Summary
Bu farelere, sıkıştırılmış hormon peletlerin üretimi, hem de deri altından cerrahi implantasyon açıklar. Bu strateji, hormonal karsinojenezi ve iyi huylu prostat büyümesi düzenleme değerlendirmek için atimik çıplak farelerin böbrek kapsülünün altına hücre ve doku senograflarının büyümesi ile kombine edilebilir.
Abstract
Iki yaygın prostat hastalıkları, prostat kanseri (SKHA) ve benign prostat hiperplazisi (BPH) için yeni tedaviler, hormonal düzenlemeyi değerlendiren deneyler sıkı sıkıya bağlıdır. Seks steroid hormonlar (özellikle androjenler ve östrojenler) SKHA ve BPH önemli olan, biz sıkıştırılmış hormon granül kullanarak deneyler ile farelerde prostat büyümesi ve karsinojenezi uyaran kendi rollerini prob. Hormon ve / veya ilaç topakları kolaylıkla topak pres ile imal edilmiştir ve cerrahi olarak erkek fare konağın deri altı doku içine implante edilir. Ayrıca bağışıklık sistemi farelerinin böbrek kapsülü altında prostat hücre yeniden bileşenler Xenografting ile deri altından hormon topak implantasyonu birleştirerek hormonal kanser değerlendirilmesi için bir protokol açıklar. Ayrıca, deri altına topak implantasyonu hormon, BPH dokusunun renal kapsül Xenografting ile kombinasyon halinde, daha iyi huylu prost hormonal düzenleme anlaşılması için yararlıdırbüyüme yedik ve seks steroid hormon yolları hedef yeni tedavilerin test etmek.
Introduction
Prostat kanseri (SKHA) ve benign prostat hiperplazisi (BPH) önemli sağlık yük vardır. SKHA erkeklerde ikinci en sık görülen solid organ kanseri ve ölüme 1 ilgili kanser önde gelen nedenidir. BPH de yaşlı erkekler arasında son derece yaygın olduğunu ve BPH klinik bulgusu, alt üriner sistem semptomları (AÜSS), erkeklerin 2% 50-90 etkileyeceği tahmin edilmektedir. Androjenler ve östrojenler, SKHA ve BPH önemli olduğu bilinmektedir da karsinojenezi 'nin büyüme ve altında yatan hormonal mekanizmaların anlaşılması 3,4 eksik kalır. Basit ve genetik uysal hayvan modelleri prostat araştırma bu önceliklere hitap edecek çalışmaları desteklemek. Bu tür SKHA ve BPH, immunocomp içine tek başına ya da renal kapsülün Xenografting ile kombinasyon halinde deri altı, yavaş salma hormon peletlerin kullanılması, (başka bir bir türden hücreler, dokular ya da organların transferi) gibi hormon cevap veren hastalıklardaromised fare host, büyüme ve karsinogenez hormonal düzenlenmesini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.
Deri altına hormon topak implantasyonu kanser ve prostat 5 huylu büyüme hormonal düzenlenmesini incelemek için, basit ve yeniden üretilebilir bir tekniktir. 25 mg testosteron (T) ve 2.5 mg 17β-estradiol (E2) ile yetişkin erkek farelerin deri altına implantasyonu, yaşlanan erkeklerde 5,6 dinamik hormonal ortam yeniden, bir serum E2 artışı ve T kademeli azalmaya neden olur. Buna ek olarak, bu model BPH-AÜSS 5,7 klinik özellikleri birçok tartışıldı. Hormon tatbikat için alternatif yöntemler oral / gavaj uygulanmasını veya intraperitoneal enjeksiyon, kemirgen için sıkıntıya neden zaman içinde ilacın aynı miktarda sunma konusunda daha az tutarlıdır ve vardır daha fazlasını içerir, emek-yoğun bir defalık bir cerrahi implantasyon daha. Saat boyunca diğer deri altından modlarıormone ve / veya ilaç verme silastik kapsüller 8 bulunmaktadır. Daha da Silastic kapsüllerin kullanımı ile deneyime sahip olsa da, sıkıştırılmış granül kullanımı ve yeniden üretilebilirlik kolaylığı için tercih edilmektedir. Ayrıca, sıkıştırılmış hormon pelet bırakma oranları daha yaşlanan erkeklerde 5,7 gözlenen dinamik cinsiyet steroid hormon oranları taklit.
Genetik olarak bağışıklık sistemi farelerin geliştirilmesi için, yabancı-doku naklinde tekniklerini içeren çeşitli in vivo model sistemleri, normal ve hastalıklı dokuların, çok çeşitli çalışma için geliştirilmiştir. Xenografting birkaç temel kategorisi vardır. Doku ksenogratflardır normal yapısı, habis tümör, ya da iyi huylu büyüme olabilir sağlam doku küçük bir parça oluşmaktadır. Szot ve diğ. (2007) son zamanlarda pankreas adacık 9 renal kapsül Xenografting aydınlatılmış var. Aamdal ve diğ. (1985) im 27 insan kanser hücre çizgilerinin böbrek yabancı-doku naklinde kapsül tarifmunocompromised fare 10 ev sahipliği yapıyor. Greftler, aynı zamanda (ya da kanserli olmayan tümörijenik), tek bir ölümsüz hücre hattı meydana gelmiş olabilir ya da mezenşimin (hücre yeniden birleştirici aşı) izole edilmiş hücreler ile bir araya ölümsüzleştirilmiş hücre dizisinden oluşabilir.
Biz SKHA ve BPH gelişiminde stroma ve epitel rollerini araştırmak için, hücre yeniden bileşenler yabancı-doku naklinde lehine. Cunha ve ark. (1980) erişkin kemirgen mesane epiteli erkek fareler ana böbrek kapsülü altında embriyonik ürogenital sinüs mezenşimin (UGM) ve ksenogreflenmiş ile kombine edildiğinde, doku prostat asinüsü 11 benzeyen yapıları içine geliştirir olduğunu bildirmek için ilk oldu. Norman et al. (1986), doku yeniden bileşenler birleştirildiğinde yetişkin fare prostatik duktal epitelyum ve UGM, duktal büyüme ve morfolojilerinden 12 dallanma geçmesi gösterdi. Hayward ve ark. (1988), insan prostat epitelyum fetal m endüktif tepki gösterdiBenzer bir şekilde, 13 esenchyme. Birleştirerek prostat karsinogenez bir hormonal modeli, ölümsüzleştirilmiş insan prostat epitelyal hücre hattı BPH-1 UGM, birinci Wang et al., 14 (2001) tarafından rapor edilmiştir ve laboratuvarda 15 yaygın olarak kullanılmaktadır. Benign prostat epitel insanlarda 5 ileri SKHA modelleme, metastatik hastalığa dönüşür çünkü bu model SKHA ilerlemesini anlamak için uygundur. Özel bileşenler, genetik olarak manipüle edilebilir, çünkü yeniden birleştirici hücre aşılama stromal-epitelial etkileşimleri değerlendirmek için bir yöntem olarak özellikle yararlıdır.
Xenografting için uygun diğer siteler intradermal, deri altı ve ortotopik yeri 16 bulunmaktadır. Ilgi konusu doku ve hastalık sürecine bağlı olarak, bu gibi uygun bir alternatif yaklaşımlar olabilir. Prostat hormonal zin ve iyi huylu büyüme düzenleme araştırmada, böbrek kapsülü seçinnedeniyle yüksek greft xenografting için site hızı, bol kan akımı, ve bir kapalı sitede 16 içine aşılanmasının daha fazla sayıda implant yeteneğini alır. Ayrıca, prostat atrofi ile sonuçlanan ana fare hormonal manipülasyon prostat ortotopik aşılama 16 kullanımını sınırlar.
Bu protokol, sıkıştırılmış hormon / ilaç topak üretimi ve cerrahi implantasyon, hem de insan prostat hücre ve doku greft renal kapsül Xenografting teknikler yer almaktadır. Hep birlikte, bu teknikler, genetik olarak modifiye edilmiş bir fare SKHA ve / veya kontrol suşları daha BPH başlatılmasından daha duyarlı olup olmadığını belirlemek için hassas bir tahlil sağlar. Xenografting in vivo histolojik ve habis moleküler özellikleri geliştirmek için deneysel hücrelerin potansiyel değerlendirme, hem de iyi huylu ve kötü huylu hastalıkların geniş bir yelpazede için yeni tedavi stratejileri için bir tahlili için güçlü bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Sıkıştırılmış Hormon / Drug Pellet hazırlanması
- Bir laboratuvar önlüğü, eldiven, maske, koruyucu gözlük ve bone Bu prosedür, bir kimyasal güvenlik kabini yapılmalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için, topak yapma makineleri önce iyice% 70 etanol ile ve pelletin her tür imalattan sonra temizlenir önemlidir.
- Analitik ölçek kullanarak ve kağıt ağırlığı hormon / ilaç tozu istenilen miktarını ölçmek. Yaklaşık% 5 fazla presleme işlemi sırasında malzeme kaybı karşılamak için tavsiye edilir.
- Bazı hormonları / ilaçların üretimi pelet önce karıştırılır, bir bağlayıcı madde veya dolgu maddesi gerektirir. Örneğin, 17β-estradiol, 2.5 mg pelet üretimi için, bir 25 mg pelet sonuçlanan kolesterol 22.5 mg, hormon ile birleştirir.
- Dikkatle pres altında kalıp seti, yerine aktarmak ve pelet sıkıştırmak için sıkıca kolu aşağıya doğru bastırın. Olan sabit yüzey bakımı tutarlı basınç kullanınhacim oranı.
- Sonraki kalıp yuvasını ters ve pelet serbest bırakmak için tekrar aşağıya kolu itin.
- Bütünlüğü için pelet kontrol edin ve son kütle istenen aralıkta olup olmadığını belirlemek. Kabul edilebilir bir aralık (örneğin, 25 mg pelet için kabul edilebilir bir aralık 23,8-26,3 mg), nihai kütlesinde bir ±% 5 farktır.
- Peletler ameliyat öncesi yapılan ve (koşulları ve depolama süresi pelet üretiminde kullanılan hormon ya da ilaç stabilitesi bağlı olarak) saklanabilir. Hormon granül üretim pelet alternatif olarak satın alınabilir. Pelet Satınalma onlar formüle ve bileşik olacağından olmayan ilaç sınıf ilaçların kullanımını önler.
2. Hücre Rekombinant ksenogratflarının hazırlanması
- Hasat ve kültürü birincil fare ürogenital mesenkimi (UGM) sayımı için toplanan edilmeden önce en az 4 hafta boyunca stromal hücreler.
- Kültür olağan zahmet prostat epitelial hücre hatları ölümsüzleştirilmişiyon ve sayımı için toplamak. Bu örnek için, süspansiyon içinde greft başına 250,000 UGM stromal hücreleri ile greft başına 100,000 BPH-1 epitel hücreleri karıştırılarak yeniden birleştirici hücre greft hazırlar.
- Pelet hücreler bir araya ve 50 ul 25 ul bir hacim içinde greft arzu edilen sayıda, her biri için yeterli nötralize tip 1 fare kuyruk kolajeni yeniden askıya.
- 15 dakika boyunca 37 ° C 'de yeniden birleştirici greft ayarlama ve daha sonra aşılama öncesi kadar 48 saat boyunca 37 ° C'de depolama için büyüme ortamı ile kaplayın.
3. Doku ksenogratflarının hazırlanması
- Doku alımı ve cerrahi işlem sırasında kan yoluyla bulaşan patojenlere için evrensel önlemleri koruyun. Kurumsal inceleme kurulu onayı ve bilgilendirilmiş rıza takiben, cerrahi rezeksiyon taze prostat dokusu elde. BPH büyüme incelemeler için dokular, prostat veya basit prosedürlerin prostatektomi, transüretral rezeksiyon hasat edilebilir. SKHA veya benign prost birincil ksenogratflardıryedik doku radikal prostatektomi örneklerinde elde edilebilir.
- Mağaza izotonik tamponlu hücre medya veya buz üzerinde normal serum fizyolojik doku hasat. Doku ve depolama koşullarına bağlı olarak, numuneler önce, doku grefti hazırlanmasına kadar 24 saat süre ile depolanabilir. Yaygın uygulama formalin içinde sabitlenmiş ve rutin histoloji için işlenen bir bölümünde, üç adet numune halinde bölmek için, tek parça moleküler analiz için dondurulmuş ve bir parçası ayrıca doku ksenograftlarda (boyut olarak 1-3 mm) ayrıldı geçmeli.
4. Ateş hazırlanması Cam Pipet Cilalı
- Giyen göz koruması, laboratuvar mont ve ısıya dayanıklı eldiven, yaklaşık Bunsen beki alevi başlatmak için bir 60 ° açı içine yer cam Pasteur pipet.
- Sıcak noktalar önlemek amacıyla pipet için bir sabit, hafif bir hareket tutun.
- Amaç bir yuvarlak ile bir hafif kavisli uç olmanın ince ucu ve yangın lehçe çizmek, ucu kapalı. 5. Araçların Hazırlanması ve Cerrahi Suite
- Bütün aletleri otoklavlayın. Ameliyat öncesinde, steril alanı korumak için özen, tüm araçları kontrol edin.
- Emici pedler, diseksiyon kapsamı, anestezi burun konisi, cerrahi aletler ve çalışma alanı yönelmiş ısıtma lambası ile steril cerrahi alanı kurmak. Farelerde, ön ısıtılması boncuk sterilizatör arasında aletleri sterilize.
- Montaj ve test anestezi cihazı; gaz skavenjeri tartın.
- Tüm balmumu eşit eriyene kadar,% 70-80 güçte (eritilir ve erimemiş balmumu birleştirmek amacıyla balmumu ped yoğurma 1 dakika aralıklarla,) kadar 5 dakika boyunca mikrodalga fırın, ısı yastıkları balmumu kullanılması. Dokunarak, ped boş kemirgen kurtarma kafesinin altında çok sıcak ve yer değil emin olun.
- Cerrahi maske, bone, eldiven ve önlük gibi kemirgen cerrahi işlemler, Don kişisel koruyucu ekipman.
- Araştırma hayvanları içeren tüm işlemler kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitelerinin onayı ile yapılmalıdır. Önce anestezi indüksiyon, sağlık ve refahını sağlamak için fareyi gözlemlemek.
- % 3-5 izofluran anestezi için odasına fare yerleştirin. Hayvan hareket durdu ve solunum hızı düştüğünde, yüzüstü pozisyonda burun konisi transfer, ve% 1-3 anestezi korumak.
- Gerekirse, fare geri tıraş için makasları kullanın. Atimik çıplak (nu / nu) fareler kullanılarak, bu gerekli değildir.
- Anestezi yeterliliğini değerlendirmek için uzatılmış arka ayak dokumasında firma basınç uygulayın. Fare basınca yanıt verirse, daha fazla zaman etkili olması için anestezi gereklidir. Eğer gerekli ise, uygun bir anestezi elde etmek için hafifçe anestezi akışını ayarlamak.
- Fare anestezi yeterli olduğunda, cerrahi, ardından bir iyot karışımı (Betadine) çözeltisi ile cerrahi sitesi dezenfekte% 70 alkol.
- Don steril eldiven ve önlük, cerrahi bölgeye steril örtüler geçerlidir. Dişli forseps bir çift ile geri cilt kaldırın ve makas kullanılarak kaba bir 2-3 cm dorsal orta hat kesi yapmak.
- Künt makas veya bir sonda kullanarak, (bilateral aşılama için kesiğin her iki tarafında tek taraflı ya da aşılama için, bir tarafta) gövde duvarının arasındaki temel dermis ayırın.
- Lateral pozisyon içine fare konumlandırmak ve kas duvarından böbrek profilini görüntüleyerek böbreğin yerini belirlemek. Karın üzerine başparmak ve işaret parmağı ile elle basınç uygulayarak iç organları görselleştirmek yardımcı olabilir.
- Ince iris makası kullanarak ve omurga vücut duvarı paralel bir 1 cm kesi yapmak, büyük damarları ve sinirleri spinal önlemek için dikkat çekici. Yavaşça başlangıç kesi yerleştirmeden sonra makas geniş açarak (böbreğin uzun eksenine göre biraz daha uzun) 1.5-2.0 sm Bu kesi Widen.
- Işaret parmağı ve başparmak ile böbrek her iki tarafında kas duvarın dışında hafif bir basınç uygulayarak böbrek Exteriorize. Tuck cilt vücut duvarı üzerinde kalacak olan, batın böbrek altında kenarları. Böbrek dışarıya alınır birlikte, steril tuzlu su uygulanarak renal kapsülün hidrasyon korumak.
- Ince 5. forseps kullanarak hafifçe böbrek parankimi gelen böbrek kapsülü kaldırın ve ince neşter ile, kapsülde 2 -4 mm kesi yapmak. Kesiğin boyutunun greft boyutuna göre belirlenir, ancak kapsülün bütünlüğünü korumak için en aza düşürülmesi gerekmektedir.
- Böbrek yüzeyine teğet olan kapsül altında bir yuvarlak kapalı uç ile ince ve yangın parlatılmış çizilmiş, bir cam Pasteur pipet işleyin. Yavaşça böbrek parankimi zarar vermemeye büyük özen kullanarak, greft için küçük bir kapsül cebi açın.
- Böbrek Kapsülün kesik kenar aşı i ince forseps ile kaldırılmış, veateş cilalı cam pipet ile kapsül altında cep içine sokulur ve s. Birçok greft böbrek kapsülü altına yerleştirilir ve eşit olarak böbrek yüzeyinde aralıklı olabilir.
- Aşılama sırasında, kapsül susuz olur ise, steril tuzlu su uygulanarak nemli olmalıdır.
- Aşılama işlemi tamamlandığında, yavaşça vücut boşluğuna böbrek yerine kas duvar kesiğin tarafı kaldırın. Greftler kapsülü altında dışarı kayma olmadığını gözlemleyin.
- Bir tek sütür (4-0, FS-2 vikril sütür) ile kas duvarı kapatın. Cerrahi işlem fareyi yeniden konumlandırarak kontralateral böbrek üzerinde tekrar edilebilir.
- Aşılama tamamlandığında, fare (Protokol adım 7) aynı cerrahi işlem sırasında cilt altı pelet implantasyonu tabi olabilir.
- Dişli forseps kullanarak, cilt kesi kenarları aynı hizaya ve insizyon kapatmak için 2-3 cerrahi yara klipleri geçerlidir. Analjezi yönetmek (kullandığımız 5-10 mg / kg carprofderi altı enjeksiyonu) ile en ve geri kafes yanal yatar konumda fare. Bir lamba ya da ısıtma pedi gelen ısı ile vücut ısısının bakım sağlamak. Az 15 dakika içinde gerçekleşmesi gereken fare, tam iyileşme için gözlemleyin.
- Fareler kanama ve / veya diğer komplikasyonlar, ameliyat sonrası ağrı belirtileri sonraki 24 saat gözlem altında tutulmalıdır. Düzenli enfeksiyon belirtileri için cerrahi kesi inceleyin.
- 7-14 gün ameliyat sonrası cerrahi yara klip temizleme cihazı ile yara klipleri çıkarın.
- Tekrar cerrahi prosedür xenografting böbrek kapsül 6,1-6,5 adımlar.
- Cilt forseps bir çift ile geri cilt kaldırın ve makas kullanılarak kaba bir 1-2 cm dorsal orta hat kesi yapmak.
- Künt makas veya bir sonda kullanılarak, bir kafatası yönünde gövde duvarından temel dermis ayırın.
- Cilt forseps kullanarak,nazikçe cilt kesisi kranial yönü kaldırın ve düz, dişli forseps ile yavaşça hormon pelet tutan, pelet yerleştirin ve künt prob ile oluşturulan cepte, boyun ense de bırakın.
- Tekrar cerrahi prosedür xenografting böbrek kapsülünden 6,18-6,20 adımlar. Derialtı pelet implantasyonu gerçekleştirirken yalnızca, cerrahi insizyon kapatmak için 1 cerrahi yara klibi kullanabilirsiniz.
6. Cerrahi Prosedür: Böbrek Kapsül Xenografting
7. Cerrahi Prosedür: Subkutan Pelet İmplantasyonu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Test edilecek olan hipotez bağlı olarak, doku ya da hücre yeniden bileşenler böbrek yabancı-doku naklinde kapsül tek başına, ya da deri altı hormon topak implantasyonu ile kombinasyon halinde gerçekleştirilebilir. Deri altından hormon topak implantasyonu ile böbrek yabancı-doku naklinde kapsül deney birleştiren hayali bir deneyinin şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir. Toz haline getirilmiş ve / veya kristal maddelerin çeşitli topak pres ile sıkıştırılmış pelet üretiminde kullanılabilir. Şekil 2, 25 mg, 12 mg ve hormon granül, sıkıştırılmış, 6 mg gösterir.
Şekil 3, cerrahi işlem sırasında kullanılan ateş cilalı cam pipet bir örneğini göstermektedir. Bunsen beki alevi ile cam Pasteur pipet birden fazla geçer böbrek kapsülü altında greft için bir cep oluşturmak ve böbrek kapsülü altında greft işlemek için kullanılan bir yangın cilalı, yuvarlak ucu ile sonuçlanabilir.
ntent "> Şekil 4 'de gösterildiği üzere, erkek bir insana hormonal ortamı taklit etmek için dışsal testosteron (25 mg deri altı topak) ile takviye edilmiş BPH hastalarında birincil doku ksenograftlar, hayatta kalmak ve doku mimarisi de gösterilmiştir. (Şekil 4A) korunur Şekil 4, renal kapsül aşılama hormonal karsinojenezi değerlendirmek için de kullanılabilir. tedavi edilmemiş farelerde gelişen iyi huylu prostat epitel (BPH-1) ve indükleyici ürogenital mezenşimi (UGM) ihtiva eden yeniden birleştirici hücre iyi huylu büyümeler (Şekil 4B). aynı aşı, yetiştirilen oluşturmak dört ay boyunca, 25 mg T ve 2.5 mg E2 deri altından hormon granül alınan bir konakçı, renal kapsülün (Şekil 4C) 5,14 işgal prostat karsinomu dönüşür.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Şekil 1. Renal kapsül Xenografting ve pelet implantasyon prosedürünün şematik. Renal kapsül Xenografting dorsal orta hat yaklaşımı ile yapılır. Aynı cerrahi prosedür sırasında, fare cerrahi bölgeye scruff boyun yavaş salıveren hormon deri altı sıkıştırılmış ve / veya ilâç peletleri ile implante edilir.
Şekil 2. Mevcut protokol ile üretilen sıkıştırılmış hormon pelet örnekleri. A. 12 mg pelet. B. 6 mg pelet. C. 25 mg pelet.
Şekil 3,. Yangın-parlatılmış cam Pasteur pipet. Bitmiş pipet Pock oluşturmak için uygun bir düz yuvarlak uçlu, kavislirenal kapsülün altına ksenograft için ve diğ. Pipet da renal kapsülün altına greft işlemek için kullanılır.
Şekil 4. Renal kapsül ksenograftlarının örneği. Insan BPH dokusunun A. doku xenografts (ok uçları) çıplak bir erkek fare böbrek kapsülü altında bir ay boyunca büyütülür. Fare ana insan erkek hormonal ortamı taklit etmek için 25 mg testosteron peleti ile desteklenmiş olan böbrek altında yetiştirilen insan prostat epitelyal hücre hattı (BPH-1) ve indükleyici ürogenital mezenşimi (UGM) ihtiva etmektedir. B. Hücre rekombinant xenografts (ok uçları) Ayrıca, alt uygulanan bir çıplak fare böbrek kapsülü altında yetiştirilen BPH-1 ve UGM içeren dört ay. C. Hücre rekombinant ksenograft için bir deri altından hormon topak implantasyonu olmayan bir çıplak fare kapsül25 mg testosteron ve dört ay boyunca 2.5 mg 17β-estradiol deri topak implantasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt ve belirtilen protokol, burada sıkıştırılmış hormonu ve / veya ilaç topaklarının imalatı ve farelerin deri altına topak implantasyonu için cerrahi prosedür tarif eder. Ele alınması araştırma sorusuna bağlı olarak, bu tekniğin tek başına, ya da yaygın olarak prostat araştırma 17-19 kullanılan teknikleri prostat hücre rekombinant greft veya prostat doku xenogreftler, renal kapsül Xenografting ile birlikte yapılabilir. Birlikte ele alındığında, bu teknikler hormonal karsinogenezini ve insan ve fare prostatta iyi huylu büyüme düzenleme incelemek için güçlü bir yaklaşım sunuyoruz.
Pelet üretimi kolay üretilebilir, gerçekleştirmek için basit ve sınırlı ekipman gerektirir. Bu, çeşitli hormon ve ilaç preparatları uygulanabilir. Bu kimyasal güvenlik kabini, bu tekniği gerçekleştirmek ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek önemlidir. Prostat kanserine giden değerlendirmek için deneylernd kemirgen mesane çıkım tıkanıklığı indüksiyon biz 25 mg T ve 2.5 mg E 2 5,7,15 kullanın. Onlar vivo yanıt istenen üretmek çünkü onlar ilgi 6. hastalık süreci ile insan erkeklerde fizyolojik alakalı serum hormon düzeyleri oluşturabilirsiniz, çünkü bu dozlar tercih edilmektedir. Pellet kalıp pelet farklı boyutlarda imal edilmesine izin, biz genellikle karsinojenezi ve iyi huylu büyüme değerlendirmek için 25 mg granül kullanımı. Topak boyutu seçimi ele alınması için hipotez, hem de arzu edilen bir etki arzu dolaşımdaki seviyelerinin üretimi ve deney süresince üretimine bağlıdır. Bir ilaç ya da hormon (örneğin, kolesterol gibi) bir bağlama maddesi ile bir araya getirilmektedir ise bir hormon homojen bir karışımını ve bağlama maddesi önerilir.
Çalışmaya bağlı olarak, deri altına topak implantasyonu erkek ev 15 arasında şu hadım gerçekleştirilebilir. Bizim tecrübelerimize göre,T 25 mg implantasyonu endojen salgılanmasını inhibe etmek, hipotalamus-hipofiz-testiküler ekseninin geri besleme inhibisyonunu neden olur. Bu yüzden muhafaza endojen T salgılanması ile, sağlam ama tedavi edilmemiş erkek, insan erkek androjenik ortamı simüle etmek için 25 mg ile tedavi edilen fareler, T karşılaştırmak için seçin. Biz rutin nedeniyle androjen çekilme prostat ve prostat ksenograftlarının atrofik yanıt bir kastrasyon ana bilgisayarı kullanmak yok.
Bu protokol aynı zamanda böbrek kapsül Xenografting, yangın parlatılmış cam Pasteur pipet için özel bir ekipman parçasının oluşturulması anlatılmaktadır. Bu, kolaylıkla imal ve cerrahi prosedürde kullanım öncesi sterilize edilebilir daha özel bir cerrahi alet ile sonuçlanan çok laboratuvarda bu ekipman ile yapılabilir. Kişisel koruyucu ekipman giyen yangın parlatılmış cam pipet oluştururken personel güvenliğini sağlamak için önemlidir.
Embarki öncesindeng bu protokolde belirtilen cerrahi işlemler herhangi, tüm teknikleri gözden geçirilmeli ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır. Kemirgenlerde gerçekleştirilen cerrahi işlemler eğitim ve uygulama prosedürün her ikisi de teknik açıdan, hem de ilke ve aseptik teknik uygulama gerektirir. Bu işlemler önemli ekipman ve teknikleri bir giriş için biz personel son zamanlarda ark Prichett-Corning tarafından bildirilen Video yazının görüntülemek öneririz. (2011) 20. Biz de tüm personel kemirgen cerrahi işlemler ve aseptik teknik eğitim elleri-almak öneririz.
Laboratuvarımızda, bu işlemler genellikle iki personeli ile yapılmaktadır. Cerrahi asistanı, anestezi yönetir kurtarma sırasında hayvanları gözlemler, prosedürün steril olmayan yönleri ile cerrah yardımcı ve tüm prosedürleri belgelemektedir. Cerrah, steril bir alan tutar analjezi a yönetirnd bu protokolde belirtilen cerrahi işlemleri gerçekleştirir. Uygun planlama ve eğitim ile, deri altı hormon pelet implantasyonu cerrahi işlem basit ve yapmak kolaydır.
Hücre rekombinant Xenografting için çeşitli deneysel tasarım hususlar vardır. Ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri kullanılarak bir deney olduğu gibi, kirlenme en aza indirmek ve tespit etmek önemlidir. BPH-1 hücre hatları kullanılarak deneyler için, düşük geçiş sayısı (en az 25) önerilir. Stromaya etkileri kontrol etmek için, biz bir böbrek ve kontralateral böbrek üzerinde BPH-1 ve UGM içeren greft sadece BPH-1 hücreleri içeren greft kullanmaktadır. Hormonal karsinojenezi gidermek için tasarlanan deneyler için, tipik olarak bir muamele edilmemiş kontrol koşulu (fare, bir pelet ile implante değildir, ya da bir kolesterol pelet implante edilir) sahiptir. Diğer koşullar tha değerlendirirken Pozitif kontroller (ana bilgisayar fare T + E 2 topakları implante edilir) aynı derecede önemlidirt bu model sistem ile karsinogenezisi teşvik edebilir. Ele alınması araştırma sorusuna bağlı olarak, pelet implantasyonu ve / veya ksenogreft büyüme süresi birkaç hafta dört ay kadar değişebilir; dört ay geçmesi planlanıyor deneyler için, biz dışarıdan hormon düzeylerini korumak için ek pelet implantasyonu öneririz. Iyi huylu prostat dokusu ksenograftlarını içeren deneyler için, bu uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve kan yoluyla bulaşan patojenlere için evrensel önlemleri korumak için önemlidir. Taze hasat doku önceki 12-72 saat boyunca xenografting saklanabilir.
Renal kapsül Xenografting için cerrahi teknik planlama, uygulama ve bazı el becerisi gerektirir. , Cerrahi işlemin süresini en aza indirmek vücut ısısını ve dikkatli cerrahi teknik bakımı perioperatif mortalite ve cerrahi komplikasyonları azaltabilir. Bizim deneyim perioperatif ölüm şansı su'nun süresi ile artarrgical prosedürü, bu nedenle biz cerrahi işlem artık daha 20-25 dk sınırlamak. Cerrahi ve iyileşme sırasında ve bir ısıtma lambası ısıtıldı balmumu pedin kullanımı vücut ısısını muhafaza etmek için idealdir. Rutin post-operatif bakım, bu tekniğin başarısının bir başka önemli yönüdür. Fareler anestezi kurtarma sırasında gözlenen ve olmalıdır ağrı ve sıkıntı belirtileri cerrahisini takiben gün. Işlem sonrası ağrıyı ve rahatsızlığı en aza indirmek için uygun analjezi yönetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar geçmiş ve şimdiki Ricke laboratuarında tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz protokolü ile ilgili faydalı yorumları için, Calvin Patten, Jr, DVM ve Brigitte Raabe, DVM teşekkür ederim. R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764: Biz bu çalışmalar için mali destek için ettirmeniz, NCI ve NIEHS kabul etmek istiyorum. TMN NIH T32 GM07356 tarafından finanse Rochester Üniversitesi Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı bir stajyer, Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü F30DK093173 altında NIH de bu projeyi destekliyor. CDV Wisconsin-Madison Üniversitesi'nde T32ES007015 tarafından desteklenen T32CA157322 ve ABT tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Genel Tıp Bilimleri veya NIH Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
