37 ° C für bis zu 48 Stunden vor der Transplantation.
3. Herstellung von Seiden Xenografts
- Pflegen universellen Vorsichtsmaßnahmen für durch Blut übertragbaren Krankheitserregern während der Gewebebeschaffung und chirurgischen Eingriff. Nach Institutional Review Board Genehmigung und Einwilligung, erhalten frische Prostatagewebe aus chirurgischen Resektion. Für Untersuchungen der Wachstums BPH kann Gewebe von transurethrale Resektion der Prostata oder einfach Prostatektomie geerntet werden. Primäre Xenografts von PRCA oder gutartige prostaß Gewebe kann von radikalen Prostatektomie Proben gewonnen werden.
- Shop gewonnene Gewebe in isotonischer gepufferten Zellmedium oder physiologischer Kochsalzlösung auf Eis. Abhängig von den Gewebe-und Lagerbedingungen können die Proben für 24 Stunden vor der Herstellung der Gewebetransplantate gespeichert werden. Gängige Praxis ist es, die Probe in drei Stücke teilen, mit einem Abschnitt in Formalin fixiert und routinemäßig für die Histologie verarbeitet, Rast einem Stück für die molekulare Analyse eingefroren und ein Stück weiter in das Gewebe Xenografts (1-3 mm groß) eingeteilt.
4. Herstellung von Feuerpolierte Glaspipetten
- Das Tragen von Schutzbrille, Laborkittel und hitzebeständige Handschuhe, Ort Pasteur-Glaspipettenspitze in Bunsenbrenner-Flamme bei ca. 60 °-Winkel zu starten.
- Halten Sie eine konstante, leichte Bewegung auf die Pipette, um Hotspots zu vermeiden.
- Zeichnen Sie die Spitze dünn und Feuerpolitur mit dem Ziel, eine leicht gebogene Ende mit einem abgerundeten, geschlossenen Spitze. 5. Vorbereitung der Instrumente und OP-Suite
- Autoklav alle Instrumente. Vor der Operation, kontrollieren alle Instrumente, wobei darauf zu sterilen Bereich zu halten.
- Bis sterilen OP-Bereich mit saugfähigen Kissen, Dissektion Umfang, Anästhesie Nasenkegel, chirurgische Instrumente und zum Arbeitsbereich gerichtet Wärmelampe ein. Um Werkzeuge zwischen Mäusen, vorgewärmte Perle Sterilisator sterilisieren.
- Bauen und Testnarkosegerät; wiegen Gasfänger.
- Mit den Mikrowellen-, Wärme-Wachs-Pads für bis zu 5 min (in 1 min-Schritten, Kneten des Wachs-Pad, um geschmolzen und nicht geschmolzenen Wachs kombinieren) bei 70-80% der Leistung, bis alle das Wachs gleichmäßig geschmolzen. Durch Berührung, sicherzustellen, dass die Unterlage ist nicht zu heiß und Platz unter dem leeren Käfig Nager Erholung.
- Don persönliche Schutzausrüstung für Nager chirurgische Verfahren, einschließlich OP-Maske, Haube, Handschuhen und Kleid.
- Alle Verfahren, die Forschung Tiere sollten mit Zustimmung des institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüssen durchgeführt werden. Vor der Einleitung der Narkose, beachten Sie die Maus, um Gesundheit und Wohlbefinden zu gewährleisten.
- Platzieren Sie die Maus in die Kammer für die Induktion der Isofluran-Narkose bei 3-5%. Wenn das Tier sich nicht mehr bewegt und die Atemfrequenz verringert hat, Transfer zum Nasenkegel in der Bauchlage und Aufrechterhaltung einer Narkose bei 1-3%.
- Falls erforderlich, verwenden Knipser, die Rückseite der Maus zu rasieren. Dies ist nicht bei der Nutzung athymischer (nu / nu) Mäuse benötigt.
- Festem Druck auf den Gurt des erweiterten Hinterfuß Angemessenheit der Narkose zu evaluieren. Wenn die Maus reagiert auf Druck wird mehr Zeit für die Anästhesie wirksam wird benötigt. Wenn nötig, Anästhesie Fluss einstellen leicht auf eine adäquate Anästhesie zu erreichen.
- Wenn die Maus ausreichend betäubt Desinfektion des Operationsstelle mit chirurgischen Jod (Betadine)-Lösung, gefolgt von70% Alkohol.
- Don sterile Handschuhe und ein Kleid, gelten sterilen Tüchern zur Operationsstelle. Heben Sie die Rückenhaut mit einem Paar von Zahnzange und mit den groben Schere einen 2-3 cm dorsalen Mittellinienschnitt.
- Mit stumpfen Schere oder einer Sonde, trennen Sie die darunter liegenden Dermis von der Körperwand (auf beiden Seiten des Einschnitts für die bilaterale Pfropfen oder auf der einen Seite für die einseitige Transplantation).
- Positionieren Sie die Maus in Seitenlage, und ermitteln die Lage der Niere, indem Sie die Nieren Profil durch den Muskel Wand. Mit leichtem Handdruck mit dem Daumen und Zeigefinger auf dem Bauch kann mit Visualisierung inneren Organe zu unterstützen.
- Mit feinen Iris Schere, und kümmert sich um große Gefäße und Nerven der Wirbelsäule zu vermeiden, machen Sie einen 1 cm langer Schnitt in der Körperwand parallel zur Wirbelsäule. Widen diesen Einschnitt, um 1,5 bis 2,0 cm (etwas länger als der langen Achse der Niere) durch leichtes Öffnen der Schere weiter nach, indem sie in der ersten Einschnitt.
- Exteriorisieren die Niere durch leichten Druck außerhalb der Muskelwand auf beiden Seiten der Niere mit dem Zeigefinger und Daumen. Tuck die Haut Kanten unterhalb der exteriorisierten Niere, die auf der Körperwand ruhen wird. Während die Niere exteriorisiert, pflegen Hydratation der Nierenkapsel durch die Anwendung steriler Kochsalzlösung.
- Mit feinen Pinzette Nr. 5 heben die Nierenkapsel aus dem Parenchym der Niere und mit einem feinen Skalpell, machen Sie eine 2 -4 mm Schnitt in der Kapsel. Die Größe des Einschnitts wird durch die Größe des Transplantats bestimmt, sollte aber, um die Integrität der Kapsel zu halten, minimiert werden.
- Bearbeiten Sie ein Glas Pasteur-Pipette, die mit einem geschlossenen Ende abgerundet unter der Kapsel tangential zur Oberfläche der Niere dünn und feuerpolierte gezogen worden ist. Öffnen Sie vorsichtig eine kleine Kapsel Tasche für Transplantate mit großer Sorgfalt nicht, das Nierenparenchym beschädigen.
- Die Schnittkante der Nierenkapsel wird mit den feinen Pinzette angehoben und das Transplantat is unter der Kapsel mit der feuerpolierten Glaspipette in die Tasche eingesetzt. Mehrere Transplantate unter die Nierenkapsel platziert werden und gleichmäßig auf die Niere Oberfläche beabstandet.
- Wenn im Verlauf der Pfropfung wird entwässert die Kapsel sollte durch Anwendung steriler Kochsalzlösung befeuchtet werden.
- Beim Pfropfen abgeschlossen ist, heben Sie die Seiten der Muskelwand Einschnitt, um die Niere wieder in die Körperhöhle zu ersetzen. Beachten Sie, dass die Transplantate nicht aus unter der Kapsel rutschen.
- Schließen Sie die Muskelwand mit einer einzigen Naht (4-0, FS-2 Vicrylnaht). Der chirurgische Eingriff kann auf der kontralateralen Niere durch Neupositionierung der Maus wiederholt werden.
- Beim Pfropfen abgeschlossen ist, kann die Maus subkutane Implantation Pellet im gleichen chirurgischen Eingriff unterziehen (siehe Protokoll Schritt 7).
- Mit Zahnzangen, richten Sie die Hautschnitt Kanten und gelten 2-3 chirurgische Wundklammern, um den Einschnitt zu schließen. Verwalten Analgesie (wir verwenden 5-10 mg / kg carprofen mit einer subkutanen Injektion) und platzieren Sie die Maus in die Seitenlage in der Wiederherstellungs Käfig. Stellen Sie sicher, Aufrechterhaltung der Körpertemperatur mit Wärme aus einer Lampe oder einem Heizkissen. Beachten Sie zur vollständigen Wiederherstellung der Maus, die in weniger als 15 Minuten auftreten sollte.
- Mäuse sollte für die nächsten 24 Stunden auf Anzeichen von postoperativen Schmerzen beobachtet werden, Blutungen und / oder anderen Komplikationen. Kontrollieren Sie regelmäßig chirurgischen Schnitt für Anzeichen einer Infektion.
- Wundklammern entfernen mit chirurgischer Wundklammer Entnahmevorrichtung 7-14 Tage nach der Operation.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.5 von Nierenkapsel xenografting chirurgischen Eingriff.
- Heben Sie die Rückenhaut mit einem Paar von Hautzange und mit den groben Schere einen 1-2 cm dorsalen Mittellinienschnitt.
- Mit stumpfen Schere oder einer Sonde, trennen Sie die darunter liegenden Dermis von der Körperwand kranial.
- Mit Hautzangen,heben die Schädel Aspekt der Hautschnitt, und hält das Hormon Pellet vorsichtig mit geraden, gezahnten Pinzette, legen Sie die Pellet-und Release am Genick, in der Sie mit dem stumpfen Sonde erstellt Tasche.
- Wiederholen Sie die Schritte von 6,18-6,20 Nierenkapsel xenografting chirurgischen Eingriff. Bei Durchführung subkutane Implantation nur Pellet, verwenden Sie ein chirurgischer Wundklammer, um den chirurgischen Eingriff zu schließen.
6. Chirurgische Verfahren: Nierenkapsel Xenografting
7. Chirurgische Verfahren: Die subkutane Implantation Pellet
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Representative Results
Abhängig von der Hypothese getestet werden soll, kann die Nierenkapsel xenografting von Gewebe-oder Zell Rekombinanten isoliert oder in Kombination mit subkutaner Implantation Hormon Pellets durchgeführt werden. Eine schematische Darstellung eines hypothetischen Experiment kombiniert Nierenkapsel xenografting Experiment mit subkutanen Implantation Hormon Pellet wird in 1 dargestellt. Eine Vielzahl von pulverförmigen und / oder kristallinen Substanzen bei der Herstellung von Druck Pellets mit dem Pelletpresse verwendet werden. Fig. 2 zeigt 25 mg, 12 mg und 6 mg komprimiert Hormon Pellets.
Figur 3 zeigt ein Beispiel des feuerpolierten Glaspipette während der chirurgischen Prozedur verwendet. Mehrere Durchgänge einer Glaspasteurpipette durch Bunsenbrenner-Flamme zu einem Brand-poliert, abgerundete Spitze, die verwendet wird, um eine Tasche für Transplantate unter die Nierenkapsel zu schaffen und die Transplantate unter die Nierenkapsel zu manipulieren.
ntent "> Wie in Fig. 4 gezeigt, primärem Gewebe Xenotransplantate von Patienten mit BPH, mit exogenem Testosteron (25 mg subkutane Pellets), um den männlichen menschlichen hormonelle Milieu simuliert ergänzt, bestehen und die Gewebearchitektur bewahrt wird (4A). Ebenfalls gezeigt 4 kann Nierenkapsel Transplantation verwendet werden, um hormonelle Krebsentstehung zu bewerten. Zell Rekombinanten, die gutartige Prostata-Epithel (BPH-1) und induktiven urogenitalen Mesenchym (UGM) in unbehandelten Mäusen gewachsen bilden gutartige Wucherungen (4B). Gleiches Transplantat, in gewachsen ein Host, der subkutanen Hormon Pellets von 25 mg T und 2,5 mg E 2 für vier Monate erhalten, entwickelt sich Prostata-Karzinom, die die Nierenkapsel (4C) 5,14 dringt.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der Nierenkapsel xenografting und Pellet-Implantation. Nierenkapsel xenografting wird über einen dorsalen Mittellinie-Ansatz durchgeführt. Während desselben chirurgischen Eingriffs wird die Maus operativ mit langsam frei subkutane Druckhormon und / oder Drogen-Pellets im Halsbereich Genick implantiert.
2. Beispiele für Druck mit der vorliegenden Protokoll hergestellt Hormon Pellets. A. 12 mg Pellets. B. 6 mg Pellets. C 25 mg Pellets.
3. Feuerpolierten Pasteur-Glaspipette. Das fertige Pipette ist gekrümmt, mit einer glatten abgerundeten Spitze geeignet für die Erstellung eines Pockenet für das Xenotransplantat unter die Nierenkapsel. Die Pipette wird verwendet, um das Transplantat unter die Nierenkapsel zu manipulieren.
4. Beispiel Nierenkapsel Xenografts. A. Gewebe Xenografts (Pfeilspitzen) der menschlichen BPH Gewebe werden für einen Monat unter die Nierenkapsel einer nackten männlichen Maus gewachsen. Die Maus-Wirt mit 25 mg Testosteron-Pellets ergänzt, um die hormonelle Milieu der menschlichen männlichen simulieren. B. Zell rekombinanten Xenotransplantaten (Pfeilspitzen) der menschlichen Prostata-Zelllinie (BPH-1) und induktiver urogenitalen Mesenchym (AWS) unter die Nieren gezüchtet, Kapsel einer nackten Maus, die nicht mit einer subkutanen Hormon Pellet vier Monate. C. Zell rekombinanten Xenograft enthaltenden BPH-1 und AWS, unter die Nierenkapsel einer nackten Maus, die auch unterUnter gewachsen implantiertHaut Pellet Implantation von 25 mg Testosteron und 2,5 mg 17β-Estradiol für vier Monate.
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Discussion
Dieses Papier und die hierin beschriebenen Protokoll beschreiben die Herstellung von Druckhormon und / oder Drogen-Pellets und das chirurgische Verfahren für die subkutane Implantation von Pellets Mäusen. Je nach Fragestellung angegangen werden, kann diese Technik einzeln oder in Kombination mit Nierenkapsel xenografting der Prostatazelle rekombinante Transplantate oder Prostatagewebe Heterotransplantate, die Techniken weit in Prostata-Forschung verwendet werden, sind von 17 bis 19 durchgeführt werden. Zusammengenommen bieten diese Techniken ein leistungsfähiges Konzept für hormonelle Krebsentstehung und Regulierung von gutartigen Wachstum in der Human-und Maus Prostata untersuchen.
Pelletherstellung einfach durchzuführen ist, leicht reproduzierbar und erfordert Geräte begrenzt. Es kann auf verschiedene Hormon und Arzneizubereitungen eingesetzt werden. Es ist wichtig, diese Technik in einem chemischen Schutzhaube durchzuführen, und tragen Sie geeignete Schutzkleidung. Für Experimente, die Prostata Krebsentstehung einend Induktion der murinen Blasenauslassobstruktion verwenden wir 25 mg T und 2,5 mg E 2 5,7,15. Diese Dosen werden gewählt, weil sie in vivo die gewünschte Reaktion zu erzeugen, und weil sie Serum-Hormonspiegel, die für die menschliche Männer mit der Krankheit Prozess von Interesse sind 6 physiologisch relevanten erstellen. Pellet-Formen ermöglichen verschiedene Größen von Pellets hergestellt werden, wir verwenden in der Regel 25 mg Pellets für die Bewertung der Karzinogenese und gutartige Wachstum. Wahl der Pelletgröße hängt von der Hypothese angesprochen werden, sowie die Herstellung eines gewünschten Effekt, die Herstellung der gewünschten zirkulierenden Spiegel und der Dauer des Experiments. Wenn Drogen-oder Hormon wird mit einem Bindemittel (z. B. Cholesterin) kombiniert, empfehlen wir eine homogene Mischung von Hormon-und Bindemittel.
Je nach Studie, kann die subkutane Implantation Pellet nach der Kastration der männlichen Host 15 durchgeführt werden. Nach unserer ErfahrungImplantation von 25 mg T verursacht Feedback-Hemmung der Hypothalamus-Hypophysen-Hoden-Achse, die Hemmung der endogenen Sekretion. Deshalb wählen wir den Mäusen, die mit 25 mg T behandelt, um die androgenen Umfeld des männlichen Menschen zu erhalten, aber unbehandelten Männchen zu simulieren, mit körpereigenen T Sekretion gehalten vergleichen. Wir wissen nicht routinemäßig nutzen eine Kastrations Host aufgrund der atrophischen Reaktion der Prostata und Prostata-Heterotransplantate an Androgen-Entzug.
Dieses Protokoll beschreibt auch die Schaffung von einem Stück von Spezialgeräten für die Nierenkapsel xenografting, der feuerpolierten Pasteur-Glaspipette. Dies kann leicht mit gegenwärtigen Ausrüstung in den meisten Labors durchgeführt werden, was eine angepasste chirurgische Instrument als hergestellt und sterilisiert werden vor der Verwendung in der chirurgischen Prozedur verwendet werden. Das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung ist wichtig, um die Sicherheit zu gewährleisten Mitarbeiter bei der Erstellung der feuerpolierten Glaspipette.
Vor embarking auf einem chirurgischen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben, müssen alle Techniken überprüft und durch den institutionellen Tierpflege und Use Committee genehmigt. Chirurgische Verfahren bei Nagetieren durchgeführt erfordern Ausbildung und Praxis sowohl in der technischen Aspekte des Verfahrens, sowie die Grundsätze und Praxis der aseptischen Bedingungen. Für eine Einführung in die Ausrüstung und Techniken, die in diesen Verfahren wichtig, empfehlen wir Mitarbeiter sehen das Video Manuskript vor kurzem von Prichett-Corning berichtet et al. (2011) 20. Wir empfehlen auch alle Mitarbeiter erhalten praktische Ausbildung in Nagetier-chirurgischen Verfahren und aseptischen Bedingungen.
In unserem Labor werden diese Verfahren in der Regel mit zwei Mitarbeitern durchgeführt. Die chirurgischen Assistenten verwaltet Anästhesie, während der Wiederherstellung beobachtet Tiere, unterstützt den Chirurgen mit nicht sterilen Aspekte des Verfahrens und dokumentiert alle Vorgänge. Der Chirurg hält den sterilen Bereich, verwaltet eine Analgesiend führt die chirurgischen Verfahren in diesem Protokoll aufgeführt. Mit der richtigen Planung und Ausbildung, ist der chirurgische Eingriff des subkutanen Hormon Pellet Implantation einfach und leicht durchzuführen.
Es gibt mehrere experimentelle Design-Überlegungen für die Zell rekombinanten xenografting. Wie bei allen Versuchen unter Verwendung von immortalisierten Zelllinien, ist wichtig, um Kontamination zu minimieren und zu detektieren. Für Experimente mit BPH-1-Zelllinien, empfehlen wir einen niedrigen Durchgang Nummer (weniger als 25). Um die Effekte des Stroma zu steuern, verwenden wir Transplantate, die nur BPH-1-Zellen für eine Nierentransplantaten und enthält BPH-1 und AWS auf der kontralateralen Niere. Für Experimente zur hormonellen Karzinogenese zu lösen, haben wir in der Regel eine unbehandelte Kontrollbedingung (Maus wird mit einem Pellet implantiert ist oder mit einem Cholesterin-Pellet implantiert). Positive Kontrollen (Host-Maus mit T + E 2-Pellets implantiert) sind gleichermaßen wichtig bei der Bewertung von anderen Bedingungen that Karzinogenese kann mit diesem Modellsystem zu fördern. Je nach Fragestellung angegangen werden, kann die Dauer der Pellet-Implantation und / oder Xenotransplantat Wachstum von mehreren Wochen bis vier Monaten liegen; für Experimente geplant bis vier Monate überschreiten, empfehlen wir eine zusätzliche Pellet-Implantation auf exogene Hormonspiegel aufrecht zu erhalten. Für Experimente, die gutartige Prostatagewebe Heterotransplantate, ist es wichtig, die richtige persönliche Schutzausrüstung tragen und pflegen allgemeine Vorsichtsmaßnahmen für durch Blut übertragbaren Krankheitserregern. Frisch geerntete Gewebe kann vor xenografting für 12-72 Stunden gespeichert werden.
Die Operationstechnik für die Nierenkapsel xenografting erfordert Planung, Praxis und einige manuelle Geschicklichkeit. Minimierung der Dauer des chirurgischen Eingriffs, die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und sorgfältige chirurgische Technik perioperative Mortalitäts und chirurgischen Komplikationen zu lindern. Die Chance der perioperativen Tod in unserer Erfahrung mit der Dauer der su erhöhtrgical Verfahren, aus diesem Grund beschränken wir den chirurgischen Eingriff nicht mehr als 20-25 min. Verwendung einer Wärmelampe erwärmt und Wachs-Pad während der Operation und Genesung ist ideal für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur. Routinemäßige postoperative Pflege ist ein weiterer wichtiger Aspekt für den Erfolg dieser Technik. Während der Narkose Erholung sollte Mäuse beobachtet werden, und der Tag nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen und Leiden. Verwalten angemessenen Schmerzmitteln, um post-Verfahrens Schmerzen und Leiden zu minimieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich alle Mitglieder der Ricke Labor, Vergangenheit und Gegenwart zu danken. Wir danken Calvin Patten, Jr., DVM und Brigitte Raabe, DVM, für hilfreiche Anmerkungen zum Protokoll. Wir möchten das NIDDK, NCI und NIEHS für ihre finanzielle Unterstützung für diese Studien bestätigen: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN ist Auszubildender in der Medical Scientist Training Program an der University of Rochester durch NIH T32 GM07356 finanziert, die NIH unter Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 unterstützt auch dieses Projekt. CDV wird durch T32CA157322 und ABT unterstützt durch T32ES007015 an der Universität von Wisconsin-Madison unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of General Medical Sciences oder NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
