Summary
Descriviamo la fabbricazione di pellet ormonali compressi, nonché sottocutanea impianto chirurgico in topi. Questa strategia può essere combinato con la crescita di cellule e tessuti xenotrapianti sotto la capsula renale di topi nudi atimici valutare cancerogenesi ormonale e regolazione della crescita prostatica benigna.
Abstract
Nuove terapie per due malattie comuni della prostata, il cancro alla prostata (PRCA) e iperplasia prostatica benigna (BPH), dipendono in modo critico sugli esperimenti che valutano la loro regolazione ormonale. Ormoni sessuali steroidei (in particolare androgeni ed estrogeni) sono importanti in PRCA e BPH, si sonda i loro rispettivi ruoli nell'indurre la crescita della prostata e carcinogenesi in topi con esperimenti usando pellet ormonali compressi. Ormonali e / o droga pellet sono facilmente realizzati con una pressa pellet, e chirurgicamente impiantati nel tessuto sottocutaneo dell'host topo maschio. Noi descriviamo anche un protocollo per la valutazione della carcinogenesi ormonale combinando sottocutanea dell'ormone pellet impianto con xenotrapianto di cellule ricombinanti prostata sotto la capsula renale di topi immunocompromessi. Inoltre, l'ormone sottocutanea pellet impianto, in combinazione con la capsula renale xenotrapianto di tessuto di BPH, è utile per capire meglio regolazione ormonale del prost benignamangiato la crescita, e per testare nuove terapie mirate sesso steroidi percorsi ormonali.
Introduction
Il cancro della prostata (PRCA) e iperplasia prostatica benigna (BPH) sono significativi oneri sanitari. PRCA è il secondo tumore solido più frequente negli uomini ed una delle principali cause di cancro legate morte 1. BPH è anche molto diffusa tra gli uomini più anziani, e si stima che la manifestazione clinica di BPH, sintomi delle basse vie urinarie (LUTS), interesserà 50-90% degli uomini 2. Mentre androgeni ed estrogeni sono noti per essere importanti in PRCA e BPH, la nostra comprensione dei meccanismi ormonali che sono alla base della carcinogenesi e la crescita rimane incompleto 3,4. Modelli animali semplici e geneticamente trattabili sono alla base degli studi che affronteranno tali priorità nella ricerca della prostata. In ormonali malattie reattive come PRCA e BPH, l'uso del sottocutaneo, pellets ormone di rilascio lento, isolatamente o in combinazione con capsula renale xenotrapianto (il trasferimento di cellule, tessuti o organi da una specie all'altra) nel immunocompospite del mouse romised, fornisce un metodo semplice e riproducibile per lo studio regolazione ormonale della crescita e carcinogenesi.
Sottocutanea ormone pellet impianto è una tecnica semplice e riproducibile per studiare regolazione ormonale della carcinogenesi e formazione benigna della prostata 5. Impianto sottocutaneo di topi maschi adulti con 25 mg di testosterone (T) e 2,5 mg di 17β-estradiolo (E2), causa un aumento nel siero E 2 e graduale diminuzione della T, ricreando l'ambiente ormonale dinamico di uomini di invecchiamento 5,6. Inoltre, questo modello riassume molte delle caratteristiche cliniche di BPH-LUTS 5,7. Metodi alternativi di somministrazione di ormoni comprendono la somministrazione orale / sonda gastrica o iniezione intraperitoneale, che causare disagio al roditore, sono meno consistenti nel fornire la stessa quantità di farmaco nel tempo, e sono più di un impianto chirurgico di una volta intensità di lavoro. Altri modi sottocutanei per hOrmone e / o la somministrazione di farmaci includono capsule Silastic 8. Mentre abbiamo anche l'esperienza con l'utilizzo di capsule Silastic, pellets compressi sono favoriti per la loro facilità d'uso e riproducibilità. Inoltre, i tassi di rilascio di pellet ormonali compressi meglio imitano gli ormoni steroidei sessuali rapporti dinamici osservati in uomini di invecchiamento 5,7.
Poiché lo sviluppo di topi geneticamente immunocompromessi, numerosi sistemi modello in vivo dotati di tecniche xenotrapianto sono stati sviluppati per lo studio di una ampia varietà di tessuti normali e malati. Ci sono diverse categorie di base di xenotrapianto. Xenotrapianti tessuti costituiti da un piccolo pezzo di tessuto intatto, che può essere una struttura normale, tumore maligno, o formazione benigna. Szot et al. (2007) hanno recentemente illuminato capsula renale xenotrapianto di insule pancreatiche 9. Aamdal et al. (1985) ha descritto capsula renale xenotrapianto di 27 linee cellulari tumorali umane in imMouse munocompromised ospita 10. Innesti possono anche essere costituiti da una singola linea di cellule immortalizzate (cancerose o non-oncogeno), o possono essere costituiti da una linea di cellule immortalizzate combinata con cellule isolate dal mesenchima (cella innesto ricombinante).
Siamo favorevoli xenotrapianto di cellule ricombinanti per sondare i rispettivi ruoli di stroma ed epitelio nello sviluppo di PRCA e BPH. Cunha et al. (1980) fu il primo a riferire che quando adulto murino epitelio della vescica è combinato con mesenchima embrionale urogenitale sinusale (UGM) e eterotrapiantate sotto la capsula renale di topi maschi padroni di casa, il tessuto si sviluppa in strutture che assomigliano alla prostata acini 11. Norman et al. (1986) ha mostrato che topo adulto prostatica duttale e UGM, se combinati in ricombinanti tessuti, subiscono la crescita duttale e la ramificazione morfogenesi 12. Hayward et al. (1988) ha mostrato che epitelio prostatico umano risponde induttivo m fetaleesenchyme in modo simile 13. Un modello ormonale della carcinogenesi della prostata, combinando la prostata umana immortalizzate linea cellulare epiteliale BPH-1 con UGM, è stata riportata da Wang et al. 14 (2001) ed è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio 15. Questo modello è adatto per comprendere PRCA progressione perché benigna dell'epitelio prostatico si trasforma in malattia metastatica, modellazione avanzata PRCA negli esseri umani 5. Poiché i componenti specifici possono essere geneticamente manipolati, cellule innesto ricombinante è particolarmente utile come approccio per valutare le interazioni stroma-epiteliale.
Altri siti idonei per xenotrapianto sono intradermica, sottocutanea e luoghi ortotopici 16. A seconda del processo di tessuto e la malattia di interesse, questi possono essere approcci alternativi adatti. Per lo studio di carcinogenesi della prostata ormonale e regolazione della crescita benigna, scegliamo la capsula renalesito per xenotrapianto grazie alle sue innesto superiori prendere velocità, abbondante afflusso di sangue, e la capacità di impiantare un numero maggiore di xenotrapianti in un sito limitato a 16. Inoltre, la manipolazione ormonale del mouse host che provoca atrofia prostatica limita l'uso della prostata ortotopico innesto 16.
Questo protocollo descrive le tecniche di produzione dell'ormone compressa / droga pellet e impianto chirurgico, così come capsula renale xenotrapianto di cellule della prostata e tessuti umani innesti. Insieme, queste tecniche forniscono un saggio sensibile per determinare se un topo geneticamente modificato è più suscettibile di PRCA e / o BPH iniziazione di ceppi di controllo. Xenotrapianto è una tecnica potente per la valutazione in vivo del potenziale delle cellule sperimentali per sviluppare istologiche e molecolari di malignità, nonché un saggio per strategie di trattamento innovativi per una vasta gamma di malattie benigne e maligne.
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Protocol
1. Preparazione di Compressed ormone / Drug Pellet
- Questa procedura deve essere eseguita in una cappa di sicurezza chimica mentre indossa un camice da laboratorio, guanti, mascherina, occhiali di sicurezza, e il cofano. Per evitare la contaminazione incrociata, è fondamentale che l'apparecchiatura che crea pellet è completamente pulito con etanolo al 70% prima e dopo la fabbricazione di ciascun tipo di pellet.
- Utilizzando una bilancia analitica e pesare la carta, misurare quantità desiderata di polvere di ormone / droga. Circa il 5% di materiale in più si raccomanda di accogliere la perdita durante la pressatura.
- Alcuni ormoni / farmaci richiedono un agente o un riempitivo di legame, che è mescolato prima di pellet fabbricazione. Ad esempio, la produzione di un 2,5 mg pellet di 17β-estradiolo, l'ormone combinare con 22,5 mg di colesterolo, che si traduce in un pellet 25 mg.
- Trasferire attentamente insieme die, posto sotto la pressa e spingere la leva con decisione verso il basso per comprimere i pellet. Utilizzare una pressione costante per mantenere costante la superficie sonoun rapporto volume.
- Successivo inverse portastampi e abbassare la leva per rilasciare il pellet.
- Ispezionare pellet per l'integrità e determinare se la massa finale è nel raggio desiderato. Un intervallo accettabile una differenza ± 5% in massa finale (ad esempio, un intervallo accettabile per un pellet di 25 mg è 23,8-26,3 mg).
- I pellet possono essere fatte prima dell'intervento e conservati (condizioni e la durata dello stoccaggio dipende dalla stabilità del ormonale o farmaco usato nella produzione di pellet). Pellets ormonali possono essere acquistati come alternativa a pellet produzione. L'acquisto pellet evita l'uso di farmaci di qualità non farmaceutici dal momento che verranno formulate e aggravati.
2. Preparazione di cellule ricombinanti Xenotrapianti
- Harvest e la cultura principale del mouse mesenchima urogenitale (UGM), le cellule stromali per meno di 4 settimane prima di essere raccolti per il conteggio.
- Cultura immortalato prostata linee cellulari epiteliali nel solito fashion e raccogliere per il conteggio. Per questo esempio, preparare cellulari innesti ricombinanti mescolando 100.000 cellule BPH-1 epiteliali per innesto con 250.000 UGM cellule stromali per innesto in sospensione.
- Cellule pellet insieme e risospendere in abbastanza collagene di tipo 1 neutralizzato ratto coda per numero desiderato di innesti, ciascuna in un volume di 25 pl a 50 pl.
- Impostare innesti ricombinanti a 37 ° C per 15 minuti e poi coprire con terreno di coltura per la conservazione a 37 ° C per 48 ore prima di innesto.
3. Preparazione del tessuto Xenotrapianti
- Mantenere le precauzioni universali per via ematica patogeni durante approvvigionamento dei tessuti e la procedura chirurgica. Dopo l'approvazione comitato di revisione istituzionale e il consenso informato, avere tessuto prostatico fresco di resezione chirurgica. Per gli studi di crescita BPH, tessuti possono essere raccolte da resezione transuretrale della prostata o semplici procedure prostatectomia. Xenotrapianti primarie di PRCA o prost benignatessuto mangiato può essere ottenuto da campioni di prostatectomia radicale.
- Conservare tessuto raccolto in mezzi cellule isotonica tamponata salina normale o su ghiaccio. A seconda delle condizioni dei tessuti e di stoccaggio, i campioni possono essere conservati per un massimo 24 ore prima della preparazione di innesti di tessuto. Pratica comune è di dividere il campione in tre pezzi, con una sezione fissato in formalina ed ordinariamente trattati per istologia, un pezzo scatto congelato per l'analisi molecolare e un pezzo ulteriormente suddivisa in xenotrapianti di tessuto (1-3 mm di dimensioni).
4. Preparazione del fuoco lucido pipetta di vetro
- Guanti resistenti indossare occhiali protettivi, camice da laboratorio e di calore, posto vetro pipetta Pasteur punta nel becco Bunsen fiamma ad un angolo di circa 60 ° per iniziare.
- Mantenere una costante, lieve movimento alla pipetta in modo da evitare punti caldi.
- Disegna la punta sottile e fuoco lucidare con l'obiettivo di essere un finale leggermente curva con una rotonda, chiuso punta. 5. Preparazione di strumenti chirurgici e Suite
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti. Prima dell'intervento, ispezionare tutti gli strumenti, avendo cura di mantenere il campo sterile.
- Impostare area chirurgica sterile con tamponi assorbenti, portata dissezione, anestesia naso a cono, strumenti chirurgici e la lampada di riscaldamento diretto verso l'area di lavoro. Per sterilizzare gli strumenti tra topi, Preriscaldare tallone sterilizzatore.
- Montare ed apparecchi di anestesia prova; pesare scavenger gas.
- Utilizzando le microonde, pastiglie cera calore per 5 minuti (in incrementi di 1 min, impastare il pad cera per coniugare fuso e unmelted cera) all'accensione 70-80%, fino a quando tutta la cera è uniformemente sciolto. Al tatto, assicura il pad non è troppo caldo e posto sotto la gabbia di recupero roditori vuoto.
- Don dispositivi di protezione individuale per le procedure chirurgiche di roditori, tra cui mascherina chirurgica, cappellino, guanti e camice.
- Tutte le procedure che coinvolgono gli animali di ricerca devono essere eseguite con l'approvazione dei comitati per la cura degli animali istituzionale e di utilizzo. Prima dell'induzione dell'anestesia, osservare il mouse per garantire la salute e il benessere.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia isoflurano al 3-5%. Quando l'animale ha smesso di muoversi e la frequenza respiratoria è diminuito, trasferimento a cono in posizione prona, e mantenere l'anestesia al 1-3%.
- Se necessario, utilizzare tagliatori di radere la parte posteriore del mouse. Questo non è necessario quando si utilizza atimici nudi (nu / nu) topi.
- Applicare una pressione decisa per la tessitura del piede posteriore esteso per valutare l'adeguatezza dell'anestesia. Se il mouse risponde alla pressione, è necessario più tempo per l'anestesia abbia effetto. Se necessario, regolare il flusso di anestesia leggermente per raggiungere l'anestesia adeguata.
- Quando il mouse viene adeguatamente anestetizzato, disinfettare il sito chirurgico con iodio soluzione chirurgica (Betadine), seguita da70% di alcol.
- Don guanti sterili e camice, applica teleria sterile al sito chirurgico. Sollevare la pelle torna con un paio di pinze dentate, e utilizzando le forbici grossolani fanno un cm dorsale mediana incisione 2-3.
- Utilizzando forbici smussate o una sonda, separare il derma sottostante dalla parete del corpo (su entrambi i lati dell'incisione per l'innesto bilaterale o su un lato per l'innesto unilaterale).
- Riposizionare il mouse in posizione laterale, e identificare la posizione del rene visualizzando il profilo renale attraverso la parete muscolare. Applicare una leggera pressione manuale con il pollice e l'indice sull'addome può aiutare con la visualizzazione organi interni.
- Usando sottili forbici iris, e avendo cura di evitare grandi vasi e nervi spinali, fare un 1 centimetro incisione nella parete del corpo parallelo alla colonna vertebrale. Amplia questa incisione di 1,5-2,0 cm (leggermente più lungo l'asse longitudinale del rene) aprendo delicatamente le forbici ampia dopo inserendoli nella incisione iniziale.
- Esteriorizzare il rene applicando una leggera pressione all'esterno della parete muscolare su entrambi i lati del rene con il dito indice e pollice. Tuck pelle bordi sotto del rene esteriorizzato, che si regga sulla parete del corpo. Mentre il rene è esteriorizzato, mantenere l'idratazione della capsula renale applicando salina sterile.
- Utilizzando belle # 5 pinze sollevare delicatamente la capsula renale dal parenchima del rene e con la multa bisturi, fare una incisione mm 2 -4 nella capsula. La dimensione della incisione è determinata dalle dimensioni della protesi, ma dovrebbe essere minimizzato per mantenere l'integrità della capsula.
- Manipolare una pipetta Pasteur di vetro che è stata disegnata sottile e incendio lucidato con un'estremità chiusa arrotondata sotto la capsula tangente alla superficie del rene. Aprire delicatamente una piccola capsula tasca per gli innesti, con grande attenzione a non danneggiare il parenchima renale.
- Il bordo di taglio della capsula renale viene sollevato con le pinza sottile, e l'i innestos inserita nella tasca sotto la capsula utilizzando il vetro pipetta lucidati a fuoco. Diversi innesti possono essere posizionati sotto la capsula renale e distribuiti uniformemente sulla superficie del rene.
- Se, nel corso di un innesto, la capsula diventa disidratato, dovrebbe essere inumidito applicando salina sterile.
- Quando l'innesto è completa, sollevare delicatamente i lati dell'incisione parete muscolare per sostituire il rene indietro nella cavità del corpo. Si osservi che gli innesti non scivolare fuori da sotto la capsula.
- Chiudere la parete muscolare con una sola sutura (4-0, FS-2 Vicryl sutura). La procedura chirurgica può essere ripetuta sul rene controlaterale riposizionando il mouse.
- Quando l'innesto è completa, il mouse potrebbe subire sottocutanea pellet impianto nel corso della stessa procedura chirurgica (Vedi protocollo punto 7).
- Utilizzando pinze dentate, allineare i bordi incisione della pelle e applicare 2-3 clip ferita chirurgica per chiudere l'incisione. Somministrare analgesia (usiamo 5-10 mg / kg carprofen mediante iniezione sottocutanea) e posizionare il mouse in decubito laterale nella gabbia recupero. Assicurare il mantenimento della temperatura corporea con calore da una lampada o piastra elettrica. Osservare per il pieno recupero del mouse, che dovrebbe avvenire in meno di 15 minuti.
- I topi devono essere osservati per la prossima 24 ore per i segni di dolore post-operatorio, sanguinamento e / o altre complicazioni. Controllare regolarmente incisione chirurgica per segni di infezione.
- Rimuovere clip ferita con dispositivo chirurgico di rimozione della clip ferita 7-14 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Ripetere i passaggi 6,1-6,5 dalla capsula renale xenotrapianto procedura chirurgica.
- Sollevare la pelle torna con un paio di pinze pelle, e utilizzando le forbici grossolani fanno un cm dorsale mediana incisione 1-2.
- Utilizzando forbici smussate o una sonda, separare il derma sottostante dalla parete del corpo in direzione craniale.
- Utilizzando pinze pelle,sollevare delicatamente l'aspetto craniale dell'incisione cutanea, e tenendo premuto il pellet ormone delicatamente con rette, pinze dentellate, inserire il pellet e rilasciare alla collottola, in tasca si è creato con la sonda smussato.
- Ripetere i passaggi da 6,18-6,20 capsula renale xenotrapianto procedura chirurgica. Se si esegue per via sottocutanea pellet impianto solo, usare 1 clip ferita chirurgica per chiudere l'incisione chirurgica.
6. Procedura chirurgica: renale Capsule xenotrapianto
7. Procedura chirurgica: sottocutaneo Pellet impianto
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Representative Results
A seconda ipotesi da testare, capsula renale xenotrapianto di tessuti o cellule ricombinanti può essere eseguita isolatamente o in combinazione con l'impianto sottocutaneo ormone pellet. Uno schema di un esperimento ipotetica che unisce esperimento capsula xenotrapianto renale con ormone sottocutanea pellet impianto è illustrato in Figura 1. Una varietà di sostanze in polvere e / o cristallini possono essere utilizzati nella fabbricazione di pellet compressi con la stampa pellet. Figura 2 mostra 25 mg, 12 mg e 6 mg compresse pellets ormonali.
La Figura 3 mostra un esempio della pipetta di vetro lucidati a fuoco utilizzato durante la procedura chirurgica. Più passaggi di una pipetta Pasteur di vetro attraverso Bunsen bruciatore a fiamma determinano una punta sterilizzata, arrotondati che viene utilizzato per creare una tasca per innesti sotto la capsula renale e manipolare innesti sotto la capsula renale.
S copi "> Come mostrato in Figura 4, xenotrapianti tessuto da pazienti con BPH, integrati con testosterone esogeno (25 mg pellet sottocutanea) per simulare il maschio ambiente ormonale umano, sopravvivono e l'architettura del tessuto è conservato (Figura 4A). Anche mostrato in Figura 4, capsula renale innesto può essere utilizzato per valutare la carcinogenesi ormonale. ricombinanti cella contenente benigna dell'epitelio prostata (BPH-1) e induttiva mesenchima urogenitale (UGM) coltivate in topi non trattati formano escrescenze benigne (Figura 4B). Lo stesso innesto, coltivati un host che ha ricevuto pellet ormonali sottocutanee di 25 mg e 2,5 mg E 2 T per quattro mesi, si sviluppa in carcinoma prostatico che invade la capsula renale (Figura 4C) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figura 1. Schema della capsula renale xenotrapianto e pellet procedura di impianto. Renale capsula xenotrapianto avviene tramite un approccio linea mediana dorsale. Nel corso della stessa procedura chirurgica, il mouse viene impiantato chirurgicamente con slow-releasing hormone compresso sottocutaneo e / o pellet di droga nel collo collottola regione.
Figura 2. Esempi di pellets ormonali compressi realizzati con il presente protocollo. A. 12 mg pellet. B. 6 mg pellet. C. 25 mg pellet.
Figura 3. Fuoco-lucido Pasteur pipetta di vetro. La pipetta finito è curvo, con una punta morbida e arrotondata adatto per la creazione di un butteratoet per lo xenotrapianto sotto la capsula renale. La pipetta è anche usato per manipolare l'innesto sotto la capsula renale.
Figura 4. Esempio di xenotrapianti capsula renale. A. xenotrapianti tessuto (frecce) del tessuto BPH umani sono coltivati per un mese sotto la capsula renale di un topo nudo maschile. L'host mouse viene integrato con 25 mg di testosterone pellet per simulare l'ambiente ormonale del maschio umano. B. xenotrapianti cellulari ricombinanti (frecce) contenenti linea umana prostatica cellule epiteliali (BPH-1) e induttiva mesenchima urogenitale (UGM) cresciuta sotto il renale capsula di un topo nudo che non è stato impiantato un pellet ormone sottocutanea per quattro mesi. C. cellulare xenotrapianto ricombinante contenente BPH-1 e UGM, cresciute sotto la capsula renale di un topo nudo che inoltre ha subito subcutanea pellet impianto di 25 mg di testosterone e 2,5 mg di 17β-estradiolo per quattro mesi.
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Discussion
Questo documento e il protocollo descritto nel presente documento descrivono la produzione di ormone compressa e / o pellets droga, e la procedura chirurgica per l'impianto sottocutaneo pellet di topi. A seconda della domanda di ricerca da affrontare, questa tecnica può essere eseguita singolarmente, o in combinazione con capsula renale xenotrapianto di cellule della prostata innesti ricombinanti o xenotrapianti tessuto della prostata, che sono tecniche ampiamente utilizzate nella ricerca prostata 17-19. Nel loro insieme, queste tecniche offrono un approccio efficace per studiare cancerogenesi ormonale e regolazione della crescita benigna della prostata umano e mouse.
Pellet fabbricazione è semplice da eseguire, facilmente riproducibile, e richiede attrezzature limitato. Esso può essere applicato a varie preparazioni ormonali e farmacologiche. E 'fondamentale per eseguire questa tecnica in una cappa di sicurezza chimica e indossare dispositivi di protezione adeguati. Per gli esperimenti che valutano carcinogenesi della prostata unnd induzione di murino ostruzione della vescica usiamo 25 mg e 2,5 mg e 2 5,7,15 T. Queste dosi sono scelti perché producono la desiderata risposta in vivo e perché creano livelli di ormone siero che sono fisiologicamente rilevanti per i maschi umani con il processo della malattia di interesse 6. Stampi a pellet permettono diverse dimensioni di pellet da produrre, noi di solito usiamo 25 pellets mg per valutare la carcinogenesi e la crescita benigna. Scelta delle dimensioni pellet dipende l'ipotesi da affrontare, così come la produzione di un effetto desiderato, la produzione di livelli circolanti desiderate e la durata dell'esperimento. Se farmaco o ormone è combinata con un agente legante (come il colesterolo) si consiglia una miscela omogenea di ormone e legante.
A seconda dello studio, sottocutanea pellet impianto può essere eseguita dopo la castrazione dell'ospite maschio 15. Nella nostra esperienza,impianto di 25 mg di T provoca l'inibizione di feedback dell'asse ipotalamo-ipofisi-testicolare, inibizione della secrezione endogena. Perciò abbiamo scelto di confrontare i topi trattati con 25 mg T per simulare l'ambiente androgenico maschio umano per maschi interi ma non trattati, con la secrezione endogena T mantenuto. Noi non utilizziamo abitualmente un host castrato a causa della risposta atrofica della prostata e della prostata xenotrapianti al ritiro androgeni.
Questo protocollo descrive anche la creazione di un pezzo di attrezzature specializzate per capsula renale xenotrapianto, il vetro pipetta Pasteur lucidati a fuoco. Questo può essere facilmente eseguita con attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori, risultante in uno strumento chirurgico personalizzato che può essere fabbricati e sterilizzati prima dell'uso nella procedura chirurgica. Indossare dispositivi di protezione individuale è importante per garantire la sicurezza del personale durante la creazione della pipetta di vetro lucidati a fuoco.
Prima di embarking su una qualsiasi delle procedure chirurgiche descritte in questo protocollo, tutte le tecniche devono essere esaminati e approvati dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale. Le procedure chirurgiche eseguite in roditori richiedono una formazione e pratica sia gli aspetti tecnici della procedura, nonché i principi e la pratica della tecnica asettica. Per un'introduzione alle apparecchiature e le tecniche importanti in queste procedure si consiglia staff visualizzare il manoscritto di video recentemente riportato da Prichett-Corning et al. (2011) 20. Noi raccomandiamo anche tutto il personale riceve hands-on di formazione in procedure chirurgiche roditori e tecnica asettica.
Nel nostro laboratorio, queste procedure sono in genere eseguite con due membri del personale. L'assistente chirurgico amministra anestesia, osserva gli animali durante il recupero, assiste il chirurgo con aspetti non sterili della procedura e documenta tutte le procedure. Il chirurgo mantiene il campo sterile, gestisce una analgesiand esegue le procedure chirurgiche descritte in questo protocollo. Con una corretta pianificazione e la formazione, la procedura chirurgica di impianto sottocutaneo ormone pellet è semplice e facile da eseguire.
Ci sono diverse considerazioni di progettazione sperimentali per cellulare xenotrapianto ricombinante. Come con qualsiasi esperimenti che utilizzano linee cellulari immortali, la contaminazione è importante ridurre al minimo e rilevare. Per gli esperimenti che utilizzano BPH-1 linee cellulari, si consiglia un numero di passaggio basso (meno di 25). Per controllare gli effetti dello stroma, utilizziamo innesti contenenti solo BPH-1 le cellule per un rene e innesti contenenti BPH-1 e UGM sul rene controlaterale. Per gli esperimenti che mirano ad affrontare cancerogenesi ormonale, di solito abbiamo una condizione di controllo non trattato (mouse non è impiantato con una pallina, o viene impiantato con un pellet di colesterolo). I controlli positivi (topo ospitante è impiantato con T + E 2 granuli) sono altrettanto importanti nel valutare altre condizioni di that possono promuovere la cancerogenesi con questo sistema modello. A seconda della domanda di ricerca da affrontare, la durata di pellet impianto e / o la crescita xenotrapianto può variare da alcune settimane a quattro mesi, per esperimenti previsti a superare i quattro mesi, si consiglia di ulteriore impianto a pellet per mantenere i livelli di ormoni esogeni. Per gli esperimenti che coinvolgono benigne xenotrapianti tessuto prostatico, è importante indossare un equipaggiamento di protezione personale e di mantenere le precauzioni universali per ematica agenti patogeni. Tessuto appena raccolto può essere conservato prima di xenotrapianto per 12-72 ore.
La tecnica chirurgica per la capsula renale xenotrapianto richiede una pianificazione, di pratica e di destrezza manuale. Minimizzare la durata della procedura chirurgica, mantenendo la temperatura corporea e tecnica chirurgica accurata può attenuare la mortalità perioperatoria e complicazioni chirurgiche. La probabilità di morte perioperatoria nella nostra esperienza aumenta con la durata del suProcedura rgical, per questo motivo abbiamo limitare la procedura chirurgica per non più di 20-25 minuti. L'uso di una lampada riscaldante e pad cera riscaldato durante l'intervento e il recupero è ideale per mantenere la temperatura corporea. Routine di cura post-operatoria è un altro aspetto importante del successo di questa tecnica. I topi devono essere osservate durante il recupero l'anestesia, e il giorno dopo un intervento chirurgico per i segni di dolore e angoscia. Somministrare opportuno analgesia per ridurre al minimo il dolore post-procedurale e disagio.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Ricke, passati e presenti. Ringraziamo Calvin Patten, Jr., DVM e Brigitte Raabe, DVM, per i commenti utili per quanto riguarda il protocollo. Vorremmo riconoscere il NIDDK, NCI, e NIEHS per il loro sostegno finanziario per questi studi: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN è un tirocinante nel Programma di Formazione Medica Scientist presso l'Università di Rochester finanziato dal NIH T32 GM07356, il NIH sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Research Service Award F30DK093173 supporta anche questo progetto. CDV è supportato da T32CA157322 e ABT è supportato dal T32ES007015 presso l'Università del Wisconsin-Madison. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali o NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
