Summary
Опишем производства сжатого гормонов гранул, а также подкожный хирургической имплантации мышам. Эта стратегия может быть объединен с ростом клеток и тканей ксенотрансплантатов под почечную капсулу бестимусных голых мышей для оценки гормонального канцерогенеза и регулирование роста доброкачественных простаты.
Abstract
Новые методы лечения в течение двух распространенных заболеваний простаты, рака предстательной железы (протяжении) и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), в решающей степени зависеть экспериментов, оценивающих свою гормональную регуляцию. Секс стероидные гормоны (в частности, андрогенов и эстрогенов) играют важную роль в PRCA и ДГПЖ, мы исследовать их соответствующие роли в стимулировании роста простаты и канцерогенез у мышей с экспериментов с использованием сжатых гормонов гранул. Гормональные и / или наркотиков гранулы легко производятся с пресс-гранулятор, и имплантируется в подкожную ткань мужского хозяина мыши. Мы также опишем протокол для оценки гормонального канцерогенеза путем объединения подкожной гормон гранул имплантации с ксенотрансплантации рекомбинантов простаты клеток под почечную капсулу с ослабленным иммунитетом мышей. Кроме того, подкожный гормон осадок имплантации, в сочетании с почечной капсулы ксенотрансплантации ДГПЖ ткани, является полезным для лучшего понимания гормональной регуляции доброкачественной Простаели рост, и для тестирования новых методов лечения, направленных половых стероидных гормонов пути.
Introduction
Рак предстательной железы (протяжении) и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) значительные тяготы здоровья. PRCA является вторым наиболее распространенным солидный рак органов у мужчин и одной из ведущих причин онкологических заболеваний смерть 1. ДГПЖ является также широко распространена среди пожилых мужчин, и, по оценкам, что клинические проявления ДГПЖ, снижение симптомы мочевых путей (СНМП), повлияет на 50-90% мужчин 2. В то время как андрогены и эстрогены, как известно, играть важную роль в PRCA и ДГПЖ, наше понимание гормональных механизмов, лежащих в основе канцерогенеза и рост остается неполным 3,4. Простые и генетически податливые животные модели лежат в основе исследований, которые будут решать эти приоритеты в исследовании простаты. В гормонов отзывчивых заболеваний, таких как PRCA и ДГПЖ, использование подкожной, медленных гормонов релиз гранул, в изоляции или в сочетании с почечной капсулы ксенотрансплантации (передача клеток, тканей или органов от одного вида в другой) в immunocompromised хозяин мыши, обеспечивает простой и воспроизводимый метод изучения гормональной регуляции роста и канцерогенеза.
Подкожный гормон осадок имплантация является простым и воспроизводимым методика исследования гормональной регуляции канцерогенеза и доброкачественной роста в простате 5. Подкожной имплантации взрослых самцов мышей с 25 мг тестостерона (Т) и 2,5 мг 17β-эстрадиола (Е 2), вызывает увеличение в сыворотке E 2 и постепенное снижение Т, воссоздавая динамический гормональный фон старения мужчин 5,6. Кроме того, эта модель повторяет многие из клинических признаков ДГПЖ-СНМП 5,7. Альтернативные способы введения гормона включают введение устный / через зонд или внутрибрюшинного введения, которые вызывают стресс для грызуна, менее последовательны в реализации такого же количества препарата в течение долгого времени, и являются более трудоемкими, чем одноразовый хирургической имплантации. Другие подкожные режимы для чOrmone и / или доставки лекарств включают Silastic капсулы 8. В то время как у нас есть опыт работы с использованием Silastic капсул, сжатые гранулы выступает за их простоту использования и воспроизводимости. Кроме того, релиз темпы сжатых гормонов гранул лучше имитировать динамические половых стероидных гормонов соотношения, наблюдаемые в стареющих мужчин 5,7.
С развитием генной ослабленным иммунитетом мышей, многочисленные естественных условиях модельных систем в которых применяются методы ксенотрансплантации были разработаны для изучения широкого спектра нормальных и пораженных тканей. Есть несколько основных категорий ксенотрансплантации. Тканевые ксенотрансплантатов состоять из небольшой кусочек неповрежденной ткани, который может быть нормальным структура, злокачественная опухоль, или доброкачественной роста. Szot соавт. (2007) недавно подсветкой почечной капсулы ксенотрансплантации панкреатических островков 9. Aamdal соавт. (1985) описал капсулу почки ксенотрансплантации из 27 клеток рака человеком линий в имmunocompromised мышь проходит 10. Трансплантатов также может состоять из одной иммортализированной клеточной линии (раковой или не онкогенных), или может состоять из иммортализированной клеточной линии, в сочетании с клетками, выделенными из мезенхимы (клетка рекомбинантного трансплантата).
Мы выступаем ксенотрансплантации клеточных рекомбинантами исследовать соответствующие роли стромы и эпителия в развитии PRCA и ДГПЖ. Кунья и др.. (1980) был первым, кто сообщил, что, когда взрослых мышей эпителий мочевого пузыря сочетается с эмбрионального урогенитального синуса мезенхимы (UGM) и ксенотрансплантированной под капсулу почки самцов мышей хозяев, ткань развивается в структуры, напоминающие ацинусы простаты 11. Норман и др.. (1986) показали, что взрослые мыши предстательной железы эпителия протоков и UGM, в сочетании в тканевых рекомбинантами, пройти протоков роста и морфогенеза ветвления 12. Хейворд и др.. (1988) показали, что человеческий эпителий простаты реагирует на индуктивные плода мesenchyme аналогично 13. Гормональный модель канцерогенеза в простате, путем объединения увековечены предстательной железы человека линии эпителиальных клеток ДГПЖ-1 с UGM, было впервые сообщено Ван и др.. 14 (2001) и широко используется в нашей лаборатории 15. Эта модель хорошо подходит для понимания прогрессирования PRCA потому доброкачественной эпителий переходит в метастатической болезни, моделирования передовые PRCA у человека 5. Поскольку конкретные компоненты могут быть генетически манипулировать, клетка рекомбинантного прививка особенно полезна в качестве подхода для оценки стромальных-эпителиальных взаимодействий.
Другие сайты, подходящие для ксенотрансплантации являются внутрикожные, подкожные и Ортотопическая места 16. В зависимости от ткани и болезни процессе интерес, они могут быть подходящими альтернативные подходы. Для изучения простаты гормонального канцерогенеза и доброкачественной регуляции роста, мы выбираем почечной капсулысайт для ксенотрансплантации из-за его высоких трансплантата принять ставку, обильные кровоснабжение, и способность имплантировать большее количество ксенотрансплантаты в один ограниченном месте 16. Кроме того, гормональный манипуляция хост мыши, что приводит к атрофии предстательной железы ограничивает использование простаты ортотопической трансплантации 16.
Этот протокол описывает методы сжатого гормон / наркотиков производства пеллет и хирургической имплантации, а также почечной капсулы ксенотрансплантации из человеческих клеток простаты и тканевых трансплантатов. Вместе эти методы обеспечивают более чувствительного анализа, чтобы определить, является ли генетически модифицированные мыши более чувствительны к PRCA и / или ДГПЖ, чем инициирования контрольных штаммов. Ксенотрансплантации является мощным средством в естественных условиях оценке потенциала экспериментальных клеток для разработки гистологические и молекулярные особенности злокачественных опухолей, а также анализа на новых стратегий лечения для широкого спектра доброкачественных и злокачественных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка сжатого гормона / наркотиками Пелле
- Эта процедура должна быть сделано в области химической безопасности капотом, а носить лабораторный халат, перчатки, маску, защитные очки и шляпу. Для предотвращения перекрестного загрязнения, крайне важно, что осадок Оборудование для производства тщательно очищается 70% этанолом до и после изготовления каждого вида гранул.
- Использование аналитический масштаб и весят бумагу, измерить необходимое количество порошка гормона / наркотиков. Приблизительно 5% дополнительный материал рекомендуется для размещения потери во время прессования.
- Некоторые гормоны / наркотики требуют связующего или наполнителя, которая смешивается до производства пеллет. Например, чтобы изготовить 2,5 мг гранул из 17β-эстрадиола, объединить гормона с 22,5 мг холестерина, что приводит к 25 мг таблетки.
- Тщательно передачи в плашек, место под пресс и нажмите рычаг твердо вниз, чтобы сжать осадок. Используйте постоянное давление для поддержания постоянной поверхность являютсяк объему.
- Следующая обратного держатель штампа и нажмите на рычаг вниз, чтобы выпустить осадок.
- Осмотрите осадок на целостность и определить, если конечная масса находится в пределах желаемого диапазона. Допустимый диапазон составляет разница в конечной массы ± 5% (например, допустимый диапазон для 25 мг гранул является 23.8-26.3 мг).
- Пеллеты могут быть сделаны до операции и хранить (условия и продолжительность хранения зависит от стабильности гормона или лекарственного средства, используемого в производстве окатышей). Гормональные таблетки можно приобрести в качестве альтернативы для производства пеллет. Покупка пеллет позволяет избежать использования класса препаратов нелекарственных, так как они будут сформулированы и усугубляется.
2. Подготовка Сотовые рекомбинантных ксенотрансплантатов
- Урожай и культура первичной мыши мочеполовой мезенхимы (УГМ) стромальных клеток для менее 4 недель до собираются для подсчета.
- Культура увековечены простаты линии эпителиальных клеток в обычном мучитьсяионный и собирать для подсчета. В этом примере подготовки клеток рекомбинантных трансплантатов путем смешивания 100000 BPH-1 на эпителиальных клеток трансплантата с 250 000 UGM стромальных клеток на трансплантата в суспензии.
- Гранул клетки вместе и повторно приостанавливать в достаточно нейтрализовали 1 типа коллагена хвоста крысы, чтобы сделать необходимое количество трансплантатов, каждый в объеме 25 мкл до 50 мкл.
- Набор рекомбинантных трансплантатов при 37 ° С в течение 15 минут и затем покрывают питательной среды для хранения при 37 ° С в течение до 48 часов перед прививкой.
3. Подготовка тканей ксенотрансплантатов
- Поддерживать универсальных мер предосторожности для крови патогенов во время закупок тканей и хирургического вмешательства. После утверждения Экспертный совет организации и информированного согласия, получить свежую ткань простаты от хирургической резекции. Для изучения роста ДГПЖ, ткани могут быть собраны из трансуретральной резекции простаты или простых процедур простатэктомии. Первичные ксенотрансплантаты из PRCA или доброкачественной Простели ткань может быть получена из радикальной простатэктомии образцов.
- Магазин собирают ткань в изотонических буферных клеток массовой информации или физиологического раствора на льду. В зависимости от ткани и условий хранения, образцы могут храниться до 24 часов до приготовления тканевых трансплантатов. Обычная практика заключается в разделении образца на три части, с одной секции фиксированной в формалине и регулярно обработанного для гистологического исследования, одна часть быстро замораживали для молекулярного анализа и одна часть делится на ткани ксенотрансплантаты (1-3 мм в размерах).
4. Подготовка Fire полированного стекла пипетки
- Ношение защиты глаз, лабораторные пальто и термостойкие перчатки, место стекло пипетки Пастера наконечник в Бунзена горелки пламени примерно в 60 ° угла, чтобы начать.
- Держать постоянную, легкое движение в пипетку так, чтобы избежать горячих пятен.
- Ничья кончик тонко и пожарную для ногтей с целью того, чтобы быть слегка изогнутые конец с округлой, закрыты наконечник. 5. Подготовка инструментов и хирургической Люкс
- Автоклав все инструменты. До операции, проверять все документы, заботясь, чтобы сохранить стерильное поле.
- Настройка стерильную хирургическую область с впитывающие прокладки, рассечение рамки, анестезии носового конуса, хирургических инструментов и отопления лампы, направленной в сторону рабочей зоны. Для стерилизации инструментов в между мышами, prewarm шарик стерилизатор.
- Собрать и тест наркозный аппарат; весят газа поглотитель.
- Использование микроволновой печи, тепловые восковые колодки до 5 мин (с шагом 1 мин, разминание восковую площадку для объединения расплавленные и нерасплавленные воск) на 70-80%, пока все воск не равномерно таял. На ощупь, обеспечить площадку не слишком жарко и место под пустую клетку восстановления грызунов.
- Дон средства индивидуальной защиты для грызунов хирургических процедур, в том числе хирургической маской, капота, перчатки и платье.
- Все процедуры, связанные с научно-исследовательских животных следует проводить с одобрения институциональных уходу и использованию животных комитетов. До введения анестезии, наблюдать мышь, чтобы обеспечить здоровье и благополучие.
- Место мыши в камеру для индукции изофлурановой анестезии на 3-5%. Когда животное перестал двигаться и частота дыхания уменьшилась, трансфер в носовой конус в положении лежа, и поддержания анестезии в 1-3%.
- Если необходимо, используйте ножницы брить спину мыши. Это не требуется при использовании бестимусных голых (пи / пи) мышей.
- Приложите усилие для лямки расширенной задней ноги, чтобы оценить адекватность анестезии. Если мышь реагирует на давление, требуется больше времени для анестезии вступили в силу. При необходимости отрегулируйте анестезии поток немного для достижения адекватной анестезии.
- Когда мышь адекватно наркозом, дезинфицировать места операции с хирургическим йода раствор (Бетадин) с последующим70% спирта.
- Дон стерильные перчатки и платье; применять стерильные шторы в хирургическое сайте. Поднимите заднюю кожу с парой зубчатых щипцов, и используя грубые ножницы сделать 2-3 см спинной средней линии разрез.
- Использование тупые ножницы или зонд, отделить подлежащей дерме от стенки тела (по обе стороны от разреза двустороннего прививки или на одной стороне одностороннего прививки).
- Измените мышь в боковом положении, и определить местоположение почки, просмотрев почечной профиля через мышечной стенки. Применяя нежный ручной давление с большим и указательным пальцами на животе может помочь с визуализации внутренних органов.
- Использование тонких ножниц радужной оболочки глаза, и заботясь, чтобы избежать крупных сосудов и спинномозговых нервов, сделать 1 см разрез в стене параллельно тела к позвоночнику. Расширить этот разрез 1,5-2,0 см (чуть больше, чем длинной оси почки), осторожно открыв ножницы шире разместив их в начальной разрез.
- Экстериоризироваться почку, слегка надавливая вне мышечной стенки по обе стороны от почки с помощью указательным и большим пальцем. Школьный кожа края ниже экстериоризированного почки, которая будет опираться на стенки тела. В то время как почки выводили, поддержания гидратации почечной капсулы, применяя стерильный физиологический раствор.
- Использование тонких # 5 щипцы осторожно поднимите капсулу почки из паренхимы почки и с тонкой скальпелем, сделать мм разрез 2 -4 в капсуле. Размер разреза определяется размером трансплантата, но должно быть сведено к минимуму, чтобы поддерживать целостность капсулы.
- Манипулирование стеклянной пипетки Пастера, что была составлена тонкий и противопожарной полировка с закругленным закрытого конца капсулы в соответствии с касательной к поверхности почки. Аккуратно откройте небольшой карман капсулы для прививок, используя большую заботу, чтобы не повредить паренхимы почек.
- Разрез край капсулы почки поднимается с тонким пинцетом, и трансплантат Iвставляете в карман под капсулой с помощью огневой полировкой стеклянной пипетки. Несколько трансплантаты могут быть помещены под почечную капсулу и равномерно распределены на поверхности почек.
- Если в ходе трансплантации, капсула становится обезвоженной, она должна быть увлажнена с применением стерильного физиологического раствора.
- При прививке завершена, осторожно поднимите боковые стороны мышц стенки разреза заменить почку обратно в полость тела. Заметим, что трансплантаты не выскользнуть из-под капсулы.
- Закройте мышечной стенки с одним швом (4-0, FS-2 викрил шва). Хирургическая процедура может повторяться на противоположной почки путем перестановки мышь.
- Когда прививки завершена, мышь может претерпевать подкожной имплантации гранул в течение того же хирургического вмешательства (см. Протокол шаг 7).
- Использование зубчатых щипцов, совместите разрез кожи края и нанести 2-3 операционной раны клипы, чтобы закрыть разрез. Администрирование обезболивание (мы используем 5-10 мг / кг carprofан помощью подкожной инъекции) и поместите курсор в боковом лежачем положении в Восстановление клетке. Обеспечить поддержание температуры тела с теплом от лампы или грелку. Соблюдайте для полного восстановления мыши, которая должна произойти менее чем за 15 минут.
- Мыши должны соблюдаться в течение следующего 24 часов на признаки послеоперационной боли, кровотечения и / или другие осложнения. Регулярно проверяйте хирургический разрез на наличие признаков инфекции.
- Удалить раны клипы с хирургическим удалением рана клип устройства 7-14 дней после операции.
- Повторите шаги 6.1-6.5 от почечной капсулы ксенотрансплантации хирургическую процедуру.
- Поднимите заднюю кожу парой щипцов кожи, и используя грубые ножницы сделать 1-2 см спинной средней линии разрез.
- Использование тупые ножницы или зонд, отделить основные дермы от стенки тела в краниальном направлении.
- Использование щипцов кожи,осторожно поднимите черепной аспект разрез кожи, и проведение гормон осадок осторожно с прямыми, зубчатыми щипцами, вставьте шарик и выпустить на шиворот, в кармане, созданной с тупым зондом.
- Повторите шаги 6.18-6.20 от почечной капсулы ксенотрансплантации хирургическую процедуру. При выполнении подкожной гранул имплантации только, использовать 1 хирургическое клип раны, чтобы закрыть хирургический разрез.
6. Хирургическая процедура: Почечная капсула ксенотрансплантации
7. Хирургическая процедура: Подкожный Пелле Имплантация
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В зависимости от проверяемой гипотезы, почечной капсулы ксенотрансплантации ткани или клеток рекомбинантов могут быть выполнены по отдельности, либо в сочетании с подкожной имплантации гранул гормон. Схема гипотетического эксперимента, сочетающей почечную капсулу эксперимент ксенотрансплантации с подкожной имплантации гранул гормона проиллюстрировано на Рисунке 1. Разнообразные порошкообразных и / или кристаллических веществ могут быть использованы при изготовлении прессованных гранул с пресс-гранулятор. Рисунок 2 показывает 25 мг, 12 мг и 6 мг гормона сжатые гранулы.
На фиг.3 показан пример пожарной полированной стеклянной пипетки, используемой во время хирургической процедуры. Несколько проходов стеклянной пипетки Пастера через Бунзена пламени горелки привести к противопожарной полировка, закругленным кончиком, который используется для создания карман для трансплантатов под капсулу почки и манипулировать трансплантатов под капсулу почки.
ntent "> Как показано на фиг.4, ксенотрансплантатов первичные ткани от пациентов с ДГПЖ, дополненные экзогенного тестостерона (25 мг подкожно гранул), чтобы имитировать человеческое мужской гормональной среды, выживать и архитектура ткань сохраняется (рис. 4А). Кроме того, показано в Рисунок 4, почечная капсула прививка может быть использован для оценки гормонального канцерогенеза. Сотовые рекомбинантами содержащие доброкачественной эпителия предстательной железы (ДГПЖ-1) и индуктивный мочеполовой мезенхиму (UGM), выращенного в необработанных мышей образуют доброкачественные образования (рис. 4б). То же привитые, выращены в хост, который получил подкожные гормональные гранулы 25 мг T и 2,5 мг E 2 в течение четырех месяцев, развивается в рак простаты, который вторгается почечной капсулы (рис. 4в) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема почечной ксенотрансплантации капсулы и процедуры имплантации гранул. Почечная капсула ксенотрансплантации осуществляется через спинной средней линии подхода. В течение того же хирургической процедуры, мышь хирургическим путем имплантировали медленно выдел подкожной сжатого гормона и / или гранул препарата в области шеи шиворот области.
Рисунок 2. Примеры сжатых гормонов гранул, изготовленных с настоящим Протоколом. А. 12 мг гранул. Б. 6 мг гранул. С. 25 мг гранул.
Рисунок 3. Противопожарные полированного стекла пипетки Пастера. Готовое пипетки изогнута, с гладкой закругленным кончиком, пригодного для создания рябинахET для ксенотрансплантата под почечной капсулой. Пипетка также используется для манипулирования трансплантата под почечной капсулой.
Рисунок 4. Пример почечных ксенотрансплантатов капсулы. A. Ткань ксенотрансплантатов (стрелки) из человеческой ткани ДГПЖ выращивают в течение одного месяца под почечную капсулу обнаженной самца мыши. Хост мыши с добавлением 25 мг тестостерона гранул для имитации гормональной среды человеческого самца. B. Сотовые рекомбинантные ксенотрансплантатов (стрелки), содержащие простаты линии эпителиальных клеток человека (BPH-1) и индуктивный мочеполовой мезенхимы (UGM), полученных в соответствии с почек капсула голой мыши, которая не была имплантированного с подкожной гормона гранул в течение четырех месяцев. С. Сотовый рекомбинантный ксенотрансплантатных содержащей ДГПЖ-1 и UGM, выращенных под почечную капсулу голой мыши, которые также прошли субкожный осадок имплантация 25 мг тестостерона и 2,5 мг 17β-эстрадиола в течение четырех месяцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья и протокол изложил здесь описать производство сжатого гормона и / или гранул наркотиков и хирургическую процедуру для подкожного гранул имплантации мышей. В зависимости от вопроса исследования должны быть рассмотрены, эта методика может быть выполнена отдельно, или в сочетании с почечной капсулы ксенотрансплантации клеточных рекомбинантных простаты трансплантатов или тканевых ксенотрансплантатов предстательной железы, которые методики, широко используемые в исследовании предстательной железы 17-19. Взятые вместе, эти методы представляют собой мощное подход к изучению гормональной канцерогенез и регулирование доброкачественной роста в человека и мыши простаты.
Для производства пеллет прост для выполнения, легко воспроизводимым, и требует ограниченное оборудование. Он может быть применен в различных гормонов и лекарственных препаратов. Очень важно, чтобы выполнить эту технику в химической безопасности капотом, и носить соответствующие средства индивидуальной защиты. Для экспериментов, оценивающих простаты канцерогенеза Aй индукция мышиного инфравезикальной обструкции мы используем 25 мг Т и 2,5 мг E 2 5,7,15. Эти дозы выбраны потому, что они производят нужный в ответ естественных условиях и потому что они создают уровень гормонов в сыворотке крови, которые являются физиологически отношение к человеческих самцов с болезненного процесса интереса 6. Пелле формы позволяют несколько различных размеров гранул, которые будут изготовлены, мы обычно используют 25 мг гранул для оценки канцерогенеза и доброкачественные рост. Выбор размера гранул зависит от гипотезы должны быть рассмотрены, а также производства желаемого эффекта, при производстве желаемых уровней циркулирующих и продолжительности эксперимента. Если препарат или гормон сочетается со связующим веществом (например, холестерина) мы рекомендуем гомогенной смеси гормона и связующего.
В зависимости от исследования, подкожной имплантации гранул могут быть выполнены следующие кастрации мужского хоста 15. По нашему опыту,имплантация 25 мг T вызывает обратной торможение гипоталамо-гипофизарно-яичек оси, подавляя секрецию эндогенного. Поэтому мы решили сравнить мышей, получавших 25 мг T для имитации андрогенной среды человеческого мужского на неповрежденных но необработанных мужчин, с эндогенным T секреции поддерживается. Мы обычно не используют множество кастрировать из-за атрофический ответ предстательной железы и простаты ксенотрансплантаты к андрогенов.
Этот протокол также описывает создание кусок специализированного оборудования для почечной капсулы ксенотрансплантации, пожарно-полированного стекла пипетки Пастера. Это может быть легко выполнена с оборудованием, присутствующей в большинстве лабораторий, в результате чего индивидуальные хирургического инструмента, чем может быть изготовлен и стерилизуют перед использованием в хирургической процедуры. Ношение индивидуальной защиты важно для обеспечения безопасности персонала при создании огневой полировкой стеклянной пипетки.
До embarkiнг на любом из хирургических процедур, описанных в этом протоколе, все методы должны быть рассмотрены и одобрены институциональной уходу и использованию животных комитета. Хирургические процедуры, проводимые на грызунах требует обучения и практики в обоих технических аспектов процедуры, а также принципы и практику асептики. Для введения в оборудования и техники важного в этих процедурах мы рекомендуем персонал просмотреть видео рукопись недавно сообщили Prichett-Corning и др.. (2011) 20. Мы также рекомендуем все сотрудники получают практическую подготовку в грызунов хирургических процедур и асептики.
В нашей лаборатории, эти процедуры, как правило, осуществляется с двух сотрудников. Хирургическая помощник управляет анестезии, отмечает животных во время восстановления, помогает хирургу нестерильных аспектов процедуры и документы все процедуры. Хирург поддерживает стерильное поле, управляет обезболивание Aй выполняет хирургические процедуры, описанные в данном протоколе. При правильном планировании и подготовке, хирургической процедуры подкожного гормон гранул имплантации является простым и легким для выполнения.
Есть несколько экспериментальных соображений дизайна для клеток рекомбинантного ксенотрансплантации. Как и с любым экспериментов, использующих линии иммортализованных клеток, загрязнение важно свести к минимуму и обнаружить. Для экспериментов с использованием ДГПЖ-1 клеточные линии, мы рекомендуем низкое число проход (менее 25). Для контроля воздействия стромы, мы используем трансплантаты, содержащие только ДГПЖ-1 клетки для одной почкой и трансплантатов, содержащих BPH-1 и UGM на контралатеральной почки. Для экспериментов, направленных на решение гормональный канцерогенез, мы обычно имеют необработанную состояние управления (мышь не имплантировали гранулы, или имплантируется с холестерина гранулы). Положительные контроли (хозяин мыши имплантировали T + E 2 пеллет) одинаково важны при оценке других условий тхат может способствовать канцерогенез с этой модельной системе. В зависимости от вопроса исследования должны быть рассмотрены, продолжительность гранул имплантации и / или роста ксенотрансплантата может варьироваться от нескольких недель до четырех месяцев; для экспериментов планируется превышать четырех месяцев, мы рекомендуем дополнительное гранул имплантации поддерживать экзогенные гормональные уровни. Для экспериментов с доброкачественные ткани ксенотрансплантаты простаты, важно, чтобы носить средства личной защиты и поддержания универсальных мер предосторожности для крови патогенов. Свежесобранные ткань может храниться до ксенотрансплантации в течение 12-72 часов.
Хирургический метод почечной капсулы ксенотрансплантации требует планирования, практику и некоторые ловкость рук. Минимизация продолжительность хирургического вмешательства, поддерживая температуру тела и тщательного хирургическую технику может смягчить периоперационный смертности и хирургические осложнения. Шанс периоперационной смерти в нашем опыте увеличивается с продолжительностью суrgical процедура, по этой причине мы ограничиваем хирургическую процедуру, чтобы не более чем на 20-25 мин. Использование нагревательной лампой и подогретого воска площадку во время операции и восстановления идеально подходит для поддержания температуры тела. Регулярное послеоперационный уход является еще одним важным аспектом успеха этой техники. Мыши должны соблюдаться во время наркоза, и на следующий день после операции по поводу признаков боли и страданий. Администрирование соответствующий обезболивание, чтобы минимизировать пост-процессуальной боль и страдания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Ricke прошлом и настоящем. Мы благодарим Calvin Паттен-младший, DVM и Брижит Raabe, DVM, за полезные замечания относительно протокола. Мы хотели бы выразить признательность за NIDDK, NCI, и NIEHS за их финансовую поддержку для этих исследований: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN является стажером в программы обучения ученый-медик из Университета Рочестера финансируется NIH T32 GM07356; NIH под Рут Л. Kirschstein Национальной Исследовательской службы Award F30DK093173 также поддерживает этот проект. CDV поддерживается T32CA157322 и ABT поддерживается T32ES007015 в Университете Висконсин-Мэдисон. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального Института общей медицинских наук или NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
