Summary
Vi beskriver utarbeidelse av tre testprøvene og hvordan de kan brukes til å optimalisere og vurdere ytelsen til STORM mikroskoper. Ved hjelp av disse eksemplene viser vi hvordan du kan skaffe rådata og deretter behandle det å skaffe seg super-oppløsning i celler på ca 30-50 nm oppløsning.
Abstract
STORM er en nylig utviklet super-oppløsning mikroskopi teknikk med opptil 10 ganger bedre oppløsning enn standard fluorescens mikroskopi teknikker. Men, som bildet er ervervet i en helt annen måte enn vanlig, ved å bygge opp et bilde molekyl-by-molekyl, er det noen betydelige utfordringer for brukerne i å prøve å optimalisere sitt image oppkjøpet. For å hjelpe denne prosessen og få mer innsikt i hvordan STORM fungerer vi presentere utarbeidelsen av tre testprøvene og metodikk for å hente og prosessere STORM super-oppløsning med typiske oppløsning på mellom 30-50 nm. Ved å kombinere de testprøver med bruk av den fritt tilgjengelige prosessregnstorm programvare er det mulig å oppnå en stor mengde informasjon om bildekvalitet og oppløsning. Ved hjelp av disse beregningene er det da mulig å optimalisere bilde prosedyren fra optikken, til prøveopparbeidelse, fargestoff valg, bufferforhold, og bildetakingsinnstillinger. Vi enLSO viser eksempler på noen vanlige problemer som resulterer i dårlig bildekvalitet, for eksempel lateral drift, der prøven beveger seg under bildeopptak og tetthet relaterte problemer som resulterer i "mislocalization"-fenomenet.
Introduction
Nylig ble en rekke optiske mikroskopi teknikker har blitt utviklet, vanligvis referert til som superoppløsning mikroskopi eller nanoscopy, som kan omgå diffraksjon grensen og generere bilder med en oppløsning på 100 nm eller bedre 1,2. Siden kunngjøringen av super-oppløsning mikroskopi som Nature Metoder metoden av året i 2008, har det vært en stor utvikling av lokaliseringsbaserte mikroskoper. For eksempel er det multi-farge programmer 3-6, 3D-implementeringer 7-12, og selv levende celle applikasjoner 5,13-17. Videre, ettersom disse systemene blir kommersialisert og er nå på vei ut av optikk laboratorier i hendene på cellebiologer er det sannsynlig å være en ytterligere økning i bruken og søknad til biomedisinske spørsmål.
En gren av denne familien er de lokaliseringsbaserte metoder som fungerer ved å bygge opp et bilde molekyl-by-molekyl. Jegn For å gjøre dette, må det meste av fluorescerende molekyler i prøven være slått av, slik at bare et par romlig-atskilte molekyler som er aktive på et gitt tidspunkt. Disse molekylene blir deretter raskt slås av og på, og mange bilder er tatt, slik at en betydelig del av befolkningen blir fotografert for å reflektere den underliggende strukturen med sub-diffraksjon presisjon. Det er publisert en rekke tilnærminger, inkludert GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 og RESOLFT 22. Algoritmer som måler posisjonen til et enkelt deteksjonsmolekyl kan så brukes til å finne den faktiske posisjon av molekylet med presiseringer bedre enn 20 nm ved bruk av gaussisk fitting 23, for eksempel rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 og 27. regnstorm. Ved å avbilde celler eller andre biologiske prøver, som har en høy molekyl tetthet, er det derfor nødvendig å ta tusenvis av rammerdenne blinker, romlig separert, signal for å image en betydelig andel av de merkede molekyler.
Stokastisk optisk gjenoppbygging mikroskopi (STORM) og den svært relatert dSTORM og GSDIM metoder er lokaliseringsbaserte super-oppløsning metoder, som har vist seg å arbeide med kommersielt tilgjengelige organiske fargestoffer 21. Det har siden blitt vist å være anvendelig til en rekke forskjellige fargestoffer 28 til 30, noe som gjør metoden spesielt attraktive på grunn av den relative spesifisitet og bekvemmeligheten av veletablerte immunolabeling fremgangsmåter for å utføre fluorescens-mikroskopi. Følgelig, det er lett tilgang til et utvalg av fargestoff-antistoff og fargestoff-biomolekyl konjugater, som har potensiale til å bli brukt i super-oppløsning avbildning lokaliseringsbasert. Mens de generelle prinsippene for STORM og lignende tilnærminger er relativt enkel, og ved første øyekast maskinvare og prøveopparbeidelse synes relativt straightforward, er det en rekke av trinnene i prosessen som er avgjørende for å oppnå høy kvalitet, artefakt-free, bilder super-oppløsning.
Som med alle mikroskopi teknikker prosessen kan betraktes i tre hovedtrinn: bildebehandling bildeanalyse og tolkning første, prøveopparbeidelse, andre, image oppkjøpet, og tredje, og / eller. Den ekstra oppløsningsevne og metode for generering av super-oppløsning ved hjelp av en lokalisering basert tilnærming introduserer noen nye problemer og hensyn 31-33. Fra og med prøvepreparering, ved utføring immunolabeling, særlig indirekte immunfluorescens, hvor et primært og sekundært antistoff kombinasjonen anvendes, bør det bemerkes at det fluorescerende fargestoff kan være opp til 20 nm bort fra molekylet av interesse. I tilfelle av mikrotubuli, resulterer dette i en diameter på 35 til 50 nm, sammenlignet med en forventet microtubule diameter på 25 nm 28,30. I tillegg bør merking tetthet mEET Nyquist kriterier for å generere en høy bildekvalitet 14. For eksempel for en forventet bildeoppløsning på 20 nm langs en trådformede strukturen bør det være et fargestoff molekyl minst hver 10 nm 27. Mens mange fargestoffer har blitt publisert for å arbeide for lokalisering baserte tilnærminger den generelle ytelsen av fargestoff er en blanding av minst fire viktige kriterier, nemlig oppdaget fotoner pr bytte event (lysstyrke hver blink - lysere er bedre), likevekt på -off duty cycle (kontrastforhold på fargestoffer i off versus på staten - mer av er generelt bedre), overlevelse fraksjonen (en lav bleking rente er bedre), og antall bytter sykluser (antall blink per fluoroforen - mer er bedre for høy oppløsning, selv om en blink pr fluoroforen kan være en fordel for molekyl telleformål). Situasjonen blir ytterligere komplisert ved det faktum at disse egenskaper for et gitt fargestoff kan variere i forskjellige bufferbetingelser ogmed laser makt 28,29. Dessuten, i tillegg til disse unike STORM betraktninger, bildekvalitet kan forbedres ved å optimalisere prøvepreparering på samme måte som mer tradisjonelle fluorescens mikroskopi teknikker, for eksempel ved å minimere autofluorescens ved modifisering av fikseringsbetingelser og ved bruk av slukke reagenser. Dessuten reduserer ikke-spesifikt bundne fluoroforer er viktig, noe som kan gjøres ved å justere konsentrasjonen etikett, inkubasjonstider og blokkering, og vasketrinnene.
Det andre trinnet av bildet oppkjøpet er også kritisk. De optimale innstillinger på mikroskopet, vil avhenge av fargestoff, buffer-betingelser, merking tetthet, og prøvetype, f.eks monolag på glass, celler eller vevsprøver. De viktigste hensyn er kamera eksponeringstid, rammenummer, belysning vinkel (TIRF, HILO, Epi) og laser makt. Målet er å samle så mange lyse romlig separerte blinker så raskt som mulig. Hvis bakgrunnen jegs meget høye eller den blinker ikke er meget lyse, med andre ord at signal-til-støyforholdet er dårlig, rekonstruksjon algoritmen vil ikke være i stand til å lokalisere posisjonen like nøyaktig. I tillegg til å maksimere lokaliseringspresisjon, det vil si presisjon med hvert molekyl posisjon kan måles, avhenger bildekvaliteten også på et høyt antall lokaliseringer. Hvis ikke tilstrekkelig antall molekyler av interesse blir fotografert, enten på grunn av dårlig merking effektivitet, overdreven fotobleking eller et utilstrekkelig bildenummer, da den resulterende super-oppløsning vil være punctate og usammenhengende som Nyquist kriterier vil ikke ha oppfylt 14,27 .
Og til slutt, i det tredje trinnet, bildebehandling, spesielt viktig i forhold til standard fluorescens mikroskopi-teknikker. Det er en rekke fritt og kommersielt tilgjengelige algoritmer, som er både en fordel, i form av valg, og en ulempe, i at det kan være forvirrende å vite which er mest hensiktsmessig å bruke. Hvis for eksempel rådata har godt fordelt romlig forskjellige blinker deretter en enkelt-molekyl montering algoritme kan være svært nøyaktig og effektiv, for eksempel ved sparsom sittende algoritmer tilgjengelig i regnstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 og QuickPALM 26 programvare . Hvis rådata inneholder mye overlappende signaler da algoritmer som kan være mer hensiktsmessig inkluderer DAOSTORM 34, 3B 35 og deconSTORM 36. Videre disse algoritmene inneholde terskler for ulike kriterier som signalet teller, eller fotoner pr blink, samt ulike bildevisningsalternativer som for eksempel visualisere med utjamna Gaussian funksjoner eller som histogrammer med piksel rutenett, der super-oppløsning pikselstørrelse kan være valgt av brukeren. Alle disse alternativene endre utseendet på det endelige bildet og har implikasjoner for bilde tolkning og analyse.
27 og vanligvis full bredde halv maksimum (FWHM)av en glødetråd er gitt som en empirisk estimat av oppløsningen 37.. Det skal bemerkes at oppløsningen varierer mellom prøvene og mellom bilder i den samme prøve, fordi oppløsningen i lokaliseringsbasert super-oppløsning mikroskopi er en funksjon av fluorofor lysstyrke, bakgrunnsstøy og lokalisering tetthet 27 og disse er ikke nødvendigvis konstante gjennom hele prøven. Aktin filamenter er vant til å demonstrere mulige gjenstander som mislocalizations og drift, og hvordan de kan identifiseres med programvarefunksjoner innenfor regnstorm. Videre beskriver vi bruk av fluorescerende fiducial markører til både mål og korrekt drift. Og for det tredje, er fargingen av celler med epidermal vekstfaktor (EGF)-fargestoff-konjugatene beskrevet. EGF gir en nyttig indikator på super-oppløsning bildeytelse, fordi en del av reseptoren på celleoverflaten gjennomgår endocytose via vesikler, som er sub-diffraksjon store strukturer av omtrent 50 til 150 nm i diameter 27,38,39.
Protocol
Merk: Gjennom denne protokollen, er tips og forslag funnet følge visse trinn. Notasjonen "* 1" indikerer at note 1 er relevant for denne spesifikke trinn, og så videre.
En. Fluorescent Dextran Coating of Glass
- Tilsett 200 ul av 0,01% poly-L-lysin-løsning til hver brønn av en 8-kammerdekkglass og inkuberes i 10 min. Fjern med en pipette for å sikre at ingen er væske som gjenstår.
- Rekonstituere dekstran-Alexa 647 * 1 i henhold til produsentens instruksjoner for å lage en 2 mg / ml stamløsning. Fra dette fortynnes 0,25 mL i 25 pl av de-ionisert vann til å lage en 20 pg / ml oppløsning.
- For å opprette en høy tetthet belegg av dekstran-Alexa 647 oppløsning fortynnes 20 pl av 20 pg / ml i et totalt 200 pl deionisert vann. For en middels tetthet løsning fortynnes 2 ul i 200 ul avionisert vann (1:10.000 fortynning av den opprinnelige stamløsning). For en lavtetthet løsning fortynne 0,2 ul i 200 ul avionisert vann (1:100.000 fortynning av den opprinnelige stamløsning).
- Tilsett 200 pl av de fortynnede dextran-Alexa 647 løsninger til hver brønn og inkuber i 10 min. Lengre inkubasjonstider kan brukes som kan resultere i en mer kompakt dekstran belegg. Fjern og vask med H 2 O tre ganger * 2
Note 1: Andre dekstran-dye konjugater kan brukes. Ukonjugert dekstran kan også bli konjugert til fargestoffer hvis ønsket kombinasjoner er ikke kommersielt tilgjengelig.
Note 2: De samme dekstran kamre kan reimaged over en periode på uker selv om ensartetheten fluorescensen kan reduseres. Lagring ved 4 ° C i fravær av en hvilken som helst buffer anbefales.
2. Fluorescent actinfilamenter på glass
- Tilsett 200 ul av 0,01% poly-L-lysin-løsning til hver brønn av kammeret og inkuber i 10 min * 3.. Reflytte med en pipette for å sikre at ingen væske er igjen.
- Legg 90 mL av generell aktin buffer (rekonstituert i henhold til produsentens instruksjoner) til hvert kammer. Legg 10 mL av 10 mikrometer prefabrikkerte aktin filament løsning og en ul phalloidin-Alexa 647 (0,2 enheter, når oppløst i 1,5 ml av metanol i henhold til produsentens instruksjoner) og forsiktig pipetter opp og ned for å blande. Inkuber i 30 min * 4.
Note 3: Økning av volumet av det filament-løsning i løpet av kammeret resulterer i færre filamenter binding til poly-L-lysin-belagt glass.
Note 4: Inkubasjon ganger på opp til 48 timer ved 4 ° C har blitt testet med gode resultater. Actin filament bildekvaliteten forringes når et kammer har vært utsatt for bytte buffer så det er ikke anbefalt å bruke den samme prøven i mer enn én dag.
Tre. Microsphere fluoriserende perler som Fiducial Markers
- Legg utvannet perler inn i en bildekammeret og vente 15 min * 5. Ta løsningen og vask 3 ganger med PBS før avbildning.
Merknad 5 - fortynning og inkubasjonstiden kan justeres for å oppnå forskjellige densiteter av perlene. Denne protokollen vanligvis resulterer i mellom 3 - 10 perler per 20.5 mikrometer x 20,5 mikrometer felt-of-view.
4. Epidermal vekstfaktor cellefarging
- Kultur HeLa-celler i avbildnings kammer til omtrent 80% konfluens i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-løsning.
- Fjern kulturmediet og vaskes med PBS. Deretter legger 500 pl av 4% formaldehyd-oppløsning (4 ml 10% formaldehydoppløsning, 1 ml 10X PBS, 5 ml vann) i 10 min. Fjern formaldehyd og vask 3 ganger med PBS. Ikke la cellene å forbli dry og alltid bruke PBS bufret løsninger for å unngå hypoton stress.
FORSIKTIG - formaldehyd er ekstremt giftig. Sørg for at egnede hansker, vernebriller og lab strøk er slitt. Sjekk lokale retningslinjer for avhending av formaldehyd.
- Rekonstituere EGF-Alexa 647 i henhold til produsentens instruksjoner for å lage en 50 mikrogram / ml stamløsning. Tilsett 2 ul av denne lagerløsning i 200 mL av 0,1% BSA-oppløsning (i PBS). Fjern PBS fra cellene, tilsett EGF-løsning og inkuberes i 30 min.
- Ta løsningen og vask 3 ganger med PBS før tilsetning en blokkerende oppløsning av 0,1% BSA (i PBS) i 15 min. Fjern dette og vaske ytterligere 3 ganger med PBS før avbildning.
5. Bytte Buffer Forberedelse
- Foreta en enzymstamoppløsning (A) med 10 pl av katalase (20 pg / ml), 20 pl av 1 M Tris (2-carboxyelthyl) fosfin-hydroklorid (4 mM), 2,5 ml glyserol (50%), 125 mLav 1 M KCl (25 mM), 100 ul av 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg glukose oksydase (1 mg / ml) og fyll opp til 5 ml volum med diH20. Dette er tilstrekkelig til å gjøre 100 x 50 mL alikvoter, som kan lagres ved -20 ° C og brukt opp til 1 år.
- ) Gjør en glukosestamoppløsning (B) med 4 g glukose (100 mg / ml), 4 ml glycerol (10%) og 36 ml diH20. Dette er tilstrekkelig til å gjøre 100 x 400 mL alikvoter, som kan lagres ved - 20 ° C og brukt opp til 1 år.
- Lag et reduksjonsmiddel stamoppløsning (C) med 113,6 mg av MEA-HCI (1 M) og 1 ml av DIH 2 0. Bruk fersk eller lage 10 x 100 ul delprøver, som kan lagres ved -20 ° C og brukes i opptil en måned (ikke frys alikvoter).
- Like før avbildning, blande enzym (A), glukose (B) og reduksjonsmidlet (C) stamløsninger sammen i forholdet 50 ul, 400 ul, 100 ul, og fyll opp til 1 ml med PBS * 6. Denne bufferen vil nå skattekart oksygen og har en reduserende miljø (100 mM MEA-HCl) * 7. Den endelige pH-verdi bør være i området 6,0 til 8,5 (justering er vanligvis ikke nødvendig) * 8.
Note 6 - denne buffer er egnet for bruk med carbocyanine baserte fargestoffer som Cy5 og Alexa 647.
Note 7 - den endelige enzymkonsentrasjonen er 50 mikrogram / ml (5 enhet / ml) av glukose oksydase og 1 ug / ml (40-60 enheter / ml) av katalase. Den enzymatiske aktivitet (enheter) er gitt av leverandørene og kan variere. Beregningene for katalase anta at 1 ug / ml endelig konsentrasjon etter trinn 5.4 inneholder 50 enheter av enzymet. Forskjellige buffersammensetninger inkludert lignende kjemisk oksygenfjemende komponenter kan finnes 21,30,40. For en oppsummering av buffer og fargestoff kombinasjoner se referanser 28,29. Glyserin og TCEP kreves for langtidslagring ved -20 ° C.
Note 8 - hvis bildebehandling aktin filamenter legge 2 mM MgCl 2 og 0,2 mM ATP for å bidra til å stabil than filamenter.
6. Mikroskop Oppkjøp av STORM data (bruker Alexa 647 fargestoff)
- Slå på STORM / PALM mikroskop, fortrinnsvis minst 3 timer før fotografering for å tillate at en termisk likevekt skal oppnås. Imaging før dette har en økt sjanse for drift.
- Sett bildekammeret i mikroskopet scenen prøveholderen. Sørg for at prøven er fast i holderen og er flat.
- Fjern PBS fra bildebehandlingskammeret og deretter fylles til toppen med koplingsbuffer. Nøye et dekkglass over toppen av kammeret, noe som gjør at det ikke er noen bobler i det hele tatt, og at hele kammeret er dekket. Fyll på med ekstra buffer eller PBS hvis noen bobler blir sett ellers buffer ytelse kan avta.
FORSIKTIG - for å minimere sjansene for sideveis og aksial drift av prøven i forhold til objektivlinsen er det anbefalt at prøven og bufferen blir stående til likevekttil romtemperatur i minst 15 min før avbildning.
- Finn en fluoriserende strukturen av interesse å bli fotografert. Velg ønsket vinkel belysning, i dette tilfellet, en TIRF eller sterkt hellende vinkelen er anbefalt fordi dette forbedrer signal-til-støy-forholdet ved å redusere ut-av-fokus lys, noe som er spesielt til nytte for celleprøver. Ta en referanse diffraksjon begrenset bilde av strukturen før STORM bildebehandling.
- Øk eksitasjon laser (med et passende eksitasjonsbølgelengde på ca 640 nm) til en høy strøm, tilsvarende omlag 2 kW / cm 2, mens avbildning med kamerainnstillingene av 10 msek eksponering og en syklustid på omtrent 50 Hz (rammer per sekund) . Når fluoroforene har gått inn i en glissen blinkende mønster (sannsynligvis i løpet av 10 sekunder for de fleste prøvene) samle inn 10.000 rammer * 9.
Note 9 - 10000 rammer er egnet for de prøver som er beskrevet hermen det kan være nødvendig å øke rammenummeret til 50 000 eller mer for andre prøver.
7. Rekonstruere Images super-oppløsning fra rådata (ved hjelp av Rainstorm)
- Åpne rainSTORM.m fil fra MATLAB og kjøre (figur 1A).
- I det kraftige regnværet vindu (Figur 1B) merk bildefilen som skal analyseres ved hjelp av knappen Bla gjennom. Dette bør være en. Tif-fil (ImageJ kan brukes til å konvertere andre filtyper i tif-format). Endre pixel bredde for å matche rådata om mikroskopet systemet brukes til å skaffe data * 10. La de andre verdiene til standard.
Note 10 - En typisk EMCCD kameraet har en pikselstørrelse på 16 mikrometer så på et system med en 100X objektiv pikselstørrelse på bildet vil være 160 nm. På kommersielle systemer pikselstørrelsen er vanligvis vises i programvaren. Pixel størrelser varierer mellom 100 nm og 160 nm for de fleste lokaliserings mikroskoper.
- Trykk på 'Prosess Images' knappen og vente til en foreløpig bilde vises. Varigheten av behandlingen vil avhenge av størrelsen på filen, data spesifikasjonen og antall kandidat blinker i rådataene * 11.
Note 11 - 10000 ramme sekvenser av aktin og EGF data tok 23 sek og 25 sek for å behandle henholdsvis ved hjelp av en PC med en Intel Xeon E5420 CPU. Bruke samme datamaskin uten en parallell prosessering verktøykasse i MATLAB, eller med en datamaskin uten flere prosessorkjerner, var tider 66 sek og 81 sek hhv.
- For å generere en oppdatert super-oppløsning trykk på 'Open Anmelder "-knappen og et annet vindu vil dukke opp (figur 1C). Trykk på 'Justere Kontrast "-knappen for å endre bildevisningen som ønsket (figur 1D). I noen tilfeller, hvor det er vanskeleg å maksimalverdien bør reduseres.
- Bruk reviewer vindu (figur 1C) å generere nyttige bildekvalitet beregninger og avgrense den super-oppløsning videre. Sett de første tre kvalitetskontroll parametere til verdiene av 4000, 0,1 og 0,8 til 2,0 henholdsvis * 12. Oppdater teller per foton verdi, som bør enten være basert på et foton kalibrering måling eller ved hjelp av foton-kurve kalibreringskurve verdiene angitt av produsenten av kameraet for en bestemt EM gain setting. Dette er kritisk for å oppnå nøyaktig presisjon og oppløsning målinger * 13.
Note 12 - signalet teller avviser blinker basert på lysstyrke kriterier. Jo høyere verdi, jo lysere blinking må være å bli akseptert som en lokalisering i det endelige bildet. Dette kan være nødvendig å bli endret avhengig av foton-utgangen på fargestoff og eksponeringstiden, og følsomheten til kameraet. Toleranse avviser blinker hvis det er betydelig kvadratfeilen mellom signalet og montert gaussisk ie double topper. PSF Sigma Range avviser blinker hvis montert bredden på PSF ligger utenfor dette området, kan altså et smalere spekter brukes til å avvise ut-av-fokus-signaler og store aggregerte blobs av konstant fluorescens. Ved hjelp av et bredere spekter kan resultere i mislocalization gjenstander som vises i det endelige bildet. I praksis er det anbefalt å utføre innledende kvalitetskontroll ved hjelp av lokalisering presisjon cutoff parameter.
Note 13 - for mer om oppløsning beregninger se referanser 23,27. I korthet ved å vite antall fotoner som er produsert av hver blink det er mulig å beregne lokaliseringen presisjon på hver lokalisering og følgelig utlede totalt gjennomsnittlig presisjons anslag for hele bildet. Ved hjelp av en Andor iXON DU-897E med en forsterkning av 200 grevene per Photon verdien er 9.04.
- Endre lokalisering presisjon cutoff (figur 1C) til kompromisset mellom optimalisere gjennomsnittslokaliserings precisIon mot lokalisering nummer i det endelige bildet. Verdier på 30-50 nm, anbefales avhengig av kvaliteten av dataene og prøven. Både histogrammer og info.txt filer kan brukes til å informere denne beslutningen (Tall 1F og 1G).
- Rekonstruksjonen skala faktor (figur 1C) Standard er 5, som vil generere super-oppløsning piksler med 32 nm forutsatt at pixel bredde i de originale bildene er 160 nm. Hvis de rå bildene har en pikselstørrelse på 100 nm vil dette gi super-oppløsning med piksler på 20 nm. Øke omfanget faktor for å produsere mindre super-oppløsning piksler i det endelige bildet * 14.
Note 14 - Oppløsning av lokalisering mikros avhenger glatting som kreves for visualisering (dvs. den pikselstørrelse på en enkel histogram rekonstruksjon), så vel som lokalisering presisjon. I praksis bør størrelsen rekonstruksjonen piksel i alminnelighet være mindre enn den lokaliseringpresisjon (se Mean presisjonsestimat metriske i info tekstfil - trinn 6.11 og 6.12). I dette tilfelle tap av oppløsningen på grunn av rekonstruksjon pikselstørrelse vil være små 23,27. For eksempel de gjennomsnittlige presisjons anslag i kolonne retning i fig 4E raden og er 16,1 nm og 16,2 nm. En pikselstørrelse på 16 nm har blitt brukt til å visualisere dataene (rekonstruksjon skala faktor på 10 med en opprinnelig pixel bredde på 160 nm).
- Endre grensen bildeutvalg (figur 1C) å begrense ombygging til undergrupper av rådata, for eksempel [2001-inf] ville utelukke de første 2000 rammene av rådata.
- Trykk på "Kjør Anmelder"-knappen (figur 1C) til å generere en oppdatert super-oppløsning (figur 1E).
- Trykk på 'Vis Histograms' knappen (figur 1C), for å vise bildekvalitet beregninger (figur 1F) * 15. Note 15 - Grafen øverst til høyre viser antall aksepterte lokaliseringer mot kamera rammenummeret og Thompson lokalisering précisions histogram i nederst til høyre (figur 1F) kan brukes til å informere lokalisering presisjon cutoff gjennomgang alternativet. For eksempel vil bruke en 50 nm cutoff utelukke alle lokaliseringer med dårligere presisjon fra å bli inkludert i den endelige super-oppløsning.
- Trykk på 'Lagre bilde "-knappen i reviewer (figur 1C) for å lagre alle disse dataene * 16.
- Etter å ha gransket data (f.eks info.txt filen og histogram) tilbake til trinn 7,6 og gjenta de påfølgende trinnene med ulike anmeldelse parametere hvis ønskelig. Ved å trykke på 'Lagre bilde' i trinn 7.11 vil overskrive tidligere lagrede data.
- Følg trinn 07.01 til 07.09 for å generere et bilde på vanlig måte.
- Trykk på 'Box Tracking "-knappen i reviewer (figur 1C) og klikk og dra en boks over fiducial markør eller strukturen av interesse på anmeldt bildet.
- Vent til et nytt bilde vises, som vil vise de "Boxed posisjoner" (se figur 6B, 6C og 6F for eksempler). Lagre dette bildet hvis det er ønskelig.
- Hvis objektet av interesse er en fiducial markør deretter drive korreksjon kan utføres ved å klikke på 'Sett Anchor "etterfulgt av" Subkanalen Drift "-knappen. Til slutt klikker du "Run Anmelder 'igjen for å generere et nytt STORM bilde, som nå vil ha alle lokaliseringer korrigert i henhold til de fiducial spesielle posisjoner. Perlen posisjoner er slettet fra den endelige anmeldt bildet.
- Hvis det er andre fiducial markører innenfor den endelige drift korrigert bilde, kan disse fjernes ved å trykke 'Box Tracking', 'Slett Boxed' og deretter 'Kjør Anmelder' så mange ganger som ønskelig.
Note 16 - Mellom 3 og 5 filer kan lagres avhengig av de valgte (sum image, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists) alternativer, se figur 1G. Stormen behandlet bilde vises med modifiserte kart kontrast og farge. Den STORMdataImage er et gråtonebilde, hvor den grå nivået på hver piksel er lik nummeneh av lokaliseringer som ble identifisert i den.
8. Box Sporing og Drift Correction (ved hjelp av Rainstorm)
Representative Results
Dekstran
En vellykket belegg av dekstran skal produsere en fluorescerende monolayer. Ved den høye konsentrasjonen av dette skal vises relativt ensartet. Ved lavere konsentrasjoner vil det vises sparser (Figur 2A). Mange STORM / PALM mikroskoper har muligheten til å endre vinkelen på belysningen fra epifluorescence til TIRF. Når du bruker en fullformats kameravisning, for eksempel på 512 x 512 piksler på en typisk EMCCD kamera, bør en jevn belysning holdes. Hvis det er noen striper eller ut-av-fokus områder kan dette tyde på at prøven skal gjeninnsettes i prøveholderen med ny olje på objektiv. Alternativt kan det tyde på et problem med mikroskop.
Ved kjøp av super-oppløsning rådata bilde laser bør økes i kraft til ca 2 kW / cm 2. Det vil være en første serie av fluorescens, etterfulgt av å blinke som fluoroforer er drevet itil midlertidige mørke tilstander. Ved høy dekstran tettheter de blinker er sannsynlig å overlappe, særlig i begynnelsen av bildeinnlastingen (Video 1). På middels og lave tettheter disse blinker bør være sparsom, dvs. romlig separert, og i fokus med ingen åpenbare bakgrunn (se rammer 2000, 5000 og 8000, figur 2A, Videoer 2 og 3). Under dette bildet oppkjøpet fase, ved konstant laserbelysning, vil antall blink reduseres over tid (sammenlign ramme 2000 med ramme 8000 i høy tetthet prøven, figur 2A). Den største forskjellen mellom de ulike super-oppløsning bilder av de forskjellige dekstran konsentrasjoner (høy, middels og lav) er den synkende antall lokaliseringer (Tall 2A og 2B). Med andre ord er konsentrasjonen av den fluorescerende molekyler, antall blinker i rådata og antall lokaliseringer har et proporsjonalt forhold. Dette forholdet,er imidlertid ikke en enkel lineær ett som med svært høy molekyl tettheter programvaren ikke er i stand til å lykkes med å lokalisere molekyler (sammenligne de røde og blå linjer, Figur 2C). Grunnen til dette er at ved høy konsentrasjon er det ikke mulig for prosesseringsprogramvare for å passe til de stillinger ved hjelp av den gaussiske passende algoritme hvor blinker er ikke-sparsom. Som blinker reduseres gjennom oppkjøpet fase på grunn av fotobleking programvaren kan passe mer og mer av de blinker som de blir sparsom (Tall 2A og 2C). Videre kan de enkelte fargestoffmolekyler blinke, og derfor være lokalisert mer enn en gang 28,41,42.
Et vanlig problem når imaging noen av disse prøver, men særlig den høye tettheten dekstran-en, kan være nærvær av lys, men ufokusert fluorescerende dis som ser ut til å bli hurtig diffunderer under storm bildeinnlastingen fase. Dette er forskjellig fra de høye fluoroforer kontrastoverflaten av glass, som kan sees å blinke (figur 3A, Video 5). Disse frittstående fluorescerende molekyler kan forebygges eller fjernes ved å øke antall vasketrinn med PBS før tilsetning av koblingsbuffer eller ved tilsetning av friskt koblingsbuffer til kammeret (figur 3B, Video 6). Bearbeiding og sammenligne dataene fra hver bildesekvens resulterer i svært forskjellige super-oppløsning som har en nedgang i både antall lokaliseringer og presisjonen som de kan monteres av programvaren for å lokalisere de blinker (Tall 3C, 3D, 3E og 3F).
Aktin filamenter
Preformed aktin filamenter kan ses fast til overflaten av glasset ved diffraksjon begrenset imaging (Figur 4A-4C). Hvis antallet filamenter synes meget lavt, kan da en lengre inkubasjonstid benyttes eller en reduksjon i volumet av aktinfilament løsningen bidrar også. Velge enkel relativt lyse filamenter (figur 4D) snarere enn flokete områder resulterer i bedre bildekvalitet. Under oppkjøpsfasen, bør lyse i-fokus blinker sees langs lengden på glødetråden (Video 7). Sparsom blinking bør sees i forbindelse med oppkjøpsfasen og deretter senere i de bearbeidede data bør det være en tynn kontinuerlig filament (figur 4E) og lokaliseringer per bilde bør en gradvis nedgang (figur 4F), i motsetning til i figur 3E.
Hvis blinker er ikke sparsom, eller hvis programvaren ikke er i stand til å lokalisere molekyler, en mer subtil gjenstand, kalles en mislocalization 32, kan føre til. Dette oppstår når programvaren gjennomsnitt posisjonen til to overlappende molekyler og lokalisering er stilling midt mellom dem. En indikasjon på at det ikke har vært et betydelig antall overlapp BLINKS, og følgelig mislocalizations, er at gjennomsnitts presisjon estimatene bør være den samme i rad-og kolonne retninger, dvs. horisontalt og vertikalt, der det er mislocalizations disse ville ha skjedd langs filament, produsert en større enn vanlig blink ( dvs. fordelt over flere punkter), som ville følgelig ha vært lokalisert med mindre nøyaktighet i en av retningene. Dette er mest synlig der det er en enkelt aktin filament i bildeområdet, og det ligger horisontalt eller vertikalt. I dette tilfellet er det STORM mikroskop, oppnås en bety presisjon på 16 nm i begge retninger. Dette resulterer i en presisjonsgrense, er et mål for den virkelige bildeoppløsning av ca 34 nm. Disse beregningene er levert av Rainstorm 27, men som vi har en trådformede strukturen i uniform diameter, 7 nm med svært liten phalloidin-Alexa 647 etiketten vi kan ta et mål på FWHM å anslå oppløsningen i bildet. Ved dramatiskfløyen en rett linje gjennom filament av super-oppløsning i ImageJ (Figur 4G), ved hjelp av tomten profilfunksjon (Figur 4H) og deretter utføre en Gaussian passform (Figur 4I) FWHM beregnes som 43,2 nm. Når du forsøker denne målingen anbefaler vi at pikselstørrelsen skal matche eller være litt mindre enn gjennomsnittet presisjon estimat for bildet (se info.txt fil Figur 1G). I dette tilfellet ble 16 nm piksler brukt til å rekonstruere et bilde.
To relaterte problemer kan oppstå med STORM, hvor blinkende fluoroforene blir ikke-sparsom, dvs. individuelle molekyler innen ca 250 nm blink på samme tid, og derfor signalene overlapper hverandre. Den første er at avhengig av algoritmen og kvalitetskontroll kriteriene den bruker, den blinker ikke kan bli lokalisert i det hele tatt. Dette resulterer i super-oppløsning med få eller ingen lokaliseringer. Det andre problemetmislocalizations oppstår når de to blinker skjedde tilstrekkelig nær hverandre til å opptre som en enkelt blink. I dette tilfelle stillingen i det endelige bilde viser et gjennomsnitt av de to. For mer detaljer om dette se referanse 32. I begge tilfeller kan dette skje med meget høy tetthet prøver, utilstrekkelig lasereffekten eller med koblingsbuffer problemer. Dette problemet er tydelig der en rekke aktin filamenter er forgrenede og / eller krysser hverandre (figur 5A-D, Video 9). Ved behandling av undergrupper av rammer, og sammenligner de første og siste 5000 rammer kan vi se en annen resulterende bildet. I super-oppløsning ved hjelp av de første 5000 rammer (figur 5C) kan vi se at det er mange lokaliseringer i midten av bildet, men når du bruker de siste 5000 rammer, svært få av disse er åpenbare, og vi sitter igjen med bare filamenter, om enn noe usammenhengende skylder det lave antall lokaliseringer i image (figur 5D). Ved mistanke om for høy blinker tetthet sammenligning av bildene med lokalisering per rammedata kan det sterkeste at dette problemet oppstår, i løpet av det første settet med rammer er det et gjennomsnittlig antall lokaliseringer per ramme på over 10 sammenlignet med det siste settet av rammer hvor det er omtrent 4 (figur 5E). For å minimalisere sannsynligheten for mislocalizations fore den gjør det enkelt å ha så få lokaliseringer per ramme som mulig, selv om det finnes et stort antall molekyler som skal avbildes, det vil si for en høy tetthet prøve, krever dette at et stort antall av anskaffelses rammer tas som fører til et annet problem i STORM mikroskopi som er drift.
Lateral Drift - actinfilamenter og Fiducial Markers
Drift oppstår når prøven beveger seg i forhold til objektiv gjennom datainnsamling fase. Dette er vanskelig eller umulig å se during bildeinnlastingen fasen, særlig hvis den er sideveis i stedet for aksialt, eller med mindre den blir spesifikt målt, slik det er typisk mindre enn 50 nm i løpet av flere minutter for relativt stabile mikroskop systemer. Men i de rekonstruerte bilder av kjente konstruksjoner slik som aktin filamenter med veldefinert struktur, den kan påvises i de super-oppløsning. Det første tegn på at sideveis drift kan ha oppstått er at strukturen er større enn forventet (fig. 6A, Video 8), for eksempel med en relativt stor FWHM sammenlignet med presisjon grensedata fra regnstorm, i dette tilfellet 90 nm sammenlignet med 67 nm. Men en bedre måte å detektere glidningen på er ved å sammenligne de lokaliseringer som en funksjon av tiden, det vil si å se om de lokaliseringer i de senere rammer er forskjøvet i forhold til de i begynnelsen av rammene. Dette kan sees klart i tilfelle av aktin filamenter, som er meget liten og ensartet struktur, davises med en fargekode ved hjelp av boksen sporingsfunksjonen i regnstorm (Tall 6B og 6C).
Drift er et velkjent problem, og det finnes en rekke strategier som kan brukes for å minimere den 19 eller korrigere det etter oppkjøpet enten ved hjelp fiducial markører 21,43 eller kryss-korrelasjoner 44. For å kunne måle riktig drift og for det, kan fluorescerende perler av 100 nm diameter brukes som fiducial markører (figur 6D). Fordi de er små og lyse deres posisjon kan måle ved hjelp av Gaussian sittende algoritmer, for eksempel regnstorm. I et eksempel hvor det er forholdsvis alvorlig avdrift på ca 100 nm i løpet av 3 min 10 sek, under overtakelsen fasen (fig. 6E), den samme boksen sporing kan brukes til å fargekode og bekrefter at glidningen inntraff (figur 6F ). Som alle fire perler i dette eksempelet viser nesten identiske drift det er possible for å velge en av dem, i dette tilfelle vulsten 2, som skal brukes som referanse og trekke doren fra de andre kulene (figur 6G). Ved å legge fiducial markører til en biologisk prøve av interesse blir det da mulig å måle og korrigere eventuelle drift der den underliggende strukturen er ukjent eller langt mer variabel enn en aktin filament eller en fluoriserende perle.
Epidermal vekstfaktor
Endelig kan EGF-farget HeLa-celler anvendes for å gi en realistisk eksempel på oppløsning i celler (figur 7A, video 10). Disse cellene er forholdsvis enkelt å bilde som de skal ha mesteparten av EGF-fluorescens i planet av fokus på celleoverflaten i nær tilknytning til dekkglass. Jo mindre lyse regionen i sentrum svarer til posisjonen av kjernen. TIRF belysning kan forbedre bildekvaliteten ved å eliminere ut-av-fokus fluorescens kommer fra deler av cellen membrane ikke er i umiddelbar nærhet til glass (ca. 150 nm inntrengning i celler). Zoomed i regioner av interesse i diffraksjon begrensede bilde er typisk utydelig (figurene 7B og 7C), men i den super-oppløsning bør det være en blanding av klynger og sporadiske isolerte enkeltpiksler (Tall 7D-7F). Disse vil representere enten isolerte EGF-reseptorer på celleoverflaten eller mulig en liten mengde av ikke-spesifikk binding. De klynger vil være ca 100 nm i diameter og vil trolig tilsvare forming groper og blemmer, sti via der EGF er overveiende nedregulert og endocytosed. Typiske gjennomsnitts presisjon anslag er rundt 20 nm for denne type prøve med en presisjon grense på ca 45 nm. Det bør bemerkes at denne presisjonsgrense mål på effektiv oppløsning tar ikke hensyn til etikettstørrelse, eller en hvilken som helst drift, noe som kan måles med fiducial markørene, men er fremdeles noticeable med "komet haler" på de klynger eller ved hjelp av boksen sporing som skissert i figur 6 og som er beskrevet i protokoll del 8.
| Komponent | Endelig konsentrasjon |
| Katalase | 1 mikrogram / ml (50 enheter) |
| Glukose | 40 mg / ml |
| Glukoseoksidase | 50 pg / ml |
| Glycerin | 12.50% |
| KCl | 1,25 mM |
| MEA-HCl | 100 mM |
| TCEP | 200 uM |
| Tris | 1 mM |
Tabell 3. Bytte buffer
| Typiske Oppkjøps Innstillinger | Verdi |
| Pikselstørrelse (nm) 160 | |
| Eksponeringstid (msek) | 10 |
| Gain | 200 |
| Rammestørrelse (piksler) | 128 x 128 |
| Syklus tid (fps) | 52.5 |
| Rammenummeret | 10000 |
| 640 nm laser effekttetthet (kW / cm 2) | 2 |
Tabell 4. Anskaffelses innstillinger
Figur 1. STORM Bilde Rekonstruksjon Bruke regnstorm. (A) Åpning Rainstorm innenfra MATLAB. (B) Rainstorm grafisk brukergrensesnitt (GUI). (C) Rainstorm Anmelder GUI. (D) Juster kontrasten vinduet. (E) STORM bilde etter gjennomgang og justering kontrast. (F) Hanstograms av bildekvalitet beregninger. (G) filer generert etter å ha trykket lagre bildeknapp i korrektur GUI. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. (A) Diffraksjon begrenset (DL) Bildene viser ulike konsentrasjoner av dekstran før STORM bildebehandling. Super-oppløsning (SR) image rekonstruksjoner har en pikselstørrelse på 25 nm. 10.000 bilder ble samlet inn med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse og enkeltbilder blir vist fra den sekvensen (2000, 5000, 8000). Kjøpt med en 10 msek eksponeringstid på 52,5 bilder per sekund. Bilder har en pikselstørrelse på 160 nm. For klarhet av å se en 0,1% pixel metning kontrastforbedring ble påført ved hjelp ImageJ. Middelverdien presisjonestimater er 28 nm (høy), 24 nm (medium) og 16 nm (lav) for de ulike dekstran bilder. De lokaliserings tettheter er 724 per mikrometer 2 (høy), 526 per mikrometer 2 (middels) og 13 per um 2 (lav). (B) graf som viser i snitt tre 10,000 rammesekvenser for hver konsentrasjon av dekstran. Feilsøylene viser standardavvik. (C) Graf plotte antall aksepterte lokaliseringer per bilde ved hjelp av en rullende 100 ramme gjennomsnittet. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Dårlig kvalitet Dextran data. (A) Diffraksjon begrenset ramme fra en 15 000 ramme STORM sekvens. Legg merke til den diffuse fluorescerende dis over bildet. Dette er forårsaket av fluoropho res spre gjennom mediet. 128 x 128 pixel rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. (B) Det samme som (A) etter at buffer var blitt endret. Legg merke til forbedret kontrast som ubundne fluoroforene har blitt vasket bort. (C) Et super-oppløsning rekonstruksjon som svarer til de data som er samlet i (A). Identisk bildestørrelse men med piksler på 25 nm. Middelverdien presisjon estimat er 35 nm. (D) En super-oppløsning gjenoppbygging tilsvarer de innsamlede dataene i (B). Identisk bildestørrelse men med piksler på 25 nm. Middelverdien presisjon estimat er 30 nm. (E) Diagram plotte antall aksepterte lokaliseringer per ramme, ved hjelp av en rulle 100 ramme snitt. Den røde linjen tilsvarer STORM sekvens (A & C) hvor det er en høy bakgrunn. Den blå linjen viser data tilsvarende (B & D), hvor bakgrunnen er lav. (F) graf som viser den aksepterte lokalisering nummeret for de bilder som svarer til høy (C) og lav (L) bakgrunnsdata.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.
Figur 4. Typisk Actin data. (AC) Diffraksjon begrenset bilder av aktin filamenter før tillegg for å bytte buffer og STORM bildebehandling. Varierende lengder av filamenter kan sees. Veldig lyse filamenter er ofte flere filamenter flokete sammen. Pikselstørrelse er 160 nm. (D) En diffraksjon begrenset bilde av et enkelt filament aktin. (E) STORM bilde (0,1% kontrastforbedring anvendt i ImageJ). Fra et 10.000 ramme sekvens med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Pikselstørrelsen er 16 nm. Middelverdien presisjon estimat er 16 nm. (F) Diagram plotte antall aksepterte lokaliserings per ramme, ved hjelp av en rulle 100 ramme snitt. (G) En zoomet i regionen av aktin filament fra (E) før kontrastforsterkning med en gul linje profil trukket over. (H) En tomt profilvisningen fra gul linje trukket tvers aktin filament. Generert i ImageJ. (I) en Gaussisk form av plottet profil ved hjelp av kurvetilpasning verktøyet i ImageJ. Standardavviket, d, ble multiplisert med 2,35 for å få en FWHM måling av 43,2 nm. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Mislocalized actinfilamenter. (A) Diffraction begrenset aktin filament. 160 nm piksler. (B) STORM bilde av aktin filament er vist i (A). Fra et 20.000 ramme sekvens med en 128 x 128 pikslers frame størrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Stormen pikselstørrelse er 16 nm. Alle 20000 rammer ble behandlet. Middelverdien presisjon estimat er 17 nm. (C) Som (B), men med bare de første 5000 rammene av 20000 rammesekvens behandlet. Middelverdien presisjon estimat er 18 nm. (D) Som (B), men med bare de siste 5000 rammene av 20000 rammesekvens behandlet. Middelverdien presisjon estimat er 17 nm. (E) Diagram over lokaliseringer per rammedata fra hele 128 x 128 pixel ramme visning.
Figur 6. Lateral Drift. (A) STORM bilde av en aktin filament rekonstruert fra en 10.000 ramme sekvens med en 64 x 64 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og tatt på 64,6 bilder per sekund. Stormen pikselstørrelse er 32 nm. Middelverdien presisjon estimatet er32 nm. (B) En STORM bildet som vises ved hjelp av "Box Tracking"-funksjon i regnstorm. Lokaliseringer vises med en farge som tilsvarer rammenummeret på når de ble kjøpt, for eksempel, lokaliseringer fra tidlig i anskaffelsessekvensen er blå; lokaliseringer fra sent i oppkjøpet sekvensen er røde. De ford fargene indikerer at drift har oppstått. (C) En zoomet i regionen (A) vises ved hjelp av Box Tracking-funksjonen i regnstorm. De ford fargene indikerer drift har oppstått. (D) En diffraksjon begrenset bilde av fire 100 nm fluorescerende kuler, som kan brukes som fiducial markører. Pikselstørrelse 160 nm. Tall 1-4 showet beskåret og zoomet perler individuelt. (E) Hver fluorescerende perle tilsvarende (D) rekonstruert i regnstorm fra en 10.000 ramme sekvens med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Stormen pikselstørrelse er 5 nm. Middelverdien presisjon estimatet er 7 nm. (F) Perler svarende til (D) og (E),vises ved hjelp av 'Box Tracking "-funksjon. De ford fargene indikerer drift har oppstått. (G) ved hjelp av limstrengen nummer to som referanse, blir perlene 1, 3 og 4 er vist etter at det 'Subtract Drift "-funksjon som brukes i regnvær. Sammenligning med (E) viser at den laterale drift har blitt korrigert. Stormen pikselstørrelse er 5 nm. Klikk her for å se større figur .
Figur 7. Typisk EGF data. (A) Diffraction begrenset bilde av en del av et HeLa celle fokusert på basalcelleoverflaten. Gule bokser indikerer zoomet i områder av interesse som er vist i (B) og (C). (B) Zoomet inn diffraksjon begrenset bilde fra regionen nær kanten av cellen (boks B). (C) Zoomet inn diffraksjon begrenset bilde fra region under kjernen (boks C). (D) STORM bilde svarende til (A). Fra et 10.000 ramme sekvens med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Stormen pikselstørrelse er 25 nm. Middelverdien presisjon estimat er 21 nm. (E) STORM bilde svarende til blokken E (D). (F) STORM bilde tilsvarende boks F (D). (G) lokaliseringer pr rammedata fra (D). Klikk her for å se større figur .
. Videoer 1-4 Videoer tilsvarer Figur 2A med varierende dekstran konsentrasjoner: 1 = høy, 2 = middels, 3 = lavt, 4 = ingen). 10000 ramme sekvenser med 128 x 128 pixel rammestørrelser, anskaffet med en 10 msek eksponeringstid på 52,5 bilder per sekund. Klikk her for å se video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> video 2, video 3 , video 4
Videoer 5-6. Videoer tilsvarer Figur 3 A & B. Video 5 er forvask og Video seks er post-vask etter ubundne fluoroforene har blitt fjernet. 15000 rammesekvenser ved hjelp av en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Klikk her for å se video 5 , video 6 .
Video-7. Video viser den rå rammen sekvensen som ble behandlet for å generere STORM bildet i figur 4E. 10000 ramme Sequence med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Klikk her for å se video 7 .
Video 8. Video viser den rå rammesekvensen som ble behandlet for å generere STORM bildet i figur 5B. 20000 ramme sekvens med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Klikk her for å se video åtte .
Video 9. Bilde som viser den rå rammesekvensen som ble behandlet for å generere STORM bildet i figur 6A. 10000 ramme sekvens med en 64 x 64 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og tatt på 64,6 bilder per sekund. CLIck her for å se video ni.
Video-10. Video viser den rå rammesekvensen som ble behandlet for å generere STORM bildet i figur 7D. 10000 ramme sekvens med en 128 x 128 pikslers rammestørrelse, en 10 msek eksponeringstid og kjøpt til 52,5 bilder per sekund. Klikk her for å se video 10 .
Discussion
Vi viser med noen enkle prøver og den fritt-tilgjengelig behandling programvare Rainstorm det er mulig å optimalisere STORM super-oppløsning bildebehandling. Disse verktøyene og metodene vil gi nyttig utgangspunkt for nye brukere og måter for erfarne brukere å øke tilliten i sine mikroskoper og deres bruk av dem til å studere biologiske og cellulære strukturer med enestående detalj. Ved å bruke en kombinasjon av prøver med kjent eller godt forstått strukturer og en algoritme som kan produsere en rekke nyttige for bildekvalitet beregninger, for eksempel gjennomsnitts presisjon anslag, lokalisering nummer og histogrammer som viser det er mulig å forbedre bildekvaliteten, og til å ha større tillit i STORM bildebehandling prosessen. Det er ingen one-size fits all tilnærming til å anskaffe de data som det finnes en rekke ulike kommersielle og selvbygde mikroskop konfigurasjoner som kan brukes. Dessuten er det mange prøveopparbeidelse og bilde oppkjøpet skritt som kan innflytelseke endelige bildet derfor ha programvareverktøy og testprøver er kritisk for å forstå og optimalisere STORM bildekvalitet.
I tillegg disse protokollene kan gi nyttige og mindre tvetydige måter å feilsøke eventuelle problemer som kan oppstå. For eksempel dekstran prøven er en meget nyttig metode for å identifisere om det er noen laserstråle forskyvning eller ujevn belysning av prøven. Hvis det er bekymring for at svitsje buffer ikke kan jobbe en svært enkel visuell test for å se om det er noen "blinker" vil hjelpe. Aktin filamenter er en nyttig måte å måle oppløsning ved hjelp FWHM sammenligninger så vel som markerer drift og mislocalization gjenstander. Imidlertid bør det bemerkes at som lokaliseringsbasert super-resolusjonsmetoder kan være følsomme fluorofor densitet, uten hensyn til andre medvirkende faktorer, slik som eksponeringstider, bildefrekvens, laser krefter og den måten den bilde som skal behandles, er det umulig å tildele en oppløsning til enspesielt mikroskop og anta at alle bildene skal ha den oppløsningen. Det er imidlertid mulig å måle forskjellige aspekter av oppløsning slik som midlere lokaliserings presiseringer, lokalisering nummer og drift 27. Selv om fiducial markører ikke kan innarbeides i alle eksperimenter de kan, i det minste, brukes for å karakterisere et mikroskop system, sitt miljø og bedre forstå operative hensyn, for eksempel hvor mye tid som er nødvendig for å nå termisk likevekt etter oppstart. I tillegg til å korrigere for sideveis avdrift, kan fiducial markørene brukes for å karakterisere og korrigere for aksial drift, selv om dette krever bruk av et astigmatisk linse og en tilbakekoblingsmekanisme for å løse prøven stilling mens bildene blir ervervet 43.. Kommersielle super-oppløsningssystemer vil vanligvis inneholde noen form for stabilitetskontroll eller fokus-låsemekanisme, som kan være en mer praktisk løsning for å korrigere fokus drift.
Det enre alternativ til ikke-spesifikt å belegge glasset med dextran, for eksempel ved hjelp av fargestoffer som direkte eller andre konjugerte molekyler, slik som sekundære antistoffer. En begrensning av disse metodene er at antall molekyler bundet til glasset ikke er kjent. Alternative trådformede strukturer som har blitt brukt er mikrotubuli 28 og DNA 21. Imidlertid var kombinasjonen av meget liten størrelse og praktisk kommersielt tilgjengelige reagenser gjør aktin et attraktivt alternativ, særlig når avstanden av avvikende eller forgrenede filamenter kan også være et nyttig mål på systemytelse 27..
Det er rom for ytterligere utvikling av testprøver, til tross for nylig fremgang på dette området 28,29,46,47. Spesielt presenterer multi-farge bildebehandling en rekke utfordringer i alle tre hoveddelene av bildebehandling, sample merking, image oppkjøpet (hardware), og programvare (bildebehandling og justering). Det har en værten rekke publikasjoner som omhandler disse aspektene 4-6 og det er derfor klart at hensiktsmessige prøver og metoder er avgjørende for å generere og pålitelig måte å tolke denne typen bilder. Faktisk, nylig ble det vist at dSTORM kunne brukes til å ta to fargebilder av, og løse, den svært symmetriske natur kjernefysiske pore komplekse og forfatterne antydet at dette ville være en ideell måte å vurdere resultatene av kromatisk aberrasjon korreksjoner 45. En annen interessant metode er å bruke DNA origami for å lage en nanoruler, noe som gir mulighet for posisjonering fluoroforer på bestemte sub-diffraksjon avstander fra hverandre 46. Dette gir en måte å vurdere oppløsning og gjør distanse. Imidlertid er det endelige mål er å anvende disse super-oppløsningsteknikker til ikke-idealiserte prøver, slik som celler, som er komplekse tredimensjonale strukturer. I dette tilfelle, en kombinasjon av mer grundig forståelse av than teknikk kombinert med programvareverktøy som hjelper brukeren i å skaffe data, behandle den på riktig måte, og gir bilde beregninger er sannsynlig å være den ultimate svaret. 28,29,47,48
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner midler fra kjemisk og biologisk Justervesenet program av Storbritannias National Måling Office. Vi takker Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi og Eric Rees for tekniske råd og forslag. Vi takker Miklos Erdelyi, Eric Rees og Max Ryadnov for nyttige kommentarer og diskusjoner om dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Galbraith, C., Galbraith, J. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124, 1607-1611 (2011).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26, 285-314 (2010).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317, 1749-1753 (2007).
- Bates, M., Dempsey, G., Chen, K. H., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13, 99-107 (2012).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical journal. 99, 2686-2694 (2010).
- Baddeley, D., et al. 4D Super-Resolution Microscopy with Conventional Fluorophores and Single Wavelength Excitation in Optically Thick Cells and Tissues. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Jones, S., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5, 1047-1052 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Juette, M., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
- Vaziri, A., Tang, J., Shroff, H., Shank, C. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 20221-20226 (2008).
- York, A., Ghitani, A., Vaziri, A., Davidson, M., Shroff, H. Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM with genetically expressed probes. Nature Methods. 8, 327-333 (2011).
- Jones, S., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8, 499-505 (2011).
- Shroff, H., Galbraith, C., Galbraith, J., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5, 417-423 (2008).
- Hess, S., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 17370-17375 (2007).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Klein, T., et al. Live-cell dSTORM with SNAP-tag fusion proteins. Nature Methods. 8, 7-9 (2011).
- Folling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nature Methods. 5, 943-945 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hofmann, M., Eggeling, C., Jakobs, S., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17565-17569 (2005).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Wolter, S., et al. Real-time computation of subdiffraction-resolution fluorescence images. Journal of Microscopy. 237, 12-22 (2010).
- Wolter, S., et al. rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy. Nat. Methods. 9, 1040-1041 (2012).
- Henriques, R., et al. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7, 339-340 (2010).
- Rees, E., et al. Blind Assessment of Localisation Microscope Image Resolution. Journal of Optical Nanoscopy. 1, 12 (2012).
- Dempsey, G., Vaughan, J., Chen, K., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1036 (2011).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature. 6, 991-1009 (2011).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angewandte Chemie International Edition. 47, 6172-6176 (2008).
- Owen, D. M., Sauer, M., Gaus, K. Fluorescence localization microscopy: The transition from concept to biological research tool. Commun Integr Biol. 5, 345-349 (2012).
- van de Linde, S., Wolter, S., Heilemann, M., Sauer, M. The effect of photoswitching kinetics and labeling densities on super-resolution fluorescence imaging. Journal of biotechnology. 149, 260-266 (2010).
- Veatch, S., et al. Correlation Functions Quantify Super-Resolution Images and Estimate Apparent Clustering Due to Over-Counting. PLoS ONE. 7, e31457 (2012).
- Holden, S., Uphoff, S., Kapanidis, A. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nature. 8, 279-280 (2011).
- Cox, S., et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics. Nat Methods. 9, 195-200 (2012).
- Mukamel, E., Babcock, H., Zhuang, X. Statistical deconvolution for superresolution fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 102, 2391-2400 (2012).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13978-13983 (2012).
- Parkar, N. S., et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1301-1312 (2009).
- Clague, M. J., Urbe, S. The interface of receptor trafficking and signalling. J Cell Sci. 114, 3075-3081 (2001).
- van de Linde, S., Sauer, M., Heilemann, M. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of proteins in the mitochondrial inner membrane with photoswitchable fluorophores. Journal of Structural Biology. 164, 250-254 (2008).
- Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M., Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society. 127, 3801-3806 (2005).
- Heilemann, M., Mukherjee van S,, A,, Sauer, M. Super-Resolution Imaging with Small Organic Fluorophores. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6903-6908 (2009).
- Lee, S. H., et al. Using fixed fiduciary markers for stage drift correction. Opt Express. 20, 12177-12183 (2012).
- Mlodzianoski, M., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Optics express. 19, 15009-15019 (2011).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, 570-575 (2012).
- Steinhauer, C., Jungmann, R., Sobey, T. L., Simmel, F. C., Tinnefeld, P. DNA origami as a nanoscopic ruler for super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 8870-8873 (2009).
- Laevsky, G. S., O'Connell, C. B. Comparative and practical aspects of localization-based super-resolution imaging. Current protocols in cytometry. Chapter 2, Unit2 20 (2013).
- Gould, T., Verkhusha, V., Hess, S. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nature. 4, 291-308 (2009).
