Summary
Vi beskriver framställningen av tre provexemplar och hur de kan användas för att optimera och utvärdera resultaten av STORM mikroskop. Med hjälp av dessa exempel visar vi hur du kan få rådata och sedan bearbeta den att skaffa super-upplösning i celler på ca 30-50 nm upplösning.
Abstract
STORM är ett nyligen utvecklat super-upplösning mikroskopi teknik med upp till 10 gånger bättre upplösning än vanliga fluorescens mikroskopi tekniker. Men som bilden överförs på ett helt annat sätt än normalt, genom att bygga upp en bild molekyl-för-molekyl, finns det några viktiga utmaningar för användare i att försöka optimera sin bildtagning. För att underlätta denna process och få mer insikt i hur STORM fungerar presenterar vi beredning av 3 testprov och metoden att förvärva och bearbetning STORM super-upplösning med typiska resolutioner av mellan 30-50 nm. Genom att kombinera testproven med hjälp av den fritt tillgängliga regnstorm bearbetning programvara är det möjligt att få en hel del information om bildkvalitet och upplösning. Med hjälp av dessa mått är det sedan möjligt att optimera avbildningsförfarandet från optiken, för att provberedningen, färg val, buffertförhållanden och bildförvärvs inställningar. Vi enLSO visar exempel på några vanliga problem som resulterar i dålig bildkvalitet, exempelvis lateral drift, där provet rör sig under bildtagning och densitet Relaterade problem som uppstår i "mislocalization" fenomen.
Introduction
Nyligen har en rad optisk mikroskopi tekniker har utvecklats, vanligen kallat super-upplösning mikroskopi eller nanoskopi, vilket kan kringgå diffraktionsgränsen och generera bilder med en upplösning på 100 nm eller bättre 1,2. Sedan offentliggörandet av super-upplösning mikroskopi som den Nature Methods metoden av året 2008 har det skett en hel del utveckling av lokaliseringsbaserade mikroskop. Till exempel finns det flera färger applikationer 3-6, 3D-implementeringar 7-12, och även live-cell tillämpningar 5,13-17. Dessutom, eftersom dessa system håller på att kommersialiseras och är nu på väg ut ur optik laboratorier i händerna på cellbiologer finns det sannolikt en ytterligare ökning av deras användning och tillämpning av biomedicinska frågor.
En gren av denna familj är den lokaliseringsbaserade metoder som fungerar genom att bygga upp en bild molekyl-för-molekyl. Jagn För att göra detta, måste du slå de flesta av fluorescerande molekyler i provet av så att bara ett fåtal spatialt separerade molekylerna är aktivt åt gången. Dessa molekyler sedan snabbt slås på och av och många bilder tas, så att en betydande del av befolkningen avbildas för att spegla den underliggande strukturen med sub-diffraktion precision. Ett antal metoder har publicerats inklusive GSDIM 18 PALM 19, fPALM 20, STORM 21 och RESOLFT 22. Algoritmer som mäter läget hos en enda molekyl detektering kan därefter användas för att lokalisera den aktuella positionen av molekylen med precisionerna bättre än 20 nm med användning av Gauss-koppling 23, exempelvis rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 och regnstorm 27. När avbildning cell eller andra biologiska prover, som har en hög molekyltäthet, är det därför nödvändigt att ta många tusen ramardenna blinkande, rumsligt separerade, signal för att bild en avsevärd andel av de märkta molekylerna.
Stochastic optisk rekonstruktion mikroskop (STORM) och den starkt relaterade dSTORM och GSDIM metoder är lokaliseringsbaserade super-upplösningsmetoder, som har visat sig fungera med kommersiellt tillgängliga organiska färgämnen 21. De har sedan dess visat sig vara tillämplig på ett antal olika färger 28-30, vilket gör metoden särskilt attraktiva på grund av specificitet och relativa bekvämligheten av väletablerade immunomärkning metoder för att utföra fluorescensmikroskopi. Följaktligen finns det enkel tillgång till ett utbud av dye-antikropp och färgämnes biomolekylen konjugat, som har potential att användas i lokaliseringsbaserade super-upplösning. Medan de allmänna principerna för STORM och liknande metoder är relativt enkla, och vid första anblicken beredning hårdvara och prov verkar relativt straightforward, det finns ett antal steg i den process som är avgörande för att uppnå hög kvalitet, artefaktfria, super upplösning.
Som med alla mikroskopitekniker processen kan betraktas i tre huvudsteg: för det första provpreparering, andra, bild förvärv och för det tredje, bildbehandling och / eller bildanalys och tolkning. Den ytterligare upplösningsförmåga och metod för att generera super-upplösning med hjälp av en lokaliseringsbaserad metod introducerar några nya problem och överväganden 31-33. Börjar med provberedning, vid utförande av immunmärkning, i synnerhet indirekt immunfluorescens, där en primär och sekundär kombination antikropp används, bör det noteras att det fluorescerande färgämnet kan vara upp till 20 nm bort från den intressanta molekylen. I fallet med mikrotubuli, resulterar detta i diametrar på 35-50 nm jämfört med en förväntad mikrotubuli diameter på 25 nm 28,30. Dessutom bör märkningen tätheten mEET Nyquists kriterier i syfte att generera en bild av hög kvalitet 14. Till exempel för en förväntad upplösning på 20 nm längs en trådstruktur bör det finnas en färgämnesmolekyl minst var 10 nm 27. Medan många färgämnen har publicerats för att arbeta för lokalisering baserade närmar det totala resultatet av färgen är en blandning av åtminstone fyra viktiga kriterier, nämligen detekterade fotoner per växla händelse (ljusstyrkan för varje blinkning - ljusare är bättre), jämvikten på -off duty cycle (kontrastförhållandet av färgämnen i off kontra på staten - mer av är generellt bättre), överlevnadsfraktionen (en låg blekningshastigheten är bättre) och antalet tändcykler (antalet blinkningar per fluorofor - mer är bättre för högupplöst, även om 1 blinkning per fluoroforen kan vara en fördel för molekyl räkna ändamål). Situationen kompliceras ytterligare av det faktum att dessa egenskaper för ett givet färgämne kan variera i olika buffertbetingelser ochmed lasereffekt 28,29. Dessutom, liksom dessa unika STORM överväganden bildkvaliteten kan förbättras genom att optimera provberedning på samma sätt som mer traditionella fluorescens mikroskopi tekniker t.ex. genom att minimera autofluorescens genom modifiering av fixeringsförhållandena och användningen av släckningsreagens. Dessutom är det viktigt att minimera icke-specifikt bundna fluoroforer, vilket kan göras genom att justera etikettkoncentrationer, inkubationstider och blockerings-och tvättningssteg.
Det andra steget i bilden förvärvet är också kritisk. De optimala inställningarna på mikroskop kommer att bero på färgämnet, buffertbetingelser, märkning densitet och provtyp, t.ex. monoskikt på glas, celler eller vävnadsprover. De viktigaste överväganden är kamera exponeringstid, ramnummer, infallsvinkel (TIRF, Hilo, Epi) och lasereffekt. Målet är att så snabbt som möjligt samla så många ljusa blinkar rumsligt separerade. Om bakgrunden is mycket höga eller blinkar är inte mycket ljus, med andra ord den signal-till-brus-förhållande är dålig, återuppbyggnaden algoritmen kommer inte att kunna lokalisera positionerna så noggrant. Förutom att maximera lokalisering precision, dvs noggrannheten med varje molekyl läge kan mätas, beror bildkvalitet även på ett stort antal lokaliseringar. Om ett tillräckligt antal av molekylerna av intresse avbildas, antingen på grund av dålig effektivitet märkning, överdriven fotoblekning eller otillräcklig bildnummer, då den resulterande super-upplösning blir punktformig och diskontinuerliga som Nyquist kriterier inte har uppfyllts 14,27 .
Och slutligen, är det tredje steget, bildbehandling, särskilt viktigt i jämförelse med vanliga fluorescens mikroskopi tekniker. Det finns en rad fritt och kommersiellt tillgängliga algoritmer, vilket är både en fördel, när det gäller urval, och en nackdel, eftersom det kan vara förvirrande att veta which är lämpligast att använda. Om, till exempel rådata har väl fördelade spatialt distinkta blinkar sedan en enda molekyl passande algoritm kan vara mycket noggrann och effektiv, till exempel genom att de glesa passningsalgoritmer som finns i regnstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 och QuickPALM 26 programvara . Om rådata innehåller en hel del överlappande signaler sedan algoritmer som kan vara lämpligare inkluderar DAOSTORM 34, 3B 35 och deconSTORM 36. Dessutom är dessa algoritmer innehåller gränsvärden för olika kriterier såsom signal räknas, eller fotoner per blink, samt olika bildvisningsalternativ som visualisera med utjämnade Gaussfunktioner eller som histogram med pixelstödraster, där super-upplösning pixelstorlek kan vara som valts av användaren. Alla dessa alternativ ändra utseendet på den slutliga bilden och har implikationer för bildtolkning och analys.
27 och typiskt full bredd halv max (FWHM)av en glödtråd ges som en empirisk uppskattning av upplösning 37. Det bör noteras att upplösning varierar mellan prover och mellan bilder i samma prov eftersom upplösningen i lokaliseringsbaserade super-resolution mikroskopi är en funktion av fluorofor ljusstyrka, bakgrundsbrus och lokalisering densitet 27 och dessa är inte nödvändigtvis konstant under provet. Aktin filament används för att påvisa eventuella artefakter såsom mislocalizations och drift och hur de kan identifieras med programfunktioner inom regnstorm. Dessutom beskriver vi användning av fluorescerande referensmarkörer för både mäta och korrekt drift. Och för det tredje, färgning av celler med epidermal tillväxtfaktor (EGF)-färgämneskonjugat beskrivs. EGF ger en användbar indikator på superupplösning bildprestanda, eftersom en del av receptorn på cellytan genomgår endocytos via vesiklar, som är sub-diffraktion stora strukturer på cirka 50-150 nmi diameter 27,38,39.
Protocol
Anm: Under hela detta protokoll, har tips och förslag hittade efter vissa steg. Beteckningen "* 1" indikerar att notera 1 är relevant för detta specifika steg, och så vidare.
1. Fluorescerande Dextran Beläggning av Glass
- Addera 200 pl av 0,01% poly-L-lysin-lösning till varje brunn i en 8-kammartäckglas och inkubera under 10 min. Ta med en pipett för att säkerställa att ingen är vätska kvar.
- Rekonstituera dextran-Alexa 647 * 1 i enlighet med tillverkarens anvisningar för att skapa en 2 mg / ml stamlösning. Från denna späda 0,25 | il i 25 | il avjoniserat vatten för att skapa en 20 | ig / ml lösning.
- För att skapa en hög densitet beläggning av dextran-Alexa 647 lösning späda 20 pl av 20 mikrogram / ml lösning i totalt 200 pl avjoniserat vatten. För en medeldensitetslösning späda 2 pl i 200 l av avjoniserat vatten (1:10000 utspädning från den ursprungliga stamlösning). För en lågdensitet lösning späda 0,2 pl i 200 l av avjoniserat vatten (1:100000 utspädning från den ursprungliga stamlösning).
- Lägg till 200 l av de utspädda dextran-Alexa 647 lösningar till varje brunn och inkubera i 10 minuter. Längre inkuberingstider kan användas vilket kan resultera i en tätare dextran beläggning. Avlägsna och tvätta med H2O tre gånger * 2
Not 1: Andra dextran-färgämneskonjugat kan användas. Okonjugerat dextran kan också konjugeras till färgämnen om önskade kombinationer inte är kommersiellt tillgängliga.
Not 2: Samma dextran kamrarna kan återavbildas över en period av veckor, även om likformigheten hos fluorescensen kan minska. Förvaring vid 4 ° C i frånvaro av någon buffert rekommenderas.
2. Fluorescerande aktin filament på glas
- Addera 200 pl av 0,01% poly-L-lysin-lösning till varje brunn av kammaren och inkubera under 10 min * 3. Regå med en pipett för att säkerställa att ingen vätska finns kvar.
- Lägg till 90 l av allmän aktin buffert (bereds enligt tillverkarens anvisningar) till varje kammare. Tillsätt 10 l av 10 mikroM förformade aktin filament-lösning och 1 pl phalloidin-Alexa 647 (0,2 enheter, när de löses i 1,5 ml metanol enligt tillverkarens anvisningar) och försiktigt pipettera upp och ner för att blanda. Inkubera under 30 min * 4.
Not 3: Öka volymen av filamentet lösningen inuti kammaren ger färre filament som binder till poly-L-lysin-belagda glas.
Not 4: Inkubationstider av upp till 48 h vid 4 ° C, har testats med goda resultat. Aktin filament bildkvaliteten försämras när en kammare har utsatts för att byta buffert så det rekommenderas inte att använda samma prov i mer än en dag.
3. Mikrosfär fluorescerande pärlor som Fiducial Markers
- Lägg de utspädda pärlor i en avbildning kammare och vänta 15 min * 5. Avlägsna lösningen och tvätta tre gånger med PBS före avbildning.
Not 5 - den utspädning och inkubationstid kan justeras för att erhålla olika densiteter av pärlor. Detta protokoll resulterar normalt i mellan 3-10 pärlor per 20,5 ìm x 20,5 ìm fält-of-view.
4. Epidermal tillväxtfaktor cellfärgning
- Kultur HeLa-celler i avbildnings kamrarna till ca 80% konfluens i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin-lösning.
- Avlägsna odlingsmediet och tvätta med PBS. Tillsätt sedan 500 | il 4%-ig formaldehydlösning (4 ml 10%-ig formaldehydlösning, 1 ml 10X PBS, 5 ml vatten) under 10 min. Avlägsna formaldehyd och tvätta tre gånger med PBS. Låt inte cellerna att förbli dry och alltid använda PBS buffrade lösningar för att undvika hypoton stress.
VARNING - formaldehyd är extremt giftigt. Se till att lämpliga skyddshandskar, skyddsglasögon och labbrockar är slitna. Kontrollera lokala riktlinjer för omhändertagande av formaldehyd.
- Rekonstituera EGF-Alexa 647 i enlighet med tillverkarens anvisningar för att skapa en 50 | ag / ml stamlösning. Lägg 2 pl av denna stamlösning till 200 | il av 0,1% BSA-lösning (i PBS). Avlägsna PBS från cellerna, till EGF-lösning och inkubera under 30 min.
- Avlägsna lösningen och tvätta tre gånger med PBS före tillsats av en blockeringslösning av 0,1% BSA (i PBS) under 15 min. Ta bort det här och tvätta ytterligare 3 gånger med PBS före avbildning.
5. Switchat Buffert Framställning
- Gör en enzymstamlösning (A) med 10 | il av katalas (20 | ig / ml), 20 | il av 1 M Tris (2-carboxyelthyl) fosfin hydroklorid (4 mM), 2,5 ml glycerin (50%), 125 | ilav 1 M KCl (25 mM), 100 | il av 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg glukosoxidas (1 mg / ml) och fyll upp till 5 ml volym med diH20. Detta är tillräckligt för att göra 100 x 50 | il alikvoter, vilka kan lagras vid -20 ° C och användes under upp till 1 år.
- ) Gör en glukosförrådslösning (B) med 4 g glukos (100 mg / ml), 4 ml glycerol (10%) och 36 ml diH20. Detta är tillräckligt för att göra 100 x 400 | il alikvoter, som kan förvaras vid - 20 ° C och som används för upp till ett år.
- Gör ett reduktionsmedel stamlösning (C) med 113,6 mg av monoetanolamin-HCI (1M) och 1 ml av DIH 2 0. Använd färska eller göra 10 x 100 l alikvoter, som kan lagras vid -20 ° C och användas i upp till 1 månad (inte frysas portioner).
- Precis före avbildning, blanda enzymet (A), glukos (B) och reduktionsmedlet (C) stamlösningar samman i förhållandet 50 | il, 400 | il, 100 ^ il och fyll på till 1 ml med PBS * 6. Denna buffert kommer nu att avlägsna syre och ha en reducerande miljö (100 mM MEA-HCl) * 7. Det slutliga pH-värdet bör ligga inom intervallet 6,0 - 8,5 (justering är normalt inte nödvändigt) * 8.
Not 6 - denna buffert är lämplig för användning med karbocyaninfärgämnen baserade färger såsom Cy5 och Alexa 647.
Not 7 - de slutliga enzymkoncentrationer är 50 | ag / ml (5 enheter / ml) av glukosoxidas och 1 | ig / ml (40 till 60 enheter / ml) av katalas. Den enzymatiska aktiviteten (enheter) ges av leverantörerna och kan variera. Beräkningarna för katalas antar att 1 ^ g / ml slutkoncentration efter steg 5,4 kommer att innehålla 50 enheter enzym. Olika buffertkompositioner inklusive liknande syreuppsamlande komponenter kan hittas 21,30,40. För en sammanfattning av buffert-och färgämneskombinationer se referenser 28,29. Glycerin och TCEP krävs för långtidsförvaring vid -20 ° C.
Not 8 - om avbildning aktin filament tillsätt 2 mM MgCl2 och 0,2 mM ATP för att hjälpa till att stabilisera than filamenten.
6. Mikroskop Förvärv av STORM Data (med Alexa 647 färgämne)
- Slå på STORM / PALM mikroskop, företrädesvis åtminstone 3 h före avbildning för att medge en termisk jämvikt uppnås. Imaging innan detta har en ökad risk för avdrift.
- Sätt i avbildning kammare i mikroskop scenen provhållaren. Se till att provet är fast i hållaren och är platt.
- Ta bort PBS från avbildning kammaren och fyll till toppen med kopplingsbuffert. Placera försiktigt ett täckglas över toppen av kammaren, och se till att det inte finns några bubblor alls och att hela kammaren är täckt. Fyll på med ytterligare buffert eller PBS om några bubblor syns annars buffert prestanda kan minska.
VARNING - för att minimera risken för lateral och axiell drift av provet i förhållande till det objektiv rekommenderas att provet och bufferten är kvar i jämvikttill rumstemperatur under minst 15 min före avbildning.
- Leta upp en fluorescerande intressant struktur som ska avbildas. Välj önskad belysningsvinkel, i det här fallet, en TIRF eller starkt lutande vinkel rekommenderas eftersom det förbättrar signal-till-brus-förhållande genom att minimera out-of-fokus ljus, vilket är särskilt till nytta för cellprover. Ta en referens diffraktion-begränsad bild av strukturen innan STORM avbildning.
- Öka excitation laser (med en lämplig excitationsvåglängd av ca 640 nm) till en hög effekt, motsvarande cirka 2 kW / cm 2, medan avbildning med kamerainställningarna för 10 ms exponering och en cykeltid på ca 50 Hz (bilder per sekund) . När fluoroforema har övergått till en gles blinkande mönster (förmodligen inom 10 sekunder för de flesta prover) samla in 10.000 bilder * 9.
Not 9 - 10.000 ramar är lämpligt för proverna som beskrivs härmen det kan vara nödvändigt att öka ramnumret till 50.000 eller mer för andra prover.
7. Rekonstruera Super-högupplösta bilder från rådata (med regnstorm)
- Öppna rainSTORM.m filen inifrån MATLAB och kör (Figur 1A).
- I regnstorm fönstret (Figur 1B) Välj bildfilen som ska analyseras med hjälp av knappen Bläddra. Detta borde vara en. Tif-fil (ImageJ kan användas för att konvertera andra filtyper i en tif-format). Ändra bredden pixel för att matcha de rådata av mikroskop som används för att inhämta de uppgifter * 10. Låt de andra värdena till standard.
Not 10 - En typisk EMCCD kamera har en pixelstorlek på 16 nm så på ett system med en 100X objektiv pixelstorlek på bilden kommer att vara 160 nm. Den kommersiella system pixelstorleken är oftast visas i mjukvaran. Pixelstorleken varierar mellan 100 nm och 160 nm för de flesta lokaliserings mikroskop.
- Tryck på "Process Bilder"-knappen och vänta tills en preliminär bild visas. Längden på behandlingen beror på filstorleken, datorspecifikation och antalet kandidat blinkar i rådata * 11.
Not 11 - 10.000 ram sekvenser av aktin och EGF uppgifter tog 23 sek och 25 sek respektive att behandla med hjälp av en dator med en Intel Xeon E5420 processor. Genom att använda samma dator utan en parallell bearbetning verktygslåda i MATLAB, eller med en dator utan multipel core processorer, tiderna var 66 sek och 81 sek respektive.
- För att generera en uppdaterad super-upplösning tryck "Öppna Recensent"-knappen och ett andra fönster visas (Figur 1C). Tryck på "Justera Kontrast"-knappen för att ändra bildskärmen som önskas (Figur 1D). I vissa fall, där bilden är mycket mörk maximivärdet ska minskas.
- Använd varviewer fönster (Figur 1C) för att generera användbara bildkvalitetsmått och förfina superupplösning bilden ytterligare. Ange de tre första kvalitetsstyrparametrar till värden av 4000, 0,1 och 0,8 till 2,0 respektive * 12. Uppdatera pulser per foton värde, vilket bör antingen vara baserad på en foton kalibreringsmätning eller med hjälp av foton-kurva kalibreringskurva värden som anges av kameratillverkare för en viss EM förstärkningsinställning. Detta är avgörande för att få bättre precision och upplösning mätningar * 13.
Not 12 - Signal Räknar avvisar blinkar utifrån kriterier ljusstyrka. Ju högre värde desto ljusare blinkar måste vara för att bli accepterad som en lokalisering i den slutliga bilden. Detta kan behöva ändras beroende på foton utgången hos färgämnet och exponeringstiden och känsligheten hos kameran. Tolerans avvisar blinkar om det finns en betydande kvadratfelet mellan signalen och den monterade Gaussisk dvs double toppar. PSF Sigma Range avvisar blinkar om monterade bredd PSF ligger utanför detta område, kan det vill säga ett snävare intervall användas för att avvisa out-of-fokus signaler och stora aggregerade klickar av konstant fluorescens. Med hjälp av ett bredare utbud kan leda till mislocalization artefakter som förekommer i den slutliga bilden. I praktiken är det rekommenderat att utföra inledande kvalitetskontroll med hjälp av lokaliserings precision cutoff-parametern.
Not 13 - för mer om upplösning mått se referenserna 23,27. I korthet genom att veta hur många fotoner som varje blinka är det möjligt att beräkna lokalisering precisionen i varje lokalisering och därmed härleda den totala genomsnittliga precisions uppskattningar för hela bilden. Använda en Andor IXON DU-897E med en förstärkningsinställning av 200 grevarna per Photon värdet är 9.04.
- Ändra lokalisering precision cutoff (Figur 1C) för att avvägningen mellan att optimera medellokaliserings Precisjon mot lokaliseringsnummer i den slutliga bilden. Värden på 30-50 nm rekommenderas beroende på kvaliteten på uppgifterna och provet. Både histogram och info.txt filer kan användas för att informera detta beslut (figur 1F och 1G).
- Rekonstruktionen skalfaktor (Figur 1C) Standard är 5, vilket kommer att generera super-upplösning pixlar med 32 nm förutsatt att bredden pixeln i de ursprungliga bilderna är 160 nm. Om råbilder har en pixelstorlek på 100 nm detta kommer att producera super-upplösning med pixlar i 20 nm. Öka skalfaktor för att producera mindre superupplösnings pixlar i den slutliga bilden * 14.
Not 14 - Upplösning av lokalisering mikroskopi beror på utjämning som krävs för visualisering (d.v.s. pixelstorleken av en enkel histogram rekonstruktion) såväl som lokaliseringsprecision. I praktiken bör rekonstruktionen pixelstorleken i allmänhet att vara mindre än den lokaliseringprecision (se Mean Precision Utrops metric i info textfil - steg 6.11 och 6.12). I detta fall förlusten av upplösning på grund av återuppbyggnaden pixelstorleken blir liten 23,27. Till exempel de genomsnittliga precisions beräkningarna i rad-och kolumnriktningen figur 4E är 16,1 nm och 16,2 nm. En pixelstorlek på 16 nm har använts för att visualisera dessa uppgifter (rekonstruktion skalfaktor på 10 med en ursprunglig pixelbredd på 160 nm).
- Ändra gräns bildruteintervallet (Figur 1C) för att begränsa återuppbyggnaden till delmängder av rådata, till exempel [2001-inf] skulle utesluta de första 2.000 ramar av rådata.
- Tryck på "Kör Recensent"-knappen (Figur 1C) för att generera en uppdaterad super-upplösning (figur 1E).
- Tryck på "Visa histogram"-knappen (Figur 1C), för att visa bildkvalitetsmått (Figur 1F) * 15. Not 15 - Diagrammet i övre högra visar antalet accepterade lokaliseringar mot kamera ramnummer och Thompson lokalisering Precisions histogram i det nedre högra (Figur 1F) kan användas för att informera alternativ lokalisering precision cutoff översyn. Till exempel skulle använda en 50 nm cutoff utesluta alla lokaliseringar med sämre precision från att inkluderas i den slutliga super-upplösning.
- Tryck på "Spara bild"-knappen i granskaren (Figur 1C), för att spara alla dessa data * 16.
- Efter att ha granskat data (t.ex. Info.txt fil och histogram) återgång till steg 7.6 och upprepa de efterföljande stegen med olika-omdömen parametrar om så önskas. Genom att trycka på "Spara bild" i steg 7.11 skriver över tidigare sparade data.
- Följ steg 7,1-7,9 för att generera en bild på vanligt sätt.
- Tryck på "Box Tracking 'i granskaren (Figur 1C) och klicka och dra en ruta över referensmarkören eller struktur ränta på omdömet bilden.
- Vänta tills en ny bild visas, vilket kommer att visa "Boxed positioner" (se figur 6B, 6C och 6F för exempel). Spara den här bilden om så önskas.
- Om objektet av intresse är en förankringsmarkör sedan glida korrigering kan utföras genom att klicka på "Set Anchor" knappen följt av "Subvägarna Drift "-knappen. Slutligen klickar du på "Kör Gästernas 'igen för att generera en ny STORM bild, som nu kommer att ha alla lokaliseringar korrigeras i enlighet med de referensmarkörpositioner. Pärlan positioner tas bort från den slutliga omdömet bilden.
- Om det finns andra referensmarkörer i den slutliga drift korrigerade bilden, kan man få bort genom att trycka på "Box Tracking ',' Ta bort Boxed" och sedan "Kör Recensent" så många gånger som önskas.
Not 16 - Mellan 3 och 5 filer kan sparas beroende på vilka alternativ som valts (summan bild, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists), se Figur 1G. Stormen bearbetade bilden visas med modifierade kontrast och färgkartor. Den STORMdataImage är en gråskalebild, varvid gråskalenivån för varje pixel är lika med steler av lokaliseringar som identifierades i den.
8. Box Spårning och Korrigering (med regnstorm)
Representative Results
Dextran
En lyckad beläggning av dextran bör producera en fluorescerande monolager. Vid hög koncentration detta bör visas relativt enhetlig. Vid lägre koncentrationer den kommer att visas glesare (Figur 2A). Många STORM / PALM mikroskop har förmågan att ändra vinkeln på belysningen från epifluorescens till TIRF. Vid användning av en hel bild kamera vy, till exempel på 512 x 512 pixlar på en typisk EMCCD kamera, ska observeras en jämn belysning. Om det finns några ränder eller out-of-fokus regioner kan detta tyda på att provet ska återinföras i provhållaren med ny olja på objektivet. Alternativt kan det tyda på ett problem med mikroskopet.
Vid förvärv av super-upplösning rådata bild lasern bör ökas i kraft till ca 2 kW / cm 2. Det kommer att vara en första explosion av fluorescens följt av blinkande som fluoroforema drivs itill tillfälliga mörka stater. Vid hög dextran densiteter blinkar kommer sannolikt att överlappa varandra, särskilt nära början av bilden förvärvet (Video 1). Vid medelstora och låga densiteter dessa blinkar bör vara gles, dvs rumsligt separerade och i fokus med ingen uppenbar bakgrund (se frames 2000, 5000 och 8000, Figur 2A, Video 2 och 3). Under denna bild förvärvsfasen, vid konstant laserbelysning, kommer antalet blinkningar minskar med tiden (jämför ramen 2000 med ram 8.000 i provet med hög densitet, figur 2A). Den största skillnaden mellan de olika super-upplösning bilder av de olika dextran koncentrationer (hög, medium och låg) är det minskande antalet lokaliseringar (fig. 2A och 2B). Med andra ord, koncentrationen av de fluorescerande molekyler, antalet blinkningar i primärdata och antalet lokaliseringar har ett proportionellt förhållande. Detta förhållande,Men, är inte en enkel linjär någon som vid mycket hög molekyl densiteter programvaran är inte lyckas lokalisera molekyler (jämför de röda och blå linjer, figur 2C). Anledningen till detta är att vid den höga koncentrationen är det inte möjligt för bearbetnings programvara för att passa de lägen med användning av Gauss-passande algoritm där de blinkar är icke-gles. Då blinkar minskar genom förvärvet fasen på grund av fotoblekning av programvaran kan passa mer och mer av de blinkar när de blir gles (fig. 2A och 2C). Dessutom kan enskilda färgämnesmolekyler blinka, och därför lokaliseras mer än en gång 28,41,42.
Ett vanligt problem när avbildning något av dessa prover, men framför allt den höga tätheten dextran en, kan vara förekomsten av ljus men ofokuserad fluorescerande haze som verkar vara snabbt diffunderar under STORM bildförvärvsfasen. Detta skiljer sig från de höga kontrast fluoroforerna påytan av glaset, vilket kan ses blinka (figur 3A, video 5). Dessa fristående fluorescerande molekyler kan förhindras eller avlägsnas genom att öka antalet tvättsteg med PBS före tillsats av kopplingsbuffert eller genom tillsats av färskt kopplingsbuffert till kammaren (Figur 3B, TV-6). Bearbetning och jämföra data från varje bildsekvens ger väldigt olika super-upplösning som har en minskning av både antalet lokaliseringar och den precision med vilken de kan monteras av programvaran för att lokalisera de blinkar (figur 3C, 3D, 3E och 3F).
Aktin filament
Förformade aktinfilament kan ses som fastnat på ytan av glaset genom diffraktionsbegränsad avbildning (figur 4A-4C). Om antalet filament visas mycket låg, kan sedan en längre inkubationstid kan användas eller en minskning i volymen av aktinfila lösning hjälper också. Välja enstaka relativt ljusa filament (Figur 4D) snarare än trassliga områden resulterar i bättre bildkvalitet. Under förvärvsfasen, bör ljus i-fokus blinkar ses längs glödtråden (Video 7). Glesa blinkande bör ses under förvärvsfasen och sedan därefter i de behandlade uppgifterna bör det finnas en tunn kontinuerlig filament (Figur 4E) och lokaliseringar per ram bör en gradvis minskning (Figur 4F), till skillnad från i figur 3E.
Om blinkar är inte gles, eller om programvaran inte kunna lokalisera de molekyler, en mer subtil artefakt, en så kallad mislocalization 32, kan resultera. Detta uppstår när medelprogramvaru position två överlappande molekyler och lokalisering är läge mitt emellan dem. En indikation på att det inte har funnits ett stort antal överlappande BLINKS och följaktligen mislocalizations är att medelprecisionsberäkning bör vara densamma i rad-och kolumnriktningar, dvs horisontellt och vertikalt, där det finns mislocalizations dessa skulle ha ägt rum längs längden av filamentet, producerade en större än normal blinkning ( dvs spridda över fler pixlar), vilket följaktligen skulle ha lokaliserats med mindre noggrannhet i en av riktningarna. Detta är lättast ses där det finns en enda aktin filament i bildområdet och den ligger horisontellt eller vertikalt. I detta fall är den STORM mikroskop, uppnådde en genomsnittlig precision på 16 nm i båda riktningarna. Detta resulterar i en precisions gräns, ett mått på effektiv upplösning på ca 34 nm. Dessa värden tillhandahålls av häftigt regn 27, men eftersom vi har en trådstruktur likformig diameter, 7 nm med mycket liten falloidin-Alexa 647 etikett vi kan ta ett mått på FWHM att uppskatta upplösningen på bilden. Genom DRAvinge en rak linje genom glödtråden av super-upplösning i ImageJ (Figur 4G), med hjälp av tomten profilfunktionen (figur 4H) och därefter utför en Gaussisk passform (Figur 4I) FWHM beräknas som 43,2 nm. När du försöker denna mätning rekommenderar vi att pixelstorleken ska motsvara eller vara något mindre än den genomsnittliga precisionen uppskattning för bilden (se info.txt fil Figur 1G). I detta fall var 16 nm pixlar används för att rekonstruera en bild.
Två relaterade problem kan uppstå med STORM, där de blinkande fluoroforer bli icke-glesa, det vill säga enskilda molekyler inom ca 250 nm blinkar samtidigt och därför signalerna överlappar varandra. Den första är att beroende på algoritmen och kvalitetskontroll kriterier som den använder, de blinkar får inte lokaliseras alls. Detta resulterar i super-upplösning med få eller inga lokaliseringar. Det andra problemet medmislocalizations uppstår när två blinkningar inträffat tillräckligt nära varandra för att visas som en enda blink. I detta fall är den position i den slutliga bilden representerar ett medelvärde av de två. För mer information om detta se referens 32. I båda fallen kan detta ske med mycket hög densitet prover, otillräcklig lasereffekt eller med att byta buffertproblem. Detta problem är uppenbar när ett antal aktinfilament är förgrenade och / eller korsar varandra (Figurerna 5A-D, video 9). Genom att bearbeta delmängder av ramar, och jämföra de första och sista 5.000 ramar kan vi se en annan resulterande bilden. I super-upplösning med hjälp av de första 5.000 ramar (figur 5C) kan vi se att det finns många lokaliseringar i mitten av bilden, men när du använder de sista 5.000 ramar, väldigt få av dessa är uppenbara och vi är kvar med bara trådarna, om än något osammanhängande skyldig den låga antalet lokaliseringar i image (Figur 5D). Vid misstanke om ett för högt blinkande densitet jämförelse av bilder med lokalisering per ramdata kan starkt tyder på att detta problem uppstår, under den första uppsättningen av ramar finns det ett genomsnittligt antal lokaliseringar per ram på över 10 jämfört med den senaste uppsättningen ramar där det är ungefär 4 (Figur 5E). I syfte att minimera sannolikheten för mislocalizations inträffar är det idealiskt att ha så få lokaliseringar per ram som möjligt, även om det finns ett stort antal molekyler som skall avbildas, dvs för ett prov med hög densitet, detta kräver att ett stort antal förvärv ramar tas som leder till ett annat problem i STORM mikroskopi som är drift.
Lateral Drift - aktin filament och Fiducial Markers
Drift sker när provet rör sig i förhållande till det objektiv genom datainsamlingsfasen. Detta är svårt eller omöjligt att se During bildförvärvsfasen, särskilt om det är i sidled snarare än axiella, eller om det inte är specifikt mäts, eftersom det är oftast mindre än 50 nm under loppet av flera minuter för relativt stabila mikroskopsystem. Emellertid i rekonstruerade bilder av kända konstruktioner, såsom aktinfilament med väldefinierad struktur, den kan detekteras i super-upplösning. Det första tecknet på att sidoglidning kan ha skett är att strukturen är större än förväntat (figur 6A, Video 8) till exempel med en relativt stor FWHM jämförs med de precisionsgränsdata från regnstorm, i detta fall 90 nm, jämfört med 67 nm. Dock är ett bättre sätt att upptäcka drift genom att jämföra lokaliseringar som en funktion av tiden, det vill säga att se om lokaliseringar i de senare ramarna förskjuts jämfört med dem i början av ramar. Detta syns tydligt i fallet med aktin filament, som är mycket liten och av enhetlig struktur, dåvisas med en färgkod i rutan spårningsfunktionen i regnstorm (figur 6B och 6C).
Drift är ett väl känt problem och det finns ett antal strategier som kan användas för att minimera det 19 eller korrigera det efter förvärvet antingen med referenspunkternas markörer 21,43 eller korskorrelationer 44. För att mäta avdrift och korrigera för det, kan fluorescerande pärlor av 100 nm i diameter kan användas som referensmarkörer (figur 6D). Eftersom de är små och ljusa deras position noggrant kan mäta med Gaussiska passningsalgoritmer, såsom regnstorm. I ett exempel där det är relativt svår drift på ca 100 nm under loppet av 3 min 10 sek, under förvärvsfasen (figur 6E), spårningen samma box-funktionen kan användas för att färgkoden och bekräfta att avdrift inträffade (Figur 6F ). Eftersom alla fyra kulor i det här exemplet visar nästan identiska drift är det possible att välja en av dem, i det här fallet pärla 2, att använda som referens och subtrahera avdriften från övriga pärlor (Figur 6G). Genom att lägga till referensmarkörer till ett biologiskt prov av intresse det då blir möjligt att mäta och korrigera varje förändring där den underliggande strukturen är okänd eller betydligt mer varierande än en aktin filament eller en fluorescerande pärla.
Epidermal tillväxtfaktor
Slutligen kan EGF-infärgade HeLa-celler användas för att ge ett realistiskt exempel på bildupplösning i celler (figur 7A, video 10). Dessa celler är relativt enkelt att bilden som de borde ha majoriteten av EGF-fluorescens i planet i fokus på cellytan i nära anslutning till coverglass. Ju mindre ljusa regionen i centrum motsvarar läget av kärnan. TIRF belysning kan förbättra bildkvaliteten genom att eliminera out-of-fokus fluorescens som kommer från delar av cellen membrane inte i närheten av glaset (ca 150 nm inträngning i celler). inzoomad regioner av intresse för diffraktionsbegränsad bilden är oftast otydliga (figur 7B och 7C), men i super-upplösning bör det finnas en blandning av kluster och enstaka isolerade enstaka pixlar (figur 7D-7F). Dessa kommer att representera antingen isolerade EGF-receptorer på cellytan eller eventuellt en liten mängd av icke-specifik bindning. Grupperna kommer att vara ca 100 nm i diameter och kommer sannolikt att motsvara bildar gropar och blåsor, vägen genom vilken fonden är främst nedregleras och endocyteras. Typiska medelprecisions uppskattningar är omkring 20 nm för denna typ av prov med en precision gräns på cirka 45 nm. Det bör noteras att denna precisionsgränsen mått på effektiv upplösning inte tar hänsyn till etikettstorlek, eller varje förändring, som kan mätas med referensmarkörer, men är fortfarande noticeable av "komet svansar" på de kluster eller i rutan spårningsfunktionen som visas i figur 6 och beskrivs i protokoll avsnitt 8.
| Komponent | Slutlig koncentration |
| Katalas | 1 | ig / ml (50 enheter) |
| Glukos | 40 mg / ml |
| Glukosoxidas | 50 | ig / ml |
| Glycerin | 12.50% |
| KCl | 1.25 mM |
| MEA-HCI | 100 mM |
| TCEP | 200 pM |
| Tris | 1 mM |
Tabell 3. Byta buffert
| Typiska Förvärvs Inställningar | Värde |
| Pixelstorlek (nm) 160 | |
| Exponeringstid (ms) | 10 |
| Gain | 200 |
| Byggstorlek (bildpunkter) | 128 x 128 |
| Cykeltid (fps) | 52,5 |
| Bildnummer | 10000 |
| 640 nm lasereffekttäthet (kW / cm 2) | 2 |
Tabell 4. Förvärvs inställningar
Figur 1. STORM Bild Rekonstruktion Använda regnstorm. (A) Öppningsregnstorm inifrån MATLAB. (B) regnstorm grafiskt användargränssnitt (GUI). (C), häftigt regn omdömes GUI. (D) Justera kontrasten fönster. (E) STORM bild efter översyn och kontrastjustering. (F) Hanstograms av bildkvalitetsmått. (G) Filer som genereras efter att trycka Spara-knappen i granskare GUI. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. (A) diffraktionsbegränsad (DL) bilder visar olika koncentrationer av dextran före STORM avbildning. Super-upplösning (SR) bild rekonstruktioner har en pixelstorlek på 25 nm. 10.000 bilder samlades in med en 128 x 128 pixel bildstorlek och enskilda bilder visas från den sekvensen (2.000, 5.000, 8.000). Förvärvat med en 10 ms exponeringstid på 52,5 bilder per sekund. Bilderna har en pixelstorlek på 160 nm. För tydlighetens skull att se på en 0,1% pixel mättnad kontrastförbättring applicerades med ImageJ. Medelvärdet precisionuppskattningar är 28 nm (hög), 24 nm (medium) och 16 nm (låg) för de olika dextran bilderna. De lokaliseringstätheten är 724 per ìm 2 (hög), 526 per ìm 2 (medium) och 13 per um 2 (låg). (B) Diagram som visar ett genomsnitt av tre 10000 frame sekvenser av varje koncentration av dextran. Felstaplar visar standardavvikelse. (C) diagram som visar antalet accepterade lokaliseringar per ram med hjälp av en rullande 100 ram genomsnitt. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Dålig kvalitet Dextran Data. (A) Diffraktion begränsad ram från en 15.000 ram STORM sekvens. Notera den diffusa fluorescerande dis över bilden. Detta orsakas av fluoropho res diffunderar genom mediet. 128 x 128 pixlar ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. (B) Samma som (A) efter att bufferten hade ändrats. Notera den förbättrade kontrasten som obundna fluoroforer har tvättats bort. (C) En superupplösning bildrekonstruktion som motsvarar de uppgifter som samlats in (A). Identisk bildstorlek men med pixlar med 25 nm. Den genomsnittliga precision uppskattning är 35 nm. (D) En superupplösning bildrekonstruktion som motsvarar de uppgifter som samlats in (B). Identisk bildstorlek men med pixlar med 25 nm. Den genomsnittliga precision uppskattning är 30 nm. (E)-graf vari antalet accepterade lokaliseringar per ram, med hjälp av en rullande 100 ram genomsnitt. Den röda linjen motsvarar STORM sekvens (A & C) där det finns en hög bakgrund. Den blå linjen visar data som motsvarar (B & D), där bakgrunden är låg. (F) Diagram som visar den accepterade lokalisering antal för de bilder som motsvarar hög (C) och låga (L) bakgrundsdata.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Typiska Actin Data. (AC) diffraktionsbegränsad bilder av aktinfilament före tillsats av kopplingsbuffert och STORM avbildning. Variabla längder av filament kan ses. Mycket ljusa filament är ofta flera trådar trassla ihop. Pixelstorleken är 160 nm. (D) En diffraktion-begränsad bild av en enda aktin filament. (E) STORM bild (0,1% kontrast som tillämpas i ImageJ). Från en 10.000 ram sekvens med en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Pixelstorleken är 16 nm. Den genomsnittliga precision uppskattning är 16 nm. (F) graf vari antalet accepterade lokaliserings per ram, med hjälp av en rullande 100 ram genomsnitt. (G) En inzoomad region av aktin filament från (E) innan kontrastförstärkning med en gul linje profil dras över. (H) En tomt profil vy från gul linje över aktin filament. Genereras i ImageJ. (I) En Gaussisk passning av tomten profilen med hjälp av kurvanpassning verktyg i ImageJ. Standardavvikelsen, d, multiplicerades med 2,35 för att få en FWHM mått på 43,2 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Mislocalized aktinfilament. (A) diffraktionsbegränsad actin filament. 160 nm bildpunkter. (B) STORM bilden av actin filament som visas i (A). Från en 20.000 ram sekvens med en 128 x 128 pixel Frame storleken, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Stormen pixelstorleken är 16 nm. Samtliga 20.000 bildrutor behandlades. Den genomsnittliga precision uppskattning är 17 nm. (C) som (B) men med bara de första 5000 ramarna för 20.000 ramsekvensen bearbetas. Den genomsnittliga precision uppskattning är 18 nm. (D) Som (B) men med endast de sista 5.000 ramar i 20.000 ramsekvensen bearbetas. Den genomsnittliga precision uppskattning är 17 nm. (E) Diagram över lokaliseringar per ramdata från hela 128 x 128 pixlar ram utsikt.
Figur 6. Lateral Drift. (A) STORM bild av en aktin filament rekonstrueras från en 10.000 ram sekvens med en 64 x 64 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och tas på 64.6 bilder per sekund. Stormen pixelstorleken är 32 nm. Den genomsnittliga precision uppskattning är32 nm. (B) En STORM bilden som visas med hjälp av "Box Tracking"-funktionen i regnstorm. Lokaliseringar visas med en färg som motsvarar ramen antalet när de förvärvades till exempel lokaliseringar från tidigt i förvärvssekvensen är blå, lokaliseringar från sent i förvärvssekvensen är röda. De fördrivna färgerna anger att drift har skett. (C) En zoomat i regionen (A) visas i rutan Tracking-funktionen i regnstorm. De fördrivna färgerna indikerar drift har skett. (D) En diffraktionsbegränsad bild av fyra 100 nm fluorescerande pärlor, som kan användas som referensmarkörer. Pixelstorlek 160 nm. Siffror 1-4 visar beskurna och zoomat pärlor individuellt. (E) Varje fluorescerande pärla motsvarande (D) rekonstrueras i regnstorm från ett 10.000 ram sekvens med en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Stormen pixelstorleken är 5 nm. Den genomsnittliga precision uppskattning är 7 nm. (F) Pärlor motsvarande (D) och (E),visas med hjälp av "Box Tracking"-funktionen. De fördrivna färgerna indikerar drift har skett. (G) Använda pärla nummer 2 som referens, är pärlor 1, 3 och 4 visas efter "Subtrahera Drift"-funktionen används i regnstorm. Jämförelse med (E) visar att den laterala drift har korrigerats. Stormen pixelstorleken är 5 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Typiska EGF Data. (A) diffraktionsbegränsad bild av en del av ett HeLa-cell fokuserat på basalcellytan. Gula rutor indikerar zoomat i regioner av intresse som visas i (B) & (C). (B) zoomas in diffraktionsbegränsade bilden från området nära kanten av cellen (fält B). (C) inzoomad diffraktion begränsad bild från regionen i kärnan (fält C). (D) STORM bild motsvarande (A). Från en 10.000 ram sekvens med en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Stormen pixelstorleken är 25 nm. Den genomsnittliga precision uppskattning är 21 nm. (E) STORM bild motsvarande ruta E (D). (F) STORM bild motsvarande fält F (D). (G) lokaliseringar per bilddata från (D). Klicka här för att visa en större bild .
. Videor 1-4 Videos motsvarar figur 2A med varierande dextran koncentrationer: 1 = hög, 2 = medel, 3 = låg, 4 = ingen). 10.000 ram sekvenser med 128 x 128 pixel ramstorlekar, som förvärvats med en 10 ms exponeringstid på 52,5 bilder per sekund. Klicka här för att se video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> video 2, video 3 , video 4
Video 5-6. Video motsvarar Figur 3 A & B. Video 5 är förtvätt och video 6 är eftertvätt efter obundna fluoroforerna har avlägsnats. 15.000 frame sekvenser med hjälp av en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Klicka här för att se video 5 , video 6 .
Video 7. Video visar rå ramsekvensen som bearbetades för att generera STORM bilden i figur 4E. 10000 ram sequence med en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Klicka här för att se video 7 .
Video 8. Video som visar rå ramsekvensen som bearbetades för att generera den STORM bilden i figur 5B. 20.000 ram sekvens med en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Klicka här för att se video 8 .
Video 9. Video visar rå ramsekvensen som bearbetades för att generera STORM bilden i figur 6A. 10.000 ram sekvens med en 64 x 64 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och tas på 64.6 bilder per sekund. Click här för att se video 9.
Video 10. Video visar rå ramsekvensen som bearbetades för att generera STORM bilden i Figur 7D. 10.000 ram sekvens med en 128 x 128 pixel ramstorlek, en 10 ms exponeringstid och förvärvades 52,5 bilder per sekund. Klicka här för att se video 10 .
Discussion
Vi visar med några enkla testproverna och den fritt tillgänglig process programvara regnstorm är det möjligt att optimera STORM super-resolution imaging. Dessa verktyg och metoder kommer att ge användbara utgångspunkter för nya användare och sätt för erfarna användare för att öka förtroendet för deras mikroskop och användningen av dem för att studera biologiska och cellulära strukturer med oöverträffad detaljrikedom. Genom att använda en kombination av prover med kända eller väl förstådda strukturer och en algoritm som kan producera ett antal användbara bildkvalitetsmått, till exempel medel precision beräkningar, lokaliseringsnummer och histogram som visar att det är möjligt att förbättra bildkvaliteten och för att ha större förtroende i STORM avbildningsprocessen. Det finns ingen one-size fits all strategi att förvärva data som det finns ett antal olika kommersiella och hemmabyggda mikroskop konfigurationer som kan användas. Dessutom finns det många provberedning och bildförvärvssteg som kan påverhet den slutliga bilden därför att ha programverktyg och testprover är avgörande för att förstå och optimera STORM bildkvalitet.
Utöver dessa protokoll kan ge användbara och mindre tvetydiga sätt att felsöka eventuella problem som kan uppstå. Till exempel dextran provet är ett mycket användbart sätt att fastställa om det finns någon laserstråle felinriktning eller ojämn belysning av provet. Om det finns farhågor om att kopplingsbufferten inte kan arbeta en mycket enkel visuell test för att se om det finns någon "blinkar" kommer att hjälpa. Aktin filament är ett bra sätt att mäta upplösning med FWHM jämförelser samt att belysa driv och mislocalization artefakter. Dock bör det noteras att eftersom lokaliseringsbaserade super-upplösning metoder kan vara fluoroforen densitet känsliga, utan hinder av andra bidragande faktorer, såsom exponeringstider, bildhastighet, lasereffekter och hur bilden behandlas, är det omöjligt att tilldela en resolution om att ensärskilt mikroskop och anta att alla bilder kommer att ha den upplösningen. Vad är möjligt, dock, är att mäta olika aspekter av upplösning såsom medellokaliserings precisioner, lokaliseringsnummer och drift 27. Även om referensmarkörer inte kan införlivas i varje experiment de kan, åtminstone, att användas för att karakterisera ett mikroskopsystem, dess miljö och bättre förstå de operativa överväganden som hur mycket tid som krävs för att uppnå termisk jämvikt efter uppstart. Förutom att korrigera för lateral avdrift kan referenspunkternas markörer användas för att karakterisera och korrigera för axiell avdrift, även om detta kräver användning av en astigmatisk lins och en återkopplingsmekanism för att korrigera provposition medan bilderna låtande 43. Kommersiella super-upplösning system innefattar vanligen någon form av stabilitetskontroll eller fokusera-låsmekanism, som kan vara en mer praktisk lösning för att korrigera fokus drift.
Det finns enre alternativ till ospecifikt belägga glaset med dextran, som att använda färgämnen direkt eller andra konjugerade molekyler, såsom sekundära antikroppar. En begränsning av dessa tillvägagångssätt är att antalet molekyler bundna till glaset är inte känd. Alternativa trådlika strukturer som har använts inkluderar mikrotubuli 28 och DNA 21. Men kombinationen av mycket liten storlek och bekväma kommersiellt tillgängliga reagenser gör aktin ett attraktivt alternativ, särskilt som avståndet av divergerande eller grenade trådar kan också vara ett användbart mått på systemets prestanda 27.
Det finns utrymme för ytterligare utveckling av testprover, trots den senaste tidens framsteg inom detta område 28,29,46,47. Särskilt innehåller flera färgbilder ett antal utmaningar i alla tre viktigaste aspekterna av bildbehandling, provmärkning, bild förvärv (hårdvara) och programvara (bildbehandling och anpassning). Det har en varitett antal publikationer som behandlar dessa aspekter 4-6 och det är därför klart att lämpliga testprov och metoder är avgörande för att generera och tillförlitligt tolka dessa typer av bilder. I själva verket, som nyligen visades att dSTORM skulle kunna användas för att ta två färgbilder av, och lösa, den mycket symmetriska karaktären hos den nukleära por komplex och författarna föreslog att detta skulle vara ett idealiskt sätt att bedöma resultat av kromatisk aberration korrigeringar 45. En annan intressant metod är att använda DNA-origami för att skapa en nanoruler, vilket skapar möjlighet till positionering fluoroforer vid specifika sub-diffraktion avstånd från varandra 46. Detta ger ett sätt att bedöma upplösning och gör avståndsmätningar. Dock är det yttersta syftet att tillämpa dessa superupplösning tekniker för att icke-idealiserade prov, exempelvis celler, som är komplicerade tredimensionella strukturer. I detta fall kan en kombination av mer grundlig förståelse av than teknik i kombination med programvaruverktyg som hjälper användaren att skaffa information, bearbeta den på lämpligt sätt, och ger bild mått sannolikt är det ultimata svaret. 28,29,47,48
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi erkänner finansiering från kemi-och bioteknik Metrology program av Storbritanniens nationella mätningskontoret. Vi tackar Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi och Eric Rees för teknisk rådgivning och förslag. Vi tackar Miklos Erdelyi, Eric Rees och Max Ryadnov för hjälpsamma kommentarer och diskussioner om detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Galbraith, C., Galbraith, J. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124, 1607-1611 (2011).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26, 285-314 (2010).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317, 1749-1753 (2007).
- Bates, M., Dempsey, G., Chen, K. H., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13, 99-107 (2012).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical journal. 99, 2686-2694 (2010).
- Baddeley, D., et al. 4D Super-Resolution Microscopy with Conventional Fluorophores and Single Wavelength Excitation in Optically Thick Cells and Tissues. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Jones, S., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5, 1047-1052 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Juette, M., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
- Vaziri, A., Tang, J., Shroff, H., Shank, C. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 20221-20226 (2008).
- York, A., Ghitani, A., Vaziri, A., Davidson, M., Shroff, H. Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM with genetically expressed probes. Nature Methods. 8, 327-333 (2011).
- Jones, S., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8, 499-505 (2011).
- Shroff, H., Galbraith, C., Galbraith, J., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5, 417-423 (2008).
- Hess, S., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 17370-17375 (2007).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Klein, T., et al. Live-cell dSTORM with SNAP-tag fusion proteins. Nature Methods. 8, 7-9 (2011).
- Folling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nature Methods. 5, 943-945 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hofmann, M., Eggeling, C., Jakobs, S., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17565-17569 (2005).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Wolter, S., et al. Real-time computation of subdiffraction-resolution fluorescence images. Journal of Microscopy. 237, 12-22 (2010).
- Wolter, S., et al. rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy. Nat. Methods. 9, 1040-1041 (2012).
- Henriques, R., et al. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7, 339-340 (2010).
- Rees, E., et al. Blind Assessment of Localisation Microscope Image Resolution. Journal of Optical Nanoscopy. 1, 12 (2012).
- Dempsey, G., Vaughan, J., Chen, K., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1036 (2011).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature. 6, 991-1009 (2011).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angewandte Chemie International Edition. 47, 6172-6176 (2008).
- Owen, D. M., Sauer, M., Gaus, K. Fluorescence localization microscopy: The transition from concept to biological research tool. Commun Integr Biol. 5, 345-349 (2012).
- van de Linde, S., Wolter, S., Heilemann, M., Sauer, M. The effect of photoswitching kinetics and labeling densities on super-resolution fluorescence imaging. Journal of biotechnology. 149, 260-266 (2010).
- Veatch, S., et al. Correlation Functions Quantify Super-Resolution Images and Estimate Apparent Clustering Due to Over-Counting. PLoS ONE. 7, e31457 (2012).
- Holden, S., Uphoff, S., Kapanidis, A. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nature. 8, 279-280 (2011).
- Cox, S., et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics. Nat Methods. 9, 195-200 (2012).
- Mukamel, E., Babcock, H., Zhuang, X. Statistical deconvolution for superresolution fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 102, 2391-2400 (2012).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13978-13983 (2012).
- Parkar, N. S., et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1301-1312 (2009).
- Clague, M. J., Urbe, S. The interface of receptor trafficking and signalling. J Cell Sci. 114, 3075-3081 (2001).
- van de Linde, S., Sauer, M., Heilemann, M. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of proteins in the mitochondrial inner membrane with photoswitchable fluorophores. Journal of Structural Biology. 164, 250-254 (2008).
- Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M., Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society. 127, 3801-3806 (2005).
- Heilemann, M., Mukherjee van S,, A,, Sauer, M. Super-Resolution Imaging with Small Organic Fluorophores. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6903-6908 (2009).
- Lee, S. H., et al. Using fixed fiduciary markers for stage drift correction. Opt Express. 20, 12177-12183 (2012).
- Mlodzianoski, M., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Optics express. 19, 15009-15019 (2011).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, 570-575 (2012).
- Steinhauer, C., Jungmann, R., Sobey, T. L., Simmel, F. C., Tinnefeld, P. DNA origami as a nanoscopic ruler for super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 8870-8873 (2009).
- Laevsky, G. S., O'Connell, C. B. Comparative and practical aspects of localization-based super-resolution imaging. Current protocols in cytometry. Chapter 2, Unit2 20 (2013).
- Gould, T., Verkhusha, V., Hess, S. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nature. 4, 291-308 (2009).
