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Medicine

प्रोस्टेट Carcinogenesis और सौम्य Prostatic Hyperplasia के मूल्यांकन के लिए गुर्दे कैप्सूल Xenografting और चमड़े के नीचे गोली आरोपण

Published: August 28, 2013 doi: 10.3791/50574

Summary

हम चूहों में संकुचित हार्मोन छर्रों का निर्माण, साथ ही चमड़े के नीचे शल्य आरोपण का वर्णन. इस रणनीति हार्मोनल carcinogenesis और सौम्य प्रोस्टेट वृद्धि के नियमन का मूल्यांकन करने के athymic नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत सेल और ऊतक xenografts के विकास के साथ जोड़ा जा सकता है.

Abstract

दो आम प्रोस्टेट रोग, प्रोस्टेट कैंसर (PRCA) और सौम्य prostatic hyperplasia (BPH) के लिए नए उपचारों, उनकी हार्मोनल विनियमन के मूल्यांकन के प्रयोगों पर गंभीर रूप से निर्भर हैं. सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन (विशेष रूप से एण्ड्रोजन और एस्ट्रोजेन) PRCA और BPH में महत्वपूर्ण हैं, हम संकुचित हार्मोन छर्रों का उपयोग कर प्रयोगों के साथ चूहों में प्रोस्टेट वृद्धि और carcinogenesis उत्प्रेरण में उनके संबंधित भूमिकाओं की जांच. हार्मोन और / या दवा छर्रों आसानी से एक गोली प्रेस के साथ निर्मित है, और शल्य चिकित्सा पुरुष माउस मेजबान के चमड़े के नीचे ऊतक में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. हम भी immunocompromised चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रोस्टेट सेल रिकोम्बिनेंट्स की xenografting साथ चमड़े के नीचे हार्मोन गोली आरोपण के संयोजन से हार्मोनल carcinogenesis के मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इसके अलावा, चमड़े के नीचे हार्मोन गोली आरोपण, BPH ऊतक के गुर्दे कैप्सूल xenografting के साथ संयोजन में, बेहतर सौम्य प्रोस्ट का हार्मोनल विनियमन समझने के लिए उपयोगी हैविकास खा लिया, और सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन रास्ते को लक्षित नए उपचारों का परीक्षण करने के लिए.

Introduction

प्रोस्टेट कैंसर (PRCA) और सौम्य prostatic hyperplasia (BPH) के महत्वपूर्ण स्वास्थ्य बोझ हैं. PRCA पुरुषों में दूसरा सबसे प्रचलित ठोस अंग कैंसर और मौत 1 संबंधित कैंसर का एक प्रमुख कारण है. BPH भी बूढ़े लोगों के बीच काफी प्रचलित है, और यह BPH के नैदानिक ​​अभिव्यक्ति, कम मूत्र पथ के लक्षण (luts), पुरुषों 2 के 50-90% को प्रभावित करेगा कि अनुमान है. एण्ड्रोजन और एस्ट्रोजेन, PRCA और BPH में महत्वपूर्ण माने जाते हैं जबकि carcinogenesis और विकास कायम करना है कि हार्मोनल तंत्र की हमारी समझ 3,4 अधूरा रहता है. सरल और आनुवंशिक रूप से विनयशील पशु मॉडल प्रोस्टेट अनुसंधान में इन प्राथमिकताओं को संबोधित करेंगे कि पढ़ाई पिन से लगा देना. ऐसे PRCA और BPH, immunocomp में अलगाव में या गुर्दे कैप्सूल xenografting साथ संयोजन में चमड़े के नीचे, धीमी गति से जारी हार्मोन छर्रों का उपयोग, (दूसरे में एक प्रजाति से कोशिकाओं, ऊतकों या अंगों का हस्तांतरण) के रूप में हार्मोन उत्तरदायी रोगों मेंromised माउस मेजबान, विकास और carcinogenesis के हार्मोनल विनियमन के अध्ययन के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने तरीका प्रदान करता है.

चमड़े के नीचे हार्मोन गोली आरोपण carcinogenesis और प्रोस्टेट 5 में सौम्य वृद्धि का हार्मोनल विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की तकनीक है. 25 मिलीग्राम टेस्टोस्टेरोन (टी) और 2.5 मिलीग्राम 17β-estradiol (ई 2) के साथ वयस्क नर चूहों की त्वचा के नीचे आरोपण, उम्र बढ़ने पुरुषों 5,6 के गतिशील हार्मोनल वातावरण पुनः बनाने, एक सीरम ई 2 में वृद्धि हुई है और टी में क्रमिक कमी का कारण बनता है. इसके अलावा, इस मॉडल BPH-luts 5,7 के नैदानिक ​​सुविधाओं के कई स्मरण दिलाता है. हार्मोन प्रशासन के वैकल्पिक तरीकों मौखिक / नलिका - पोषण प्रशासन या intraperitoneal इंजेक्शन,, कृंतक के लिए संकट का कारण समय के साथ दवा की एक ही राशि के वितरण में कम संगत कर रहे हैं, और जो कर रहे हैं शामिल अधिक श्रम प्रधान एक बार शल्य आरोपण से. ज के लिए अन्य चमड़े के नीचे मोडormone और / या दवा वितरण Silastic कैप्सूल 8 शामिल हैं. हम भी Silastic कैप्सूल के उपयोग के साथ अनुभव किया है, संकुचित छर्रों का उपयोग और reproducibility के अपने आसानी के लिए इष्ट हैं. इसके अलावा, संकुचित हार्मोन छर्रों की रिहाई की दरें बेहतर उम्र बढ़ने पुरुषों 5,7 में मनाया गतिशील सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन के अनुपात की नकल.

आनुवंशिक रूप immunocompromised चूहों के विकास के बाद से, xenografting तकनीकों को शामिल करने के लिए कई में vivo मॉडल प्रणाली सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों की एक विस्तृत विविधता के अध्ययन के लिए विकसित किया गया है. Xenografting के कई बुनियादी श्रेणियां हैं. ऊतक xenografts एक सामान्य संरचना, घातक ट्यूमर, या सौम्य वृद्धि हो सकती है जो बरकरार ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा, से मिलकर बनता है. SZOT एट अल. (2007) ने हाल ही में अग्नाशय islets 9 के गुर्दे कैप्सूल xenografting प्रबुद्ध है. Aamdal एट अल. (1985) im में 27 मानव कैंसर कोशिका लाइनों के गुर्दे कैप्सूल xenografting वर्णितmunocompromised माउस 10 होस्ट करता है. Grafts भी (कैंसर या गैर tumorigenic) एक एकल अमर सेल लाइन से बना हो सकता है, या mesenchyme (सेल पुनः संयोजक भ्रष्टाचार) से अलग कोशिकाओं के साथ संयुक्त एक अमर सेल लाइन तक हो सकते हैं.

हम PRCA और BPH के विकास में स्ट्रोमा और उपकला के संबंधित भूमिकाओं की जांच के लिए सेल रिकोम्बिनेंट्स की xenografting एहसान. कुन्हा एट अल. (1980) वयस्क murine मूत्राशय उपकला नर चूहों सेनाओं के गुर्दे कैप्सूल के तहत भ्रूण मूत्रजननांगी साइनस mesenchyme (UGM) और xenografted के साथ संयुक्त है, ऊतक प्रोस्टेट acini 11 जैसी संरचनाओं में विकसित करता है कि रिपोर्ट करने के लिए पहली बार था. नॉर्मन एट अल. (1986) ऊतक रिकोम्बिनेंट्स में जब संयुक्त वयस्क माउस प्रोस्टेटिक ductal उपकला और UGM, वाहिनीपरक विकास और morphogenesis 12 शाखाओं में से गुजरना दिखाया. हेवर्ड एट अल. (1988) मानव प्रोस्टेट उपकला भ्रूण एम प्रेरक के लिए जवाब है कि पता चलाइसी तरह फैशन 13 में esenchyme. संयोजन से प्रोस्टेट में carcinogenesis के एक हार्मोनल मॉडल, अमर मानव प्रोस्टेट उपकला कोशिका लाइन BPH -1 UGM के साथ, पहले वैंग एट अल. 14 (2001) द्वारा सूचना मिली थी और हमारी प्रयोगशाला में 15 में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. सौम्य prostatic उपकला मनुष्यों 5 में उन्नत PRCA मॉडलिंग, metastatic रोग को बदल देती है, क्योंकि इस मॉडल PRCA प्रगति को समझने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. विशिष्ट घटकों को आनुवंशिक रूप से चालाकी से किया जा सकता है, क्योंकि सेल पुनः संयोजक ग्राफ्टिंग स्ट्रोमल उपकला बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में विशेष रूप से उपयोगी है.

Xenografting के लिए उपयुक्त अन्य साइटों त्वचा के अंदर, चमड़े के नीचे और orthotopic स्थानों 16 हैं. ब्याज की ऊतक और रोग की प्रक्रिया पर निर्भर करता है, इन उपयुक्त वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है. प्रोस्टेट हार्मोनल carcinogenesis और सौम्य विकास विनियमन के अध्ययन के लिए, हम गुर्दे कैप्सूल का चयनइसकी वजह से उच्च भ्रष्टाचार को xenografting के लिए साइट की दर, प्रचुर मात्रा में रक्त की आपूर्ति, और एक सीमित साइट 16 में xenografts की एक बड़ी संख्या को समाविष्ट करने की क्षमता रखना. इसके अलावा, प्रोस्टेटिक शोष में यह परिणाम है कि मेजबान माउस का हार्मोनल हेरफेर प्रोस्टेट orthotopic ग्राफ्टिंग 16 के उपयोग की सीमा.

इस प्रोटोकॉल संकुचित हार्मोन / दवा गोली के निर्माण और शल्य आरोपण, साथ ही मानव प्रोस्टेट सेल और ऊतक grafts के गुर्दे कैप्सूल xenografting की तकनीकों की रूपरेखा. साथ में, इन तकनीकों का एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस PRCA और / या नियंत्रण उपभेदों से BPH दीक्षा के लिए अतिसंवेदनशील है, यह निर्धारित करने के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करते हैं. Xenografting में विवो histologic और दुष्टता की आणविक सुविधाओं को विकसित करने के लिए प्रयोगात्मक सेल की क्षमता का मूल्यांकन है, साथ ही सौम्य और घातक रोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए उपन्यास उपचार रणनीतियों के लिए एक परख के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है.

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Protocol

1. संपीडित हार्मोन / औषधि गोली की तैयारी

  1. एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, मास्क, सुरक्षा चश्मा, और बोनट पहने हुए यह प्रक्रिया एक रासायनिक सुरक्षा हुड में किया जाना चाहिए. पार संदूषण को रोकने के लिए, यह गोली बनाने के उपकरण अच्छी तरह से पहले 70% इथेनॉल के साथ और गोली के प्रत्येक प्रकार के निर्माण के बाद साफ कर दिया है कि महत्वपूर्ण है.
  2. एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग और, कागज तौलना हार्मोन / दवा पाउडर के वांछित मात्रा को मापने. लगभग 5% अतिरिक्त सामग्री दबाने के दौरान नुकसान को समायोजित करने की सिफारिश की है.
  3. कुछ हार्मोन / दवाओं निर्माण गोली पिछले मिलाया जाता है जो एक बाध्यकारी एजेंट या भराव की आवश्यकता होती है. उदाहरण के लिए, 17β-estradiol की एक 2.5 मिलीग्राम गोली का निर्माण करने के लिए, एक 25 मिलीग्राम गोली में जो परिणाम कोलेस्ट्रॉल की 22.5 मिलीग्राम, साथ हार्मोन गठबंधन.
  4. ध्यान से प्रेस के तहत मरने सेट, जगह में स्थानांतरण और गोली सेक करने के लिए मजबूती से नीचे लीवर धक्का. हैं निरंतर सतह बनाए रखने के लिए लगातार दबाव का प्रयोग करेंमात्रा के अनुपात को.
  5. अगला मरने धारक रिवर्स और गोली रिलीज करने के लिए फिर से नीचे लीवर धक्का.
  6. अखंडता के लिए गोली का निरीक्षण किया और अंतिम जन वांछित सीमा के भीतर निर्धारित करती है. एक स्वीकार्य सीमा (उदाहरण के लिए, एक 25 मिलीग्राम गोली के लिए एक स्वीकार्य सीमा 23.8-26.3 मिलीग्राम है) अंतिम मास में एक ± 5% का अंतर है.
  7. हिमपात सर्जरी से पहले बनाया और (स्थिति और भंडारण की लंबाई गोली निर्माण में इस्तेमाल किया हार्मोन या दवा की स्थिरता पर निर्भर करता है) संग्रहित किया जा सकता है. हार्मोन छर्रों विनिर्माण गोली के लिए एक विकल्प के रूप में खरीदा जा सकता है. छर्रों क्रय वे तैयार की है और जटिल हो जाएगा के बाद से गैर दवा ग्रेड दवाओं के प्रयोग से बचा जाता है.

2. सेल संयोजक Xenografts की तैयारी

  1. फसल और संस्कृति प्राथमिक माउस मूत्रजननांगी mesenchyme (UGM) गिनती के लिए एकत्र किए जाने से पहले कम से कम 4 हफ्तों के लिए stromal कोशिकाओं.
  2. संस्कृति हमेशा की तरह घबराहट में प्रोस्टेट उपकला कोशिका लाइनों अमरआयन और गिनती के लिए इकट्ठा. इस उदाहरण के लिए, निलंबन में भ्रष्टाचार के प्रति 250,000 UGM stromal कोशिकाओं के साथ भ्रष्टाचार के प्रति 100,000 BPH -1 उपकला कोशिकाओं के मिश्रण से सेल पुनः संयोजक grafts तैयार करते हैं.
  3. गोली कोशिकाओं को एक साथ और 50 μl के लिए 25 μl की एक मात्रा में grafts के वांछित संख्या, प्रत्येक बनाने के लिए पर्याप्त निष्प्रभावी टाइप 1 चूहे की पूंछ कोलेजन में फिर से निलंबित.
  4. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पुनः संयोजक grafts के सेट और फिर कलम बांधने का काम पहले अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए मध्यम विकास के साथ कवर किया.

3. ऊतक Xenografts की तैयारी

  1. ऊतक खरीद और शल्य प्रक्रिया के दौरान रक्त जनित रोगजनकों के लिए सार्वभौमिक सावधानियों बनाए रखें. संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी और सूचित स्वीकृति के बाद, शल्य लकीर से ताजा प्रोस्टेट ऊतक प्राप्त करते हैं. BPH के विकास के अध्ययन के लिए, ऊतकों प्रोस्टेट या सरल prostatectomy प्रक्रियाओं के transurethral लकीर से काटा जा सकता है. PRCA या सौम्य प्रोस्ट के प्राथमिक xenograftsखाया ऊतक कट्टरपंथी prostatectomy नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है.
  2. स्टोर isotonic बफर सेल मीडिया या बर्फ पर सामान्य नमक में ऊतक काटा. ऊतक और भंडारण की स्थिति पर निर्भर करता है, नमूनों पूर्व ऊतक grafts की तैयारी के लिए 24 अप घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है. आम अभ्यास formalin में तय की और नियमित रूप से ऊतक विज्ञान के लिए कार्रवाई की एक धारा के साथ, तीन टुकड़ों में नमूना विभाजित करने के लिए है, एक टुकड़ा आणविक विश्लेषण के लिए जमे हुए और एक टुकड़ा आगे ऊतक xenografts (आकार में 1-3 मिमी) में विभाजित तस्वीर.

4. आग की तैयारी कांच विंदुक पॉलिश

  1. पहने हुए नेत्र सुरक्षा, प्रयोगशाला कोट और गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने, पर लगभग लेम्प बर्नर लौ शुरू करने के लिए एक 60 डिग्री के कोण में जगह कांच पाश्चर पिपेट टिप.
  2. हॉट स्पॉट से बचने के लिए पिपेट के लिए एक स्थिर, मामूली आंदोलन रखें.
  3. लक्ष्य के लिए एक गोल के साथ एक से थोड़ा घुमावदार अंत होने के साथ बारीकी टिप और आग पोलिश ड्रा, टिप बंद हुआ.
  4. 5. साधनों की तैयारी और सर्जिकल सुइट

    1. सभी उपकरणों आटोक्लेव. सर्जरी से पहले, बाँझ क्षेत्र बनाए रखने के ख्याल रख रही है, सभी उपकरणों का निरीक्षण किया.
    2. शोषक पैड, विच्छेदन गुंजाइश, संज्ञाहरण नाक शंकु, शल्य चिकित्सा उपकरण और कार्य क्षेत्र की ओर निर्देशित हीटिंग दीपक के साथ बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र की स्थापना की. चूहे, prewarm मनका अजीवाणु के बीच में उपकरणों बाँझ.
    3. इकट्ठा और परीक्षण संज्ञाहरण तंत्र, गैस मेहतर तौलना.
    4. सभी मोम समान रूप से पिघल रहा है, जब तक 70-80% बिजली पर (पिघल गए और unmelted मोम गठबंधन करने के क्रम में मोम पैड सानना 1 मिनट वेतन वृद्धि में,) करने के लिए 5 मिनट के लिए माइक्रोवेव, गर्मी मोम पैड का उपयोग करना. स्पर्श के द्वारा, पैड खाली कृंतक वसूली पिंजरे के तहत बहुत गर्म है और जगह तो नहीं है.
    5. सर्जिकल मास्क, बोनट, दस्ताने और गाउन सहित कृंतक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, के लिए डॉन व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण.

    6. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया: गुर्दे कैप्सूल Xenografting

    1. अनुसंधान जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों के अनुमोदन के साथ किया जाना चाहिए. पिछले संज्ञाहरण के शामिल होने के लिए, स्वास्थ्य और अच्छी तरह से किया जा रहा सुनिश्चित करने के लिए माउस का पालन.
    2. 3-5% से कम isoflurane संज्ञाहरण के शामिल होने के लिए चेंबर में माउस रखें. पशु चलते बंद कर दिया गया है और सांस की दर में कमी आई है, जब प्रवण स्थिति में नाक शंकु के लिए स्थानांतरण, और 1-3% से कम संज्ञाहरण बनाए रखें.
    3. यदि आवश्यक हो, माउस के पीछे दाढ़ी क़ैंची का उपयोग करें. Athymic नग्न (एन यू / यू) चूहों का उपयोग करते हैं तो यह जरूरी नहीं है.
    4. संज्ञाहरण की पर्याप्तता का मूल्यांकन करने के लिए विस्तारित हिंद पैर की बद्धी को फर्म दबाव लागू करें. माउस दबाव को जवाब, अधिक समय प्रभावी करने के लिए संज्ञाहरण के लिए आवश्यक है. यदि आवश्यक हो, पर्याप्त संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए थोड़ा संज्ञाहरण प्रवाह को समायोजित.
    5. माउस पर्याप्त रूप से anesthetized जाता है, के द्वारा पीछा शल्य आयोडीन (Betadine) समाधान के साथ शल्य साइट कीटाणुरहित70% शराब.
    6. डॉन बाँझ दस्ताने और गाउन, शल्य साइट बाँझ पर्दे लागू होते हैं. दांतेदार संदंश की एक जोड़ी के साथ वापस त्वचा लिफ्ट, और मोटे कैंची का उपयोग कर एक 2-3 सेमी पृष्ठीय midline चीरा बनाते हैं.
    7. कुंद कैंची या एक जांच का प्रयोग, (द्विपक्षीय ग्राफ्टिंग के लिए चीरा के दोनों किनारों पर या एकतरफा ग्राफ्टिंग के लिए एक तरफ) शरीर दीवार से अंतर्निहित dermis अलग.
    8. पार्श्व स्थिति में माउस का स्थान बदलें, और मांसपेशियों की दीवार के माध्यम से गुर्दे की प्रोफाइल देखने के द्वारा गुर्दे के स्थान की पहचान. पेट पर अंगूठे और तर्जनी के साथ कोमल पुस्तिका दबाव लागू आंतरिक अंगों दृश्यमान करने के साथ सहायता कर सकते हैं.
    9. ठीक परितारिका कैंची का प्रयोग, और रीढ़ की हड्डी में शरीर दीवार समानांतर में एक 1 सेमी चीरा बनाने, प्रमुख वाहिकाओं और रीढ़ की नसों से बचने के ख्याल रख रही है. धीरे प्रारंभिक चीरा में उन्हें रखने के बाद कैंची व्यापक खोलने के द्वारा (गुर्दे की लंबी अक्ष से थोड़ा लंबा) 1.5-2.0 सेमी तक इस चीरा चौड़ा.
    10. तर्जनी और अंगूठे का उपयोग गुर्दे के दोनों तरफ मांसपेशी दीवार के बाहर कोमल दबाव लागू करने से गुर्दे अमल में लाना. टक त्वचा शरीर दीवार पर आराम करेंगे, जो exteriorized गुर्दे नीचे किनारों. गुर्दे exteriorized जाता है, बाँझ खारा लगाने से गुर्दे कैप्सूल के जलयोजन बनाए.
    11. ठीक # 5 संदंश का प्रयोग धीरे गुर्दे की पैरेन्काइमा से गुर्दे कैप्सूल लिफ्ट और एक ठीक स्केलपेल के साथ, कैप्सूल में एक 2 -4 मिमी चीरा बनाते हैं. चीरा के आकार भ्रष्टाचार के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन कैप्सूल की अखंडता को बनाए रखने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए.
    12. गुर्दे की सतह के लिए स्पर्शरेखा कैप्सूल के तहत एक गोल बंद अंत के साथ पतली और आग पॉलिश तैयार किया गया है कि एक गिलास पाश्चर पिपेट हेरफेर. धीरे गुर्दे पैरेन्काइमा नुकसान नहीं महान देखभाल का उपयोग, grafts के लिए एक छोटा सा कैप्सूल जेब खुला.
    13. गुर्दे कैप्सूल की कटौती बढ़त भ्रष्टाचार मैं ठीक संदंश के साथ उठाया, और हैआग पॉलिश ग्लास विंदुक का उपयोग कैप्सूल के तहत जेब में डाला है. कई grafts गुर्दे कैप्सूल के तहत रखा जाता है और समान रूप से गुर्दा सतह पर स्थान दिया जा सकता है.
    14. कलम बांधने का काम के दौरान, कैप्सूल निर्जलित हो जाता है, तो, यह बाँझ खारा लगाने से सिक्त किया जाना चाहिए.
    15. कलम बांधने का काम पूरा हो गया है, धीरे वापस शरीर गुहा में गुर्दे बदलने के लिए पेशी दीवार चीरा के पक्ष उठा. Grafts के कैप्सूल के नीचे से बाहर निकलना नहीं है कि ध्यान से देखें.
    16. एक भी सिवनी (4-0, FS-2 Vicryl सिवनी) के साथ पेशी दीवार को बंद करें. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया माउस repositioning द्वारा contralateral गुर्दे पर दोहराया जा सकता है.
    17. कलम बांधने का काम पूरा हो गया है, माउस (प्रोटोकॉल चरण 7 देखें) एक ही शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान चमड़े के नीचे गोली आरोपण से गुजरना सकता है.
    18. दांतेदार संदंश का प्रयोग, त्वचा चीरा के किनारों संरेखित और चीरा बंद करने के लिए 2-3 शल्य घाव क्लिप लागू होते हैं. पीड़ानाश प्रशासन (उपयोग हम 5-10 मिलीग्राम / किग्रा carprofएक चमड़े के नीचे इंजेक्शन) का उपयोग एन और वसूली पिंजरे में पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में माउस जगह. एक चिराग या हीटिंग पैड से गर्मी के साथ शरीर के तापमान के रखरखाव सुनिश्चित. कम से कम 15 मिनट में हो जाना चाहिए जो माउस, की पूरी वसूली के लिए निरीक्षण.
    19. चूहे खून बह रहा है और / या अन्य जटिलताओं, पोस्ट ऑपरेटिव दर्द के लक्षण के लिए अगले 24 घंटे के लिए मनाया जाना चाहिए. नियमित रूप से संक्रमण के लक्षण के लिए शल्य चीरा निरीक्षण किया.
    20. 7-14 दिनों सर्जरी के बाद शल्य घाव क्लिप हटाने डिवाइस के साथ घाव क्लिप निकालें.

    7. सर्जिकल प्रक्रिया: चमड़े के नीचे गोली आरोपण

    1. दोहराएँ शल्य प्रक्रिया xenografting गुर्दे कैप्सूल से 6.1-6.5 कदम.
    2. त्वचा संदंश की एक जोड़ी के साथ वापस त्वचा लिफ्ट, और मोटे कैंची का उपयोग कर एक 1-2 सेमी पृष्ठीय midline चीरा बनाते हैं.
    3. कुंद कैंची या एक जांच का प्रयोग, एक कपाल दिशा में शरीर दीवार से अंतर्निहित dermis अलग.
    4. त्वचा संदंश का प्रयोग,धीरे त्वचा चीरा के कपाल पहलू उठा, और सीधे, दाँतेदार संदंश के साथ धीरे हार्मोन गोली पकड़े, गोली डालने और आप कुंद जांच के साथ बनाया जेब में, गर्दन के कूड़ा पर जारी.
    5. दोहराएँ शल्य प्रक्रिया xenografting गुर्दे कैप्सूल से 6.18-6.20 कदम. चमड़े के नीचे गोली आरोपण प्रदर्शन तो केवल, शल्य चीरा बंद करने के लिए 1 शल्य घाव क्लिप का उपयोग करें.

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Representative Results

परीक्षण किया जाना परिकल्पना पर निर्भर करता है, ऊतक या सेल रिकोम्बिनेंट्स के गुर्दे कैप्सूल xenografting अलगाव में, या चमड़े के नीचे हार्मोन गोली आरोपण के साथ संयोजन में किया जा सकता है. चमड़े के नीचे हार्मोन गोली आरोपण के साथ गुर्दे कैप्सूल xenografting प्रयोग के संयोजन एक काल्पनिक प्रयोग का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में सचित्र है. पाउडर और / या क्रिस्टलीय पदार्थों की एक किस्म गोली प्रेस के साथ संकुचित छर्रों के निर्माण में इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 2 25 मिलीग्राम, 12 मिलीग्राम और हार्मोन छर्रों संकुचित 6 मिलीग्राम से पता चलता है.

चित्रा 3 शल्य प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल आग पॉलिश ग्लास विंदुक का एक उदाहरण दिखाता है. लेम्प बर्नर लौ के माध्यम से एक गिलास पाश्चर पिपेट की कई गुजरता गुर्दे कैप्सूल के तहत grafts के लिए एक जेब बनाने के लिए और गुर्दे कैप्सूल के तहत grafts हेरफेर करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक आग पॉलिश, गोल टिप में परिणाम.

ntent "> 4 चित्र में दिखाया गया है, पुरुष मानव हार्मोनल वातावरण अनुकरण करने के लिए exogenous टेस्टोस्टेरोन (25 मिलीग्राम चमड़े के नीचे गोली) के साथ पूरक BPH के साथ रोगियों से प्राथमिक ऊतक xenografts, जीवित है, और ऊतक वास्तुकला भी में दिखाया गया है. (चित्रा -4 ए) संरक्षित है चित्रा 4, गुर्दे कैप्सूल ग्राफ्टिंग हार्मोनल carcinogenesis का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अनुपचारित चूहों में बड़े हो सौम्य प्रोस्टेट उपकला (BPH -1) और प्रेरक मूत्रजननांगी mesenchyme (UGM) युक्त सेल रिकोम्बिनेंट्स सौम्य वृद्धि (चित्रा 4 बी). एक ही भ्रष्टाचार, में बड़े हो रहे फार्म चार महीने के लिए 25 मिलीग्राम टी और 2.5 मिलीग्राम ई 2 के चमड़े के नीचे हार्मोन छर्रों प्राप्त है कि एक मेजबान, गुर्दे कैप्सूल (चित्रा 4C) 5,14 आक्रमण कि प्रोस्टेट कार्सिनोमा में विकसित करता है.

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चित्रा 1. गुर्दे कैप्सूल xenografting और गोली दाखिल प्रक्रिया के योजनाबद्ध. गुर्दे कैप्सूल xenografting एक पृष्ठीय midline दृष्टिकोण के माध्यम से किया जाता है. एक ही शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, माउस शल्य चिकित्सा क्षेत्र कूड़ा गर्दन में धीमी गति से रिहा चमड़े के नीचे संकुचित हार्मोन और / या दवा छर्रों के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ निर्मित संकुचित हार्मोन छर्रों के उदाहरण हैं. ए 12 मिलीग्राम गोली. बी 6 मिलीग्राम गोली. सी. 25 मिलीग्राम गोली.

चित्रा 3
चित्रा 3. आग पॉलिश कांच पाश्चर पिपेट. समाप्त पिपेट एक बोरा बनाने के लिए उपयुक्त एक चिकनी गोल टिप के साथ, घुमावदार हैगुर्दे कैप्सूल के तहत xenograft के लिए एट. पिपेट भी गुर्दे कैप्सूल के तहत भ्रष्टाचार हेरफेर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. गुर्दे कैप्सूल xenografts का उदाहरण है. मानव BPH ऊतक के ऊतक xenografts (तीर) एक नग्न पुरुष माउस के गुर्दे कैप्सूल के तहत एक महीने के लिए बड़े हो रहे हैं. माउस मेजबान मानव पुरुष का हार्मोनल वातावरण अनुकरण करने के लिए 25 मिलीग्राम टेस्टोस्टेरोन गोली के साथ पूरक है गुर्दे के अधीन हो मानव प्रोस्टेटिक उपकला कोशिका लाइन (BPH -1) और प्रेरक मूत्रजननांगी mesenchyme (UGM) युक्त. बी सेल पुनः संयोजक xenografts (तीर) भी उप कराना पड़ा है कि एक नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल के तहत हो BPH-1 और UGM, जिनमें से चार महीने. सी. सेल पुनः संयोजक xenograft के लिए एक चमड़े के नीचे हार्मोन गोली के साथ प्रत्यारोपित नहीं किया गया था कि एक नग्न माउस का कैप्सूल25 मिलीग्राम टेस्टोस्टेरोन और चार महीने के लिए 2.5 मिलीग्राम 17β-estradiol की त्वचीय गोली आरोपण.

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Discussion

इस कागज और उल्लिखित प्रोटोकॉल के साथ साथ संकुचित हार्मोन और / या दवा छर्रों का निर्माण, और चूहों के चमड़े के नीचे गोली आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया का वर्णन. संबोधित किया जाना अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, इस तकनीक अकेले, या व्यापक रूप से प्रोस्टेट अनुसंधान 17-19 में तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं, जो प्रोस्टेट सेल पुनः संयोजक grafts या प्रोस्टेट ऊतक xenografts के गुर्दे कैप्सूल xenografting के साथ संयोजन में किया जा सकता है. साथ में ले ली, इन तकनीकों हार्मोनल carcinogenesis और मानव और माउस प्रोस्टेट में सौम्य विकास के नियमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करते हैं.

गोली निर्माण आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, प्रदर्शन करने के लिए सरल है, और सीमित उपकरणों की आवश्यकता है. यह विभिन्न हार्मोन और दवा की तैयारी के लिए लागू किया जा सकता है. यह एक रासायनिक सुरक्षा हुड में इस तकनीक का प्रदर्शन, और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोस्टेट carcinogenesis एक आकलन प्रयोगों के लिएएन डी murine मूत्राशय दुकान बाधा के शामिल होने से हम 25 मिलीग्राम टी और 2.5 मिलीग्राम ई 2 5,7,15 का उपयोग करें. वे विवो जवाब में वांछित उत्पादन और क्योंकि वे ब्याज 6 की बीमारी की प्रक्रिया के साथ मानव पुरुषों के लिए physiologically प्रासंगिक हैं कि सीरम हार्मोन का स्तर बना क्योंकि इन खुराकों चुना जाता है. गोली molds छर्रों के कई अलग अलग आकार का निर्माण किया जा करने की अनुमति है, हम आम तौर पर carcinogenesis और सौम्य विकास के मूल्यांकन के लिए 25 मिलीग्राम छर्रों का उपयोग करें. गोली आकार के विकल्प को संबोधित करने की परिकल्पना है, साथ ही एक वांछित प्रभाव, वांछित परिसंचारी स्तर का उत्पादन और प्रयोग की अवधि के उत्पादन पर निर्भर करता है. दवा या हार्मोन (जैसे कोलेस्ट्रॉल) के रूप में एक बाध्यकारी एजेंट के साथ संयुक्त है, तो हम एक हार्मोन के समरूप मिश्रण और बाध्यकारी एजेंट की सलाह देते हैं.

अध्ययन के आधार पर, चमड़े के नीचे गोली आरोपण पुरुष मेजबान 15 के निम्नलिखित बधिया किया जा सकता है. हमारे अनुभव में,टी के 25 मिलीग्राम के आरोपण अंतर्जात स्राव बाधा, hypothalamic-पीयूषिका वृषण अक्ष की प्रतिक्रिया निषेध का कारण बनता है. इसलिए हम बनाए रखा अंतर्जात टी स्राव के साथ बरकरार लेकिन अनुपचारित पुरुषों के लिए मानव पुरुष की androgenic पर्यावरण अनुकरण करने के लिए 25 मिलीग्राम टी के साथ इलाज चूहों की तुलना करने के लिए चुनते हैं. हम नियमित रूप से कारण एण्ड्रोजन वापसी को प्रोस्टेट और प्रोस्टेट xenografts के एट्रोफिक प्रतिक्रिया करने के लिए एक नपुंसक मेजबान का उपयोग नहीं करते.

इस प्रोटोकॉल भी गुर्दे कैप्सूल xenografting, आग पॉलिश कांच पाश्चर पिपेट के लिए विशेष उपकरणों का एक टुकड़ा के निर्माण का वर्णन करता है. यह आसानी से निर्मित है और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया में उपयोग करने से पहले निष्फल किया जा सकता से एक स्वनिर्धारित शल्य चिकित्सा उपकरण है, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश प्रयोगशालाओं में मौजूद उपकरणों के साथ किया जा सकता है. व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने आग पॉलिश ग्लास विंदुक बनाते समय कर्मचारियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

Embarki से पहलेएनजी इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में से किसी पर, सभी तकनीकों की समीक्षा की जानी चाहिए और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी. कृन्तकों में प्रदर्शन सर्जिकल प्रक्रियाओं के प्रशिक्षण और अभ्यास की प्रक्रिया के दोनों तकनीकी पहलुओं के बारे में है, साथ ही सिद्धांतों और सड़न रोकनेवाला तकनीक का अभ्यास की आवश्यकता होती है. इन प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण उपकरण और तकनीक के लिए एक परिचय के लिए हम कर्मचारियों हाल ही में एट अल Prichett-Corning द्वारा रिपोर्ट वीडियो पांडुलिपि देखने की सलाह देते हैं. (2011) 20. हम भी सभी कर्मचारियों कृंतक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और सड़न रोकनेवाला तकनीक में प्रशिक्षण पर हाथ प्राप्त की सलाह देते हैं.

हमारी प्रयोगशाला में, इन प्रक्रियाओं आमतौर पर दो स्टाफ के सदस्यों के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. शल्य चिकित्सा सहायक, संज्ञाहरण का प्रशासन वसूली के दौरान पशुओं के अनुसार, प्रक्रिया की गैर बाँझ पहलुओं के साथ सर्जन की सहायता करता है और सभी प्रक्रियाओं दस्तावेजों. सर्जन, बाँझ क्षेत्र रखता पीड़ानाश एक का प्रशासनND इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित सर्जिकल प्रक्रियाओं करता है. उचित योजना और प्रशिक्षण के साथ, चमड़े के नीचे हार्मोन गोली आरोपण की शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया सरल और प्रदर्शन करने के लिए आसान है.

सेल पुनः संयोजक xenografting के लिए कई प्रयोगात्मक डिजाइन विचार कर रहे हैं. अमर सेल लाइनों का उपयोग किसी भी प्रयोगों के साथ के रूप में, प्रदूषण को कम करने और पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है. BPH-1 सेल लाइनों का उपयोग कर प्रयोगों के लिए, हम एक कम बीतने संख्या (कम से कम 25) की सलाह देते हैं. स्ट्रोमा के प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए, हम एक गुर्दा और contralateral गुर्दे पर BPH-1 और UGM युक्त grafts के लिए केवल BPH-1 कोशिकाओं से युक्त grafts का उपयोग. हार्मोनल carcinogenesis पता डिजाइन प्रयोगों के लिए, हम आम तौर पर एक अनुपचारित नियंत्रण हालत (माउस एक गोली के साथ प्रत्यारोपित नहीं है, या एक कोलेस्ट्रॉल गोली के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है) है. अन्य शर्तों था जब मूल्यांकन सकारात्मक नियंत्रण (मेजबान माउस टी + ई 2 छर्रों के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है) समान रूप से महत्वपूर्ण हैंटी इस मॉडल प्रणाली के साथ carcinogenesis बढ़ावा कर सकते हैं. संबोधित किया जाना अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, गोली आरोपण और / या xenograft विकास की अवधि कई हफ्तों से चार महीने के लिए सीमा सकता है, चार महीने से अधिक की योजना बनाई प्रयोगों के लिए, हम एक्सोजेनस हार्मोन के स्तर को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त गोली आरोपण की सलाह देते हैं. सौम्य प्रोस्टेट ऊतक xenografts से जुड़े प्रयोगों के लिए यह उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने और रक्त जनित रोगजनकों के लिए सार्वभौमिक सावधानियों बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. हौसले से काटा ऊतक पिछले 12-72 घंटे के लिए xenografting को संग्रहित किया जा सकता है.

गुर्दे कैप्सूल xenografting के लिए शल्य चिकित्सा तकनीक की योजना बना, अभ्यास और कुछ मैनुअल कौशल की आवश्यकता है. , शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की अवधि कम से कम शरीर का तापमान और सावधान सर्जिकल तकनीक को बनाए रखने perioperative मृत्यु दर और शल्य जटिलताओं को कम कर सकते हैं. हमारे अनुभव में perioperative मौत का मौका सु की अवधि के साथ बढ़ जाती हैrgical प्रक्रिया, इस कारण हम शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए अब से 20-25 मिनट की सीमा. सर्जरी और वसूली के दौरान एक हीटिंग दीपक और गरम मोम पैड का प्रयोग शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए आदर्श है. नियमित पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल इस तकनीक की सफलता का एक और महत्वपूर्ण पहलू है. चूहे संज्ञाहरण वसूली के दौरान मनाया जाना चाहिए, और दर्द और संकट के संकेत के लिए सर्जरी के बाद दिन. बाद प्रक्रियात्मक दर्द और संकट को कम करने के लिए उपयुक्त पीड़ानाश प्रशासन.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों अतीत और वर्तमान Ricke प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, धन्यवाद देना चाहूंगा. हम प्रोटोकॉल के बारे में उपयोगी टिप्पणी के लिए, केल्विन खड़ाऊँ, जूनियर, DVM और ब्रिजित Raabe, DVM धन्यवाद. R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764: हम इन अध्ययनों के लिए अपने वित्तीय समर्थन के लिए NIDDK, NCI, और NIEHS स्वीकार करना चाहते हैं. TMN एनआईएच T32 GM07356 द्वारा वित्त पोषित रोचेस्टर विश्वविद्यालय में चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम में एक प्रशिक्षु है, रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार F30DK093173 तहत एनआईएच भी इस परियोजना का समर्थन करता है. CDV मैडिसन विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय में T32ES007015 द्वारा समर्थित है T32CA157322 और ABT द्वारा समर्थित है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी जनरल मेडिकल साइंसेज या एनआईएच के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pellet press PARR Industries 2815 3mm Punch & Die set
Analytical Balance Ohaus 1918302 Voyager or other
Bunsen burner Fisher Scientific 03-962Q
Dissecting microscope Leica L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) Braintree Scientific 39DP Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer F.S.T. 18000-45
Isoflurane Vaporizer Supera Anesthesia Innov VAP3000
Induction Chamber Supera Anesthesia Innov RES644
F/AIR Canister Supera Anesthesia Innov 80120
4 port Manifold Supera Anesthesia Innov RES536
Rebreathing Circuits Supera Anesthesia Innov CIR529
Inlet/Outlet Fittings Supera Anesthesia Innov VAP203/4
Pressure Reg/Gauge Supera Anesthesia Innov OXY508
Oxygen Flowmeter Supera Anesthesia Innov OXY660
21mm Clear Tubing Supera Anesthesia Innov 301-150
Small Mice Nose Cone Supera Anesthesia Innov ACC526
Sterile surgical gown Midwest Vet Supply 350.79866.2
Surgical mask Midwest Vet Supply 350.50111.2 2-ply w/ earloops
Sterile gauze Midwest Vet Supply 001.14100.2 2 x 2 inches
Sterile Gloves Kimberly Clark 55092
Bouffant Midwest Vet Supply 001.27100.2
Cotton Tip Applicator Midwest Vet Supply 001.06220.2
Surgical Scrub Wash Midwest Vet Supply 733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated) General Econopak, Inc 88VCSTF
REAGENTS
Cholesterol Sigma-Aldrich C-3292
Testosterone Proprionate Sigma-Aldrich T-1875
17β-estradiol Sigma-Aldrich E-2758
Isoflurane Midwest Vet Supply 193.33161.3
Carprofen Midwest Vet Supply 193.70200.3 Injectable (Rimadyl)
Betadine Webster Veterinary 07-836-3379
Sterile saline Midwest Vet Supply 193.74504.3 NaCl 0.9%, Injectable
SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors Fine Scientific Tools (F.S.T.) 14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) F.S.T. 11055-10
Fine Iris scissors F.S.T. 14090-09
Graefe Scalpel F.S.T. 10071-12
Dumont #5 forceps F.S.T. 11251-20
Glass Pasteur pipets Fisher Scientific S67050 5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved) F.S.T. 11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight) F.S.T. 11050-10
Vicryl Suture Midwest Vet Supply 295-92100.2 4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action F.S.T. 12002012
Wound Clips Braintree Scientific ACS CS May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper F.S.T. 12031-09 Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover F.S.T. 12033-00 Universal
Sterilization Container F.S.T. 20810-01 Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle BD 148292C 1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator National Band Tag Co. 1005s1 Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags National Band Tag Co. 1005-1

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References

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चिकित्सा अंक 78 कैंसर जीवविज्ञान prostatic hyperplasia प्रोस्टेटिक अर्बुद neoplastic प्रक्रियाओं estradiol टेस्टोस्टेरोन ट्रांसप्लांटेशन Heterologous विकास xenotransplantation Heterologous ट्रांसप्लांटेशन हार्मोन प्रोस्टेट टेस्टोस्टेरोन 17beta-estradiol सौम्य prostatic hyperplasia प्रोस्टेट कैंसर पशु मॉडल
प्रोस्टेट Carcinogenesis और सौम्य Prostatic Hyperplasia के मूल्यांकन के लिए गुर्दे कैप्सूल Xenografting और चमड़े के नीचे गोली आरोपण
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Nicholson, T. M., Uchtmann, K. S.,More

Nicholson, T. M., Uchtmann, K. S., Valdez, C. D., Theberge, A. B., Miralem, T., Ricke, W. A. Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia. J. Vis. Exp. (78), e50574, doi:10.3791/50574 (2013).

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