Summary
Vi beskriver framställningen av komprimerade hormon pelletar samt subkutan kirurgisk implantering i möss. Denna strategi kan kombineras med tillväxten av cell-och vävnads implanterad under njurkapseln i atymiska nakna möss för att utvärdera hormonell cancer och reglering av godartad prostatatillväxt.
Abstract
Nya behandlingar för två vanliga prostatasjukdomar, prostatacancer (PRCA) och godartad prostataförstoring (BPH), beror i hög grad på experiment utvärderar deras hormonella reglering. Sex steroidhormoner (främst androgener och östrogener) är viktiga i PRCA och BPH, vi sondera deras respektive roller i att framkalla prostatatillväxt och cancer i möss med experiment med komprimerade hormon pellets. Hormon-och / eller drog pellets lätt tillverkas med en pelletspress, och inopererade i den subkutana vävnaden av den manliga musen värd. Vi beskriver också ett protokoll för utvärdering av hormonell cancer genom att kombinera subkutana hormonpellets implantation med Xenografting prostatacell rekombinanter under njurkapseln av nedsatt immunförsvar möss. Dessutom subkutan hormon pellet implantering i kombination med njurkapseln xenografting av BPH vävnad, är användbar för att bättre förstå den hormonella regleringen av godartad proståt tillväxten, och att testa nya behandlingar riktade könssteroidhormon vägar.
Introduction
Prostatacancer (PRCA) och godartad prostataförstoring (BPH) är betydande hälsoproblem. PRCA är den näst vanligaste solida organ cancer hos män och den främsta orsaken till cancerrelaterad död 1. BPH är också mycket utbrett bland äldre män, och det beräknas att den kliniska manifestationen av BPH, nedre urinvägssymptom (LUTS), kommer att påverka 50-90% av män 2. Medan androgener och östrogener är kända för att vara viktiga i PRCA och BPH, vår förståelse av de hormonella mekanismer som ligger bakom cancer och tillväxten är fortfarande ofullständig 3,4. Enkla och genetiskt tractable djurmodeller bygga de studier som kommer att ta upp dessa prioriteringar i prostata forskning. I hormon lyhörd sjukdomar som PRCA och BPH, användning av subkutana, långsam frisättning hormon pellets, ensamt eller i kombination med njurkapseln xenografting (överföring av celler, vävnader eller organ från en art till en annan) i immunocompromised mus värd, ger en enkel och reproducerbar metod för att studera hormonell reglering av tillväxt och cancer.
Subkutan hormon pelleten implantation är en enkel och reproducerbar teknik för att studera den hormonella regleringen av carcinogenes och godartad tillväxt i prostatan 5. Subkutan implantation av vuxna manliga möss med 25 mg testosteron (T) och 2,5 mg 17β-östradiol (E2), orsakar en ökning av serum E 2 och gradvis minskning av T, återskapa den dynamiska hormonella miljön i åldrande män 5,6. Dessutom rekapitulerar denna modell många av de kliniska funktionerna i BPH-LUTS 5,7. Alternativa metoder för hormon administration innefattar oral / sondmatning administration eller intraperitoneal injektion, som orsakar lidande hos gnagare, mindre konsekventa i att leverera samma mängd läkemedel över tid, och är mer arbetsintensiv än en engångs kirurgisk implantation. Andra subkutana lägen för hormone och / eller läkemedelstillförsel inkluderar Silastic kapslar 8. Medan vi har också erfarenhet av användning av Silastic kapslar, pressas pellets gynnad för sin användarvänlighet och reproducerbarhet. Dessutom frisättningshastigheter av komprimerade hormon pellets bättre efterlikna de dynamiska könssteroidhormonförhållanden som observerats i åldrande män 5,7.
Eftersom utvecklingen av genetiskt immunsupprimerade möss har otaliga in vivo modellsystem som inkorporerar xenografting tekniker utvecklats för studier av ett stort antal olika normala och sjuka vävnader. Det finns flera grundläggande kategorier av xenografting. Vävnads xenotransplantat bestå av en liten bit av intakt vävnad, som kan vara en normal struktur, malign tumör, eller godartad tillväxt. Szot et al. (2007) har nyligen upplyst njurkapseln Xenografting pankreasöar 9. Aamdal et al. (1985) beskrev njurkapseln xenografting av 27 humana cancercellinjer i immunocompromised mus är värd 10. Grafts kan också vara sammansatt av en enda odödliggjord cellinje (cancerösa eller icke-tumorogen), eller kan bestå av en immortaliserad cellinje kombineras med celler isolerade från mesenkym (cell rekombinant graft).
Vi föredrar Xenografting cell rekombinanter att söka respektive roller stroma och epitel i utvecklingen av PRCA och BPH. Cunha et al. (1980) var först med att rapportera att när vuxna murina blåsans epitel kombineras med embryonala urogenital sinus mesenkymet (UGM) och xenografted under njurkapseln hos hanmöss värdar, utvecklar vävnaden i strukturer som liknar prostata acini 11. Norman et al. (1986) visade att vuxen mus prostata duktal epitel och UGM, när de kombineras i vävnads rekombinanter, genomgå duktal tillväxt och förgrening morfogenes 12. Hayward et al. (1988) visade att den mänskliga prostata epitel reagerar på induktiva foster mesenchyme på ett liknande sätt 13. En hormonell modell av cancer i prostata, genom att kombinera den förevigat mänskliga prostata epitelcellinje BPH-1 med UGM, rapporterades först av Wang et al. 14 (2001) och har använts i stor utsträckning i vårt laboratorium 15. Denna modell lämpar sig väl för att förstå PRCA progression eftersom godartad prostata epitel förvandlas till metastatisk sjukdom, modellering avancerad PRCA hos människor 5. Eftersom specifika komponenter kan vara genetiskt manipulerade, är cell rekombinant ympning särskilt användbar som en metod för att utvärdera stromal-epithelial interaktioner.
Andra platser som är lämpliga för xenografting är intradermal, subkutan och orthotopic platser 16. Beroende på vävnaden och sjukdomsprocess av intresse, kan dessa vara lämpliga alternativa metoder. För studier av prostata hormonell cancer och godartad tillväxt reglering, väljer vi den njurkapselnplats för Xenografting grund av dess högre graft tar ränta, riklig blodtillförsel, och förmåga att implantera ett större antal xenografter i en begränsad plats 16. Dessutom hormonell manipulering av värdmusen som resulterar i prostatisk atrofi begränsar användningen av prostata orthotopic ympning 16.
Detta protokoll beskriver tekniker för komprimerad hormon / drogpelletstillverkning och kirurgisk implantation, liksom njurkapseln Xenografting mänskliga prostata cell-och vävnadstransplantat. Tillsammans ger dessa tekniker ger en känslig analys för att fastställa om en genetiskt modifierad mus är mer mottagliga för PRCA och / eller BPH initiering än kontrollstammar. Xenografting är en kraftfull teknik för in vivo-utvärdering av potentialen av experimentella celler att utveckla histologiska och molekylära egenskaperna hos malignitet, samt en analys för nya behandlingsstrategier för en bred variation av benigna och maligna sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av komprimerad hormon / Drug Pellet
- Detta förfarande bör göras i en kemisk säkerhetskåpa iklädd en laboratorierock, handskar, mask, skyddsglasögon och motorhuv. För att förhindra korskontaminering, är det viktigt att pellets gör utrustning rengörs grundligt med 70% etanol före och efter tillverkningen av varje typ av pellet.
- Med användning av en analytisk skala och väga papper, mäta önskade mängden av hormon / läkemedelspulver. Ungefär 5% extra material rekommenderas för att rymma förlust under pressning.
- Vissa hormoner / läkemedel kräver ett bindemedel eller fyllmedel, som blandas före pelletstillverkning. Till exempel, för att tillverka en 2,5 mg pellet av 17β-östradiol, kombinera hormonet med 22,5 mg kolesterol, vilket resulterar i en 25 mg pellet.
- Försiktigt överföra till pressbackar, plats under press och tryck spaken stadigt nedåt för att komprimera pellets. Använd konsekvent tryck för att hålla konstant yta ären i förhållande till volymen.
- Nästa vända matrishållaren och tryck ner spaken igen för att släppa pelleten.
- Inspektera pellets för integritet och avgöra om slut massa är inom önskat område. Ett acceptabelt intervall är en skillnad i den slutliga massan ± 5% (till exempel, är ett godtagbart intervall för en 25 mg pellet 23,8-26,3 mg).
- Pellets kan göras före operation och lagras (villkor och längd lagring beror på stabiliteten i hormon eller läkemedel som används i pelletstillverkning). Hormon pellets kan köpas som ett alternativ till pelletstillverkning. Vid köp av pelletar undviker användning av icke-farmaceutisk kvalitet läkemedel eftersom de kommer att formuleras och blandas.
2. Beredning av cell rekombinanta implanterad
- Skörd och kultur primär mus urogenitala mesenkym (UGM) stromaceller för mindre än 4 veckor innan de samlas in för räkning.
- Kultur immortaliserad prostate epithelial cellinjer på vanligt fashjon och samla för räkning. I detta exempel, framställa cell rekombinanta transplantat genom blandning 100000 BPH-1 epitelceller per transplantat med 250000 UGM stromala celler per transplantat i suspension.
- Pellets celler tillsammans och slamma i tillräckligt neutraliserad typ ett råttsvanskollagen för att göra önskade antalet grafter, var och en i en volym av 25 | il till 50 | il.
- Ställ rekombinanta transplantat vid 37 ° C under 15 minuter och sedan täcka med tillväxtmedium för lagring vid 37 ° C i upp till 48 timmar före ympning.
3. Beredning av vävnads implanterad
- Behåll universella försiktighetsåtgärder för blodburna patogener under vävnads upphandling och kirurgiska ingrepp. Efter granskningsnämnder godkännande och informerat samtycke, få frisk prostatavävnad från kirurgisk resektion. För studier på BPH tillväxt, kan vävnader skördas från transuretral resektion av prostata eller enkla prostatektomi förfaranden. Primära xenografter av PRCA eller godartad proståt vävnad kan erhållas från radikal prostatektomi prover.
- Affär skördad vävnad i isotoniska buffrade cell media eller vanlig saltlösning på is. Beroende på vävnads-och förvaringsförhållanden, kan proverna förvaras upp 24 timmar före beredning av vävnadstransplantat. Vanlig praxis är att dela upp provet i tre delar, med ett avsnitt fixerades i formalin och rutinmässigt behandlas för histologi, snap ett stycke frusen för molekylär analys och en bit vidare in i vävnads xenografter (1-3 mm i storlek).
4. Beredning av Fire Polished glaspipett
- Att bära ögonskydd, laboratorierock och värmebeständiga handskar, plats glas Pasteur pipettspetsen i bunsenbrännare lågan vid ca 60 ° vinkel för att starta.
- Håll en konstant, liten rörelse till pipetten för att undvika heta fläckar.
- Rita spetsen tunt och brand polera med målet att vara en lätt böjd ände med en rundad, sluten spets. 5. Beredning av instrument och kirurgisk svit
- Autoklavera alla instrument. Före operation, inspektera alla instrument, för att bevara sterilt område.
- Inrätta sterila operationsområdet med absorberande kuddar, dissektion omfattning, anestesi noskon, kirurgiska instrument och värmelampa riktad mot arbetsområdet. För att sterilisera verktyg mellan möss, Förvärm pärla autoklav.
- Sätt ihop och testa anestesiapparater, väga gas renhållare.
- Använda mikrovågsugn, värme vax kuddar för upp till 5 minuter (i steg om 1 min, knådning vaxet pad för att kombinera smält och osmält vax) på 70-80% effekt, tills allt vaxet jämnt smält. Genom beröring, se till att dynan är inte för varmt och placera under den tomma gnagare återhämtning bur.
- Don personlig skyddsutrustning för gnagare kirurgiska ingrepp, inklusive kirurgisk mask, hätta, handskar och kappa.
- Alla förfaranden som involverar försöksdjur bör utföras med godkännande av Institutional Animal Care och användning kommittéer. Före induktion av anestesi, observera musen för att säkerställa hälsa och välbefinnande.
- Placera musen in i kammaren för induktion av isoflurananestesi på 3-5%. När djuret har slutat röra sig och andningsfrekvens har minskat, överföring till noskon i liggande läge, och underhålla anestesi på 1-3%.
- Vid behov använder Clippers att raka baksidan av musen. Detta behövs ej vid användning atymiska nakna (nu / nu)-möss.
- Applicera ett tryck på bandet av den förlängda bakfoten att bedöma lämpligheten av anestesi. Om musen reagerar på tryck, det behövs mer tid för att bedövningen ska börja gälla. Vid behov, justera anestesi flöde något för att uppnå adekvat anestesi.
- När musen är tillräckligt sövd, desinficera operationsområdet med kirurgisk jod (Betadine) lösning följt av70% alkohol.
- Don sterila handskar och klänning, tillämpa sterila draperier till operationsområdet. Lyft tillbaka huden med ett par tandade pincett, och med hjälp av de grova sax göra ett 2-3 cm dorsal mittlinjeincision.
- Använda trubbig sax eller en sond, separera de underliggande dermis från kroppen väggen (på båda sidor av snittet för bilaterala ympning eller på ena sidan för ensidig ympning).
- Placera musen i lateral position, och identifiera lokaliseringen av njuren genom att betrakta njurprofilen genom muskeln väggen. Ett lätt manuellt tryck med tummen och pekfingret på magen kan hjälpa till med att visualisera inre organ.
- Använda fina iris sax, och i syfte att undvika stora fartyg och spinal nerver, gör en 1 cm snitt i kroppsväggen parallellt med ryggraden. Bredda detta snitt till 1,5-2,0 cm (något längre än den långa axeln av njuren) genom att försiktigt öppna saxen bredare efter att placera dem i det första snittet.
- Exteriorize njuren genom ett lätt tryck utanför muskeln väggen på endera sidan av njuren med hjälp av pekfinger och tumme. Tuck huden kanterna nedanför exterioriserad njure, som kommer att vila på kroppsväggen. Även njurarna är exterioriseras, upprätthålla hydrering av njurkapseln genom att tillämpa steril koksaltlösning.
- Med fin # 5 pincett lyft försiktigt njurkapseln från parenkymet av njuren och med en fin skalpell görs en 2 -4 mm snitt i kapseln. Storleken på snittet bestäms av storleken på det transplantat, men bör minimeras för att upprätthålla integriteten i kapseln.
- Manipulera ett glas pasteurpipett som tagits tunn och brand-polerad med en avrundad sluten ände under kapseln tangentiell till ytan av njuren. Öppna försiktigt en liten kapsel ficka för transplantaten, med hjälp av stor omsorg att inte skada njurarna parenkymet.
- Den skurna kanten av njurkapseln lyfts med fin pincett, och transplantatet is som sätts in i fickan under kapseln med användning av eld-polerat glaspipett. Flera transplantat kan placeras under njurkapseln och jämnt fördelade på njurytan.
- Om under loppet av ympning, blir kapseln dehydratiserade, bör den fuktas genom att tillämpa steril saltlösning.
- Vid ympning är klar, försiktigt lyfta sidorna av muskelväggen snitt för att ersätta njuren tillbaka in i kroppshålan. Observera att transplantaten inte glider ut från under kapseln.
- Stäng muskelväggen med en enda sutur (4-0, FS-2 Vicryl sutur). Den kirurgiska proceduren kan upprepas på den kontralaterala njuren genom att flytta musen.
- Vid ympning är klar, kan musen genomgå subkutana pellets implantation under samma kirurgiska ingrepp (se protokoll steg 7).
- Använda tandade pincett, rikta in huden snittkanterna och applicera 2-3 kirurgiska sår klipp för att stänga snittet. Administrera analgesi (vi använder 5-10 mg / kg carprofsv använda en subkutan injektion) och placera musen i stupa sidoläge i återhämtningen buren. Se till bibehållande av kroppstemperatur med värme från en lampa eller en värmedyna. Observera att fullständig återhämtning av musen, vilket bör ske på mindre än 15 minuter.
- Möss bör observeras för nästa 24 timmar efter tecken på postoperativ smärta, blödningar och / eller andra komplikationer. Kontrollera regelbundet kirurgiska snittet för tecken på infektion.
- Avlägsna sårklämmor med operationssåret klipp avskiljningsanordning 7-14 dagar efter operationen.
- Upprepa steg från 6,1 till 6,5 från njurkapseln Xenografting kirurgiska ingrepp.
- Lyft tillbaka huden med ett par av hud pincett, och med hjälp av de grova sax göra ett 1-2 cm dorsal mittlinjeincision.
- Använda trubbig sax eller en sond, separera de underliggande dermis från kroppen väggen i en kranial riktning.
- Använda hud pincett,försiktigt lyfta den kraniala aspekten av snittet huden, och hålla hormonet pelleten försiktigt med raka, tandade pincett, sätt in pellets och släpp på nackskinnet, i fickan som du skapat med den trubbiga sonden.
- Upprepa steg från 6,18 till 6,20 från njurkapseln Xenografting kirurgiska ingrepp. Om du utför subkutana pellets implantation endast använder 1 operationssåret klipp för att stänga det kirurgiska ingreppet.
6. Kirurgisk Tillvägagångssätt: Renal Capsule Xenografting
7. Kirurgisk Tillvägagångssätt: Subkutan Pellet Implantation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beroende på vilken hypotes som skall testas, kan utföras njurkapseln xenografting av vävnads-eller cell rekombinanter isolerat, eller i kombination med subkutan hormon pelleten implantation. En schematisk bild av ett hypotetiskt experiment kombinerar njurkapseln xenografting experiment med subkutan hormon pelleten implantation illustreras i figur 1. En mängd olika pulverformiga och / eller kristallina substanser kan användas vid framställning av sammanpressade pelletar med pelletspressen figur. 2 visar 25 mg, 12 mg och 6 mg komprimerade hormon pellets.
Figur 3 visar ett exempel på den brand polerat glaspipett användas under den kirurgiska proceduren. Flera passager av ett glas pasteurpipett genom bunsenbrännarens låga leda till brand-polerad, rundad spets som används för att skapa en ficka för transplantat under njurkapseln och att manipulera transplantat under njurkapseln.
ntent "> Såsom visas i fig. 4, primära vävnads xenotransplantat från patienter med BPH, kompletterat med exogent testosteron (25 mg subkutan pellet) för att simulera den manlig mänsklig hormonella miljö, överleva och vävnadsarkitektur bevaras (figur 4A). Även visat i Figur 4, kan njurkapseln ympning kan användas för att utvärdera hormonell carcinogenes. Cell rekombinanter innehållande godartad prostata epitel (BPH-1) och induktiv urogenitala mesenkym (UGM) odlas i obehandlade möss bildar benigna utväxter (figur 4b). Samma ymp, som odlas i en värd som mottog subkutana hormon pelletar av 25 mg T och 2,5 mg E 2 i fyra månader, utvecklas till prostatakarcinom som invaderar den renala kapseln (Figur 4C) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk bild av njurkapseln xenografting och pelleten implanteringsproceduren. Njurkapseln xenografting sker via en ryggens mittlinje tillvägagångssätt. Under samma kirurgiska ingrepp, är musen inopererade med långsam frisättning subkutan komprimerad hormon-och / eller drog pellets i nacken nackskinnet regionen.
Figur 2. Exempel på komprimerade hormon pellets som tillverkas med det nuvarande protokollet. A. 12 mg pellet. B. 6 mg pellet. C. 25 mg pellet.
Figur 3. Fire-polerat glas pasteurpipett. Det färdiga pipett är krökt, med en slät rundad spets lämplig för att skapa en fickaet för xenotransplantat under njurkapseln. Pipetten används också för att manipulera transplantatet under njurkapseln.
Figur 4. Exempel på njurkapseln xenotransplantat. A. Vävnad xenografter (pilspetsar) av human BPH vävnad odlas under en månad under njurkapseln hos en naken manlig mus. Musen värd är kompletterad med 25 mg testosteron pelleten för att simulera den hormonella miljön i den mänskliga manliga. B. Cell rekombinanta xenografter (pilspetsar) innehållande human prostatisk epitelial cellinje (BPH-1) och induktiv urogenitala mesenkym (UGM) som odlats under njur kapsel av en naken mus som inte implanterades med en subkutan hormon pelleten under fyra månader. C. Cell rekombinant xenograft innehållande BPH-1 och UGM, som odlas under njurkapseln hos en naken mus som också genomgick subkutan pellets implantation av 25 mg testosteron och 2,5 mg 17β-östradiol i fyra månader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument och protokoll som beskrivs häri beskriver tillverkningen av komprimerad hormon-och / eller drog pellets, och det kirurgiska ingreppet för subkutan pellets implantation av möss. Beroende på forskningsfrågan tas upp, kan denna teknik utföras var för sig, eller i kombination med njurkapseln Xenografting prostatacell rekombinanta transplantat eller prostatavävnad implanterad, som är tekniker som ofta används i prostata forskning 17-19. Sammantaget ger dessa tekniker erbjuder en kraftfull metod för att studera hormonell cancer och reglering av godartad tillväxt i den mänskliga och mus prostata.
Pelletstillverkning är enkel att utföra, lätt reproducerbar, och kräver begränsad utrustning. Den kan tillämpas för olika hormon-och läkemedelsberedningar. Det är viktigt att utföra denna teknik i en kemisk säkerhetskåpa, och bära lämplig personlig skyddsutrustning. För experiment bedömer prostata cancer ennd induktion av murina försvårad tömning av blåsan vi använder 25 mg T och 2,5 mg E 2 5,7,15. Dessa doser är utvalda för att de producerar den önskade in vivo-svar och att de skapar serum hormonnivåer som är fysiologiskt relevant för mänskliga män med sjukdomen processen intresse 6. Pellets formar tillåter flera olika storlekar av pellets som ska tillverkas, vi använder vanligtvis 25 mg pellets för utvärdering av cancer och godartad tillväxt. Val av pelletstorlek beror på den hypotes som skall behandlas, såväl som produktion av en önskad effekt, produktion av önskade cirkulerande nivåerna och varaktigheten av försöket. Om läkemedlet eller hormonet är kombinerat med ett bindemedel (t ex kolesterol) rekommenderar vi att en homogen blandning av hormon och bindemedel.
Beroende på studien, kan subkutana pellets implantation genomföras följande kastrering av manliga värd 15. Enligt vår erfarenhetimplantation av 25 mg T orsakar återkoppling hämning av hypotalamus-hypofys-testikel-axeln, hämmar endogen sekretion. Därför väljer vi att jämföra möss som behandlats med 25 mg T för att simulera den androgena miljön av den mänskliga hane till intakta men obehandlade män, med endogen T sekre bibehålls. Vi har inte rutinmässigt utnyttjar en kastrations värd på grund av atrofisk svaret hos prostata och prostata xenotransplantat till androgentillbakadragande.
Detta protokoll beskriver också skapandet av en bit av specialiserad utrustning för njurkapseln xenografting, brand-polerat glas Pasteur pipett. Detta kan enkelt utföras med utrustning närvarande i de flesta laboratorier, vilket resulterar i en anpassad kirurgiskt instrument än vad som kan tillverkas och steriliseras före användning i den kirurgiska proceduren. Att bära personlig skyddsutrustning är viktigt att garantera personalens säkerhet när du skapar eld-polerat glas pipett.
Före embarking på någon av de kirurgiska procedurer som beskrivs i detta protokoll, ska alla tekniker granskas och godkännas av Institutional Animal Care och användning kommittén. Kirurgiska ingrepp i gnagare kräver utbildning och praktik i både de tekniska aspekterna av förfarandet, liksom de principer och praxis av aseptisk teknik. För en introduktion till den utrustning och teknik viktiga i dessa förfaranden rekommenderar vi personalen visa video manuskript nyligen rapporterades av Prichett-Corning et al. (2011) 20. Vi rekommenderar även all personal får praktisk utbildning i gnagare kirurgiska ingrepp och aseptisk teknik.
I vårt laboratorium, är dessa förfaranden vanligen utförs med två anställda. Den kirurgiska assistent administrerar anestesi, konstaterar djur under återhämtning, bistår kirurgen med icke-sterila aspekter av förfarandet och dokumenterar alla förfaranden. Kirurgen bibehåller det sterila området, administrerar smärtlindring and utför kirurgiska procedurer som beskrivs i detta protokoll. Med rätt planering och utbildning, är enkel och lätt att utföra kirurgiska ingrepp av subkutana hormonpellets implantation.
Det finns flera experimentella design överväganden för cell rekombinant xenografting. Som med alla experiment använder odödliga cellinjer, är föroreningar viktigt att minimera och upptäcka. För försök med BPH-1-cellinjer, rekommenderar vi ett lågt passagenummer (mindre än 25). För att kontrollera för effekter av stroma, vi använder transplantat innehållande enbart BPH-1-celler för en njure och transplantat innehåller BPH-1 och UGM på den kontralaterala njuren. För experiment som syftar till att ta itu med hormonell cancer, har vi normalt en obehandlad kontrollgrupp (mus är implanteras med en pellet, eller implanteras med en kolesterolpellet). Positiva kontroller (värd musen implanteras med T + E 2 pellets) är lika viktiga vid utvärdering av andra förhållanden that kan främja cancer med detta modellsystem. Beroende på forskningsfråga som skall behandlas, kan tidsåtgången för pellets implantation och / eller xenograft tillväxt allt från flera veckor till fyra månader, för experiment planeras att överstiga fyra månader, rekommenderar vi extra pellets implantation för att upprätthålla exogena hormonnivåer. För experiment med godartad prostatavävnad implanterad, är det viktigt att ha ordentlig personlig skyddsutrustning och upprätthålla universella försiktighetsåtgärder för blodburna patogener. Nyskördade vävnaden kan lagras före Xenografting efter 12-72 timmar.
Den kirurgiska tekniken för njurkapseln xenografting kräver planering, praktik och en del fingerfärdighet. Minimera den tid som det kirurgiska ingreppet, upprätthålla kroppstemperaturen och noggrann kirurgisk teknik kan minska perioperativ dödlighet och kirurgiska komplikationer. Chansen att perioperativ död i vår erfarenhet ökar med varaktighet surgical förfarande, av den anledningen att vi begränsar det kirurgiska ingreppet för att inte längre än 20-25 min. Användning av en värmelampa och värmas vax pad under operation och återhämtning är idealisk för att upprätthålla kroppstemperaturen. Rutinpostoperativ vård är en annan viktig aspekt av framgång med denna teknik. Möss bör observeras under anestesi återhämtning, och dagen efter operationen för tecken på smärta och ångest. Administrera lämplig smärtlindring för att minimera post-processuella smärta och ångest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla medlemmar i Ricke labbet, förr och nu. Vi tackar Calvin Patten, Jr, DVM och Brigitte Raabe, DVM, för hjälp synpunkter på protokollet. Vi vill tacka för den NIDDK, NCI, och NIEHS för sitt ekonomiska stöd till dessa studier: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN är en praktikant i Medicinsk Scientist Training Program vid University of Rochester som finansieras av NIH T32 GM07356, NIH enligt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 stöder också projektet. CDV stöds av T32CA157322 och ABT stöds av T32ES007015 vid University of Wisconsin-Madison. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of General medicinska vetenskaper eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
