Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

Published: September 6, 2013 doi: 10.3791/50579
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Analytical Science Division, National Physical Laboratory

Summary

وصفنا إعداد ثلاث عينات الاختبار وكيف يمكن استخدامها لتحسين وتقييم أداء المجاهر STORM. باستخدام هذه الأمثلة وتبين لنا كيفية الحصول على البيانات الخام ثم معالجته للحصول على الصور فائقة الدقة في خلايا حوالي 30-50 قرار نانومتر.

Abstract

STORM هو فائقة الدقة تقنية المجهر وضعت مؤخرا مع ما يصل إلى 10 مرات قرار أفضل من تقنيات مضان المجهري القياسية. لكن، وكما يتم الحصول على الصورة بطريقة مختلفة جدا من المعتاد، من خلال بناء صورة جزيء على حدة جزيء، وهناك بعض تحديات كبيرة للمستخدمين في محاولة لتحسين صورتهم الاستحواذ. من أجل مساعدة هذه العملية وكسب مزيد من التبصر في كيفية عمل STORM نقدم إعداد 3 عينات الاختبار ومنهجية لاكتساب ومعالجة STORM الصور فائقة الدقة مع قرارات نموذجية من بين 30-50 نانومتر. من خلال الجمع بين عينات الاختبار مع استخدام برامج معالجة متاحة بحرية عاصفة مطيرة فمن الممكن الحصول على قدر كبير من المعلومات حول جودة الصورة وحلها. استخدام هذه المقاييس فمن الممكن بعد ذلك لتحسين إجراءات التصوير من البصريات، لأخذ عينات من إعداد واختيار الصبغة، والظروف العازلة، والإعدادات الحصول على الصور. لديناعرض أمثلة ليسوتو لبعض المشاكل الشائعة التي تؤدي إلى سوء جودة الصورة، مثل الانجراف الجانبية، حيث يتحرك عينة خلال الحصول على الصور وكثافة المشاكل الناتجة في 'mislocalization "ظاهرة ذات الصلة.

Introduction

مؤخرا مجموعة من تقنيات المجهر الضوئي تم تطويرها، عادة ما يشار إليها باسم فائقة القرار المجهري أو nanoscopy، والتي يمكن تجاوز الحد الحيود وتوليد الصور مع قرارات 100 نانومتر أو أفضل 1،2. منذ إعلان فائقة الدقة المجهر بأنها طريقة طرق الطبيعة من السنة في عام 2008، كان هناك قدر كبير من تطوير المجاهر القائم على الترجمة. على سبيل المثال، هناك تطبيقات متعددة الألوان 3-6، 3D تطبيقات 7-12، وتطبيقات الخلايا الحية حتى 5،13-17. علاوة على ذلك، كما يتم تسويقها هذه الأنظمة ويتم الآن يشقون طريقهم للخروج من المختبرات والبصريات في أيدي علماء الأحياء الخلايا ومن المرجح أن تكون زيادة أخرى في استخدامها وتطبيقها على الأسئلة الطبية الحيوية هناك.

فرع واحد من هذه العائلة هو القائم على أساليب الترجمة التي تعمل عن طريق بناء صورة جزيء على حدة جزيء. أنان أجل القيام بذلك، يجب أن تنتقل غالبية الجزيئات الفلورسنت داخل العينة من ذلك أنه ليس هناك سوى عدد قليل من جزيئات تفصل مكانيا تنشط في أي وقت واحد. ثم يتم تبديل هذه الجزيئات بسرعة وخارجها، ويتم أخذ العديد من الصور بحيث يتم تصوير جزء كبير من السكان لتعكس البنية الأساسية بدقة الحيود الفرعية. تم نشر عدد من النهج بما في ذلك GSDIM 18، PALM 19، fPALM 20، 21 STORM وRESOLFT 22. ويمكن بعد ذلك الخوارزميات التي تقيس الموقف من الكشف عن جزيء واحد يمكن استخدامها لتحديد الموقف الفعلي للجزيء مع توضيحات أفضل من 20 نانومتر باستخدام المناسب جاوس 23، على سبيل المثال rapidSTORM 24،25 QuickPALM 26، palm3d 12 و 27 عاصفة مطيرة. عندما التصوير الخلايا أو العينات البيولوجية الأخرى، التي لديها كثافة جزيء عالية، وبالتالي من الضروري اتخاذ عدة آلاف من الأطرهذا وامض، مفصولة مكانيا، إشارة من أجل صورة نسبة كبيرة من الجزيئات المسمى.

مؤشر ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصرية (STORM) وdSTORM ارتباطا وثيقا وطرق GSDIM وسائل فائقة الدقة على أساس التوطين، والتي ثبت للعمل مع الأصباغ العضوية متاحة تجاريا 21. ومنذ ذلك الحين أظهرت أنها قابلة للتطبيق على عدد من الأصباغ المختلفة 28-30، الأمر الذي يجعل من منهجية جاذبية خاصة نظرا لخصوصية والراحة النسبية لنهج immunolabeling راسخة لأداء مضان المجهري. وبالتالي، هناك سهولة الوصول إلى مجموعة واسعة من تقارن صبغ الأجسام المضادة وصبغ جزيء حيوي، والتي لديها القدرة على أن تستخدم في القائم على التعريب فائقة التصوير القرار. في حين أن المبادئ العامة للSTORM ونهج مماثلة هي بسيطة نسبيا، وأول وهلة الأجهزة وإعداد عينة يبدو سترا نسبياightforward، وهناك عدد من الخطوات في عملية والتي هي حاسمة لتحقيق جودة عالية، وخالية من القطع الأثرية والصور فائقة الدقة.

كما هو الحال مع جميع تقنيات الفحص المجهري يمكن اعتبار عملية في 3 خطوات رئيسية: أولا، إعداد العينات، والثانية، الحصول على الصور وثالثا، معالجة الصور و / أو تحليل الصور وتفسيرها. قوة إضافية حل وطريقة لتوليد الصور فائقة الدقة باستخدام النهج القائم على توطين يقدم بعض المشاكل والاعتبارات 31-33 جديدة. بدءا من إعداد العينات، وعند تنفيذ immunolabeling، ولا سيما المناعي غير المباشر حيث يتم استخدام مزيج الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وتجدر الإشارة إلى أن صبغة الفلورسنت قد يكون ما يصل إلى 20 نانومتر بعيدا عن جزيء من الفائدة. في حالة الأنابيب الدقيقة، وهذا يؤدي في أقطار من 35-50 نانومتر مقارنة مع قطر أنيبيب المتوقع من 25 نانومتر 28،30. أيضا، يجب أن كثافة وضع العلامات مEET المعايير نيكويست من أجل توليد صورة ذات جودة عالية 14. على سبيل المثال لدقة وضوح الصورة المتوقعة من 20 نانومتر إلى جانب هيكل الخيطية يجب أن يكون هناك جزيء الصبغة على الأقل كل 10 نانومتر 27. في حين تم نشر العديد من الأصباغ للعمل من أجل نهج قائم على توطين الأداء العام للصباغة هي مزيج من لا يقل عن أربعة معايير مهمة وهي الكشف عن الفوتونات في حالة التحول (سطوع كل طرفة - أكثر إشراقا هي أحسن)، والتوازن في خارج دورة العمل (على النقيض من نسبة الأصباغ في خارج مقابل على الدولة - أكثر من هو أفضل بشكل عام)، وجزء البقاء على قيد الحياة (معدل تبيض المنخفضة هي أحسن) وعدد من التحول دورات (عدد يومض في fluorophore - أكثر هو أفضل لارتفاع القرار، وعلى الرغم من أن وميض 1 في fluorophore يمكن أن يكون ميزة لأغراض العد جزيء). وتعقيد الوضع مزيدا من حقيقة أن هذه الخصائص لإعطاء أي صبغة يمكن أن تختلف في ظروف مختلفة عازلة ومع الليزر 28،29 السلطة. بالإضافة إلى ذلك، فضلا عن هذه الاعتبارات STORM فريدة من نوعها، ويمكن تحسين جودة الصورة من خلال تحسين إعداد العينات بنفس الطريقة عن تقنيات مضان المجهري أكثر تقليدية على سبيل المثال عن طريق تقليل تألق ذاتي من خلال تعديل شروط التثبيت واستخدام الكواشف التبريد. أيضا، والتقليل من fluorophores غير ملزمة على وجه التحديد هو المهم، الذي يمكن القيام به من خلال تعديل تركيزات التسمية، مرات الحضانة والحجب وغسل الخطوات.

الخطوة الثانية من الحصول على الصور أمر بالغ الأهمية أيضا. سوف الإعدادات المثلى على المجهر تعتمد على الصبغة، والظروف العازلة، كثافة وضع العلامات، ونوع العينة، مثل الطبقات الوحيدة على الزجاج، والخلايا أو عينات الأنسجة. الاعتبارات الرئيسية هي الكاميرا وقت التعرض، ورقم الإطار، وزاوية الإضاءة (TIRF، HILO، برنامج التحصين الموسع) وقوة الليزر. الهدف هو جمع أكبر عدد ممكن مشرق يومض فصل مكانيا في أسرع وقت ممكن. إذا ط الخلفيةق عالية جدا أو يومض ليست مشرقة جدا، وبعبارة أخرى نسبة الإشارة إلى الضوضاء والفقراء، فإن خوارزمية إعادة الإعمار لن تكون قادرة على توطين الوظائف بأكبر. فضلا عن تعظيم الدقة التعريب، أي دقة مع كل موقف جزيء يمكن قياسها، جودة الصورة تعتمد أيضا على عدد كبير من تعريب. إذا تم تصويرها وجود العدد الكافي من الجزيئات من الفائدة، إما بسبب ضعف الكفاءة ووضع العلامات، photobleaching من الإفراط أو رقم الإطار غير كافية، ثم فائقة الدقة الصورة الناتجة ستكون منقط ومتقطع كما لن يكون قد تم الوفاء بمعايير نيكويست 14،27 .

وأخيرا، فإن الخطوة الثالثة، ومعالجة الصور، أهمية خاصة بالمقارنة مع تقنيات مضان المجهري القياسية. هناك مجموعة من بحرية ومتاحة تجاريا الخوارزميات، والتي هي على حد سواء ميزة، من حيث الاختيار، ووضع غير مؤات، لأنه يمكن أن يكون مربكا لمعرفة ث hich هو الأنسب للاستخدام. على سبيل المثال إذا البيانات الخام ومتباعدة بشكل جيد يومض متميزة مكانيا ثم واحدة جزيء المناسب خوارزمية يمكن أن تكون دقيقة وفعالة للغاية، على سبيل المثال عن طريق خوارزميات المناسب متفرق المتاحة في عاصفة مطيرة 27، 24،25 rapidSTORM، palm3d 12 و 26 QuickPALM البرمجيات . إذا كانت البيانات الخام يحتوي على الكثير من الإشارات المتداخلة ثم الخوارزميات التي قد تكون أكثر ملاءمة وتشمل DAOSTORM 34، 3B 35 و 36 deconSTORM. علاوة على ذلك، هذه الخوارزميات تتضمن عتبات معايير مختلفة مثل التهم إشارة، أو الفوتونات في طرفة، فضلا عن مختلف الخيارات المختلفة عرض الصور مثل تصور مع وظائف جاوس ممهدة أو رسوم بيانية مع شبكات بكسل، حيث حجم بكسل فائقة الدقة يمكن أن يكون المحددة من قبل المستخدم. كل من هذه الخيارات تغيير مظهر الصورة النهائية ويكون لها آثار على تفسير الصور وتحليلها.

> ولذلك، فإننا نقدم 3 عينات الاختبار التي سوف توفر للمستخدم جديدة مع نقطة انطلاق لالمستندة إلى توطين التجارب قائم على الأصباغ فائقة القرار، الذي من أجل وضوح سنشير إليها STORM، والمستخدمين ذوي الخبرة الفرصة ل مزيد من تحسين تجاربهم. الأول، فمن الممكن أن معطف سطح الزجاج مع طبقة من الفلورسنت ديكستران صبغ المترافقة. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإثبات أن المجهر، وصبغ عازلة تعمل على توليد وامض إشارة الفلورسنت. ويمكن بعد ذلك طريقة تمديدها من خلال مقارنة متوسط ​​الدقة توطين وعدد المقاييس التي تم إنشاؤها بواسطة عاصفة مطيرة لتحسين الظروف العازلة، ضبط الحصول على الصور واختبار الأصباغ المختلفة. الثانية، نقدم بروتوكول بسيط لإعداد خيوط الأكتين على الزجاج التي يمكن وصفها بسهولة باستخدام تقارن phalloidin صبغ. توفر هذه الهياكل مثالية لأخذ القياسات من القرار 27 وعادة العرض الكامل نصف كحد أقصى (FWHM)من يعطى خيوط كتقدير التجريبية من القرار 37. تجدر الإشارة إلى أن القرار يختلف بين العينات وبين الصور داخل نفس العينة لأن القرار في القائم على التعريب فائقة القرار المجهري هي وظيفة من سطوع fluorophore، الضوضاء في الخلفية وكثافة توطين 27 وهذه ليست بالضرورة ثابتة طوال العينة. تستخدم خيوط الأكتين لإظهار القطع الأثرية المحتملة مثل mislocalizations والانجراف وكيف يمكن تحديدها مع ميزات البرنامج داخل عاصفة مطيرة. وعلاوة على ذلك، نحن تصف استخدام علامات إيمانية الفلورسنت لكل قياس والانجراف الصحيح. والثالث، يوصف تلطيخ الخلايا مع عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) تقارن صبغ. يوفر صندوق تعديل العولمة الأوروبي مؤشرا مفيدا لأداء صورة فائقة الدقة، وذلك لأن نسبة من مستقبلات على سطح الخلية يخضع الإلتقام عبر الحويصلات، والتي هي حيود شبه هياكل الحجم من حوالي 50-150 نم في القطر 27،38،39.

Protocol

ملاحظة: طوال هذا البروتوكول، تم العثور على نصائح والاقتراحات التالية خطوات معينة. التدوين "* 1" يشير إلى أن المذكرة 1 هو ذات الصلة لهذه الخطوة محددة، وهلم جرا.

1. الفلورسنت ديكستران طلاء الزجاج

  1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.01٪ بولي-L يسين حل كل بئر من ساترة 8 الغرفة واحتضان لمدة 10 دقيقة. إزالة مع ماصة لضمان عدم وجود السائل المتبقية.
  2. إعادة ديكستران اليكسا-647 * 1 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لإيجاد حل الأوراق المالية 2 ملغ / مل. من هذا، وتمييع 0.25 ميكرولتر في 25 ميكرولتر من غير المتأينة المياه لإيجاد حل 20 ميكروغرام / مل.
  3. لخلق طبقة وكثافة عالية من ديكستران اليكسا-647 حل تمييع 20 ميكرولتر من الحل 20 ميكروغرام / مل في ما مجموعه 200 ميكرولتر من غير المتأينة المياه. عن حل متوسطة الكثافة تمييع 2 ميكرولتر في 200 ميكرولتر من غير المتأينة المياه (1:10،000 التخفيف من محلول المخزون الأصلي). لأدنى مستوىالحل الكثافة تمييع 0.2 ميكرولتر في 200 ميكرولتر من غير المتأينة المياه (1:100،000 التخفيف من محلول المخزون الأصلي).
  4. إضافة 200 ميكرولتر من المخفف ديكستران اليكسا-647 حلول لكل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة. يمكن استخدامها مرات حضانة أطول مما قد يؤدي إلى ديكستران طلاء أكثر كثافة. إزالة وغسل مع H 2 O ثلاث مرات * 2

ملاحظة 1: تقارن ديكستران صبغة أخرى يمكن استخدامها. ويمكن أيضا أن مترافق ديكستران لا مقترن إلى الأصباغ إذا تركيبات المطلوب غير متوفرة تجاريا.

ملاحظة 2: يمكن reimaged نفس غرف ديكستران على مدى فترة من أسابيع على الرغم من أن توحيد مضان قد ينخفض. فمن المستحسن تخزين عند 4 درجات مئوية في ظل غياب أي العازلة.

2. الفلورسنت شعيرات أكتين على الزجاج

  1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.01٪ بولي-L يسين حل كل بئر من الغرفة واحتضان لمدة 10 دقيقة * 3. إعادةالتحرك مع ماصة لضمان عدم وجود السائل المتبقية.
  2. إضافة 90 ميكرولتر من العازلة الأكتين العامة (المعاد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لكل غرفة. إضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر بريفورميد الأكتين حل خيوط و 1 ميكرولتر phalloidin اليكسا-647 (0.2 وحدة، عندما يذوب في 1.5 مل من الميثانول وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) وماصة بلطف صعودا وهبوطا إلى المزيج. احتضان لمدة 30 دقيقة * 4.

ملاحظة 3: زيادة حجم الحل خيوط داخل غرفة النتائج في أقل خيوط الربط إلى الزجاج المطلي بولي-L-يسين.

ملاحظة 4: مرات الحضانة لمدة تصل إلى 48 ساعة في 4 درجات مئوية وقد تم اختبار مع نتائج جيدة. جودة الصورة الأكتين خيوط تتدهور مرة واحدة تعرضت غرفة لتبديل عازلة بحيث لا يتم المستحسن استخدام نفس العينة لأكثر من يوم واحد.

3. المكروية نيون الخرز كما إيمانية علامات

  1. إضافة حبات المخفف الى غرفة التصوير والانتظار لمدة 15 دقيقة * 5. إزالة حل ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني قبل التصوير.

ملاحظة 5 - يمكن تعديل التخفيف والحضانة الوقت للحصول على كثافات مختلفة من الخرز. هذا البروتوكول النتائج عادة ما بين 3 - 10 حبات في 20.5 ميكرون س 20.5 ميكرون حقل من رأي.

4. عامل نمو البشرة تلوين الخلية

  1. خلايا هيلا الثقافة في غرف التصوير إلى ما يقرب من 80٪ confluency في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتوميسين حل.
  2. إزالة مستنبت ويغسل مع برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ محلول الفورمالديهايد (4 مل 10٪ محلول الفورمالديهايد، 1 مل 10X PBS، 5 مل من الماء) لمدة 10 دقيقة. إزالة الفورمالديهايد ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. لا تسمح للخلايا أن تظل دبرنامج تلفزيوني راي ودائما استخدام مخزنة الحلول لتجنب الإجهاد ناقص التوتر.

تنبيه - الفورمالديهايد سامة للغاية. ضمان القفازات المناسبة، وحماية العين ومختبر المعاطف التي يرتديها. تحقق المبادئ التوجيهية المحلية للتخلص من الفورمالديهايد.

  1. إعادة EGF-اليكسا 647 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لإنشاء محلول المخزون 50 ميكروغرام / مل. إضافة 2 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم إلى 200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA الحل (في برنامج تلفزيوني). إزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا، إضافة محلول صندوق تعديل العولمة الأوروبي واحتضان لمدة 30 دقيقة.
  2. إزالة حل ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة حل حجب 0.1٪ BSA (في برنامج تلفزيوني) لمدة 15 دقيقة. إزالة هذا ويغسل 3 مرات أخرى مع برنامج تلفزيوني قبل التصوير.

5. التحول إعداد العازلة

  1. جعل محلول المخزون انزيم (A) مع 10 ميكرولتر من الكاتلاز (20 ميكروغرام / مل)، و 20 ميكرولتر من 1 M تريس (2-carboxyelthyl) الفوسفين هيدروكلوريد (4 ملم)، و 2.5 مل الجلسرين (50٪)، و 125 ميكرولترمن 1 M بوكل (25 ملم)، و 100 ميكرولتر من 1 M 7.5 درجة الحموضة تريس، حمض الهيدروكلوريك (20 ملم)، و 5 ملغ من الجلوكوز أوكسيديز (1 ملغ / مل)، وأعلى ما يصل إلى 5 مل مع حجم diH20. هذا يكفي لجعل 100 × 50 مأخوذة ميكرولتر، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية وتستخدم لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. ) تقديم حل الأسهم الجلوكوز (B) مع 4 ز الجلوكوز (100 ملغ / مل)، و 4 مل الجلسرين (10٪) و 36 مل diH20. هذا يكفي لجعل 100 × 400 ميكرولتر مأخوذة، والتي يمكن تخزينها في - 20 درجة مئوية، وتستخدم لمدة تصل إلى 1 سنة.
  3. جعل الحد من وكيل محلول المخزون (C) مع 113.6 ملغ من حمض الهيدروكلوريك MEA (1M) و 1 مل من DIH 2 0. استخدام الطازجة أو جعل 10 × 100 ميكرولتر مأخوذة، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية وتستخدم لمدة تصل إلى 1 في الشهر (لا اعادة تجميد مأخوذة).
  4. فقط قبل التصوير، ومزج انزيم (A) والجلوكوز (B) والحد من وكيل (C) حلول الأسهم معا في نسبة 50 ميكرولتر، 400 ميكرولتر، 100 ميكرولتر وجعل ما يصل الى 1 مل مع برنامج تلفزيوني * 6. وهذا المخزن المؤقت الآن مسح الأوكسجين ولها البيئة والحد (100 ملي MEA-حمض الهيدروكلوريك) * 7. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني النهائي في نطاق 6،0-8،5 (التعديل ليس من الضروري عادة) * 8.

ملاحظة 6 - هذا المخزن المؤقت هو مناسبة للاستخدام مع الأصباغ القائمة على carbocyanine مثل Cy5 واليكسا 647.

ملاحظة 7 - تركيزات الإنزيم النهائية هي 50 ميكروغرام / مل (5 وحدة / مل) من أوكسيديز الجلوكوز و 1 ميكروغرام / مل (40-60 وحدة / مل) من الكاتلاز. وبالنظر إلى النشاط الأنزيمي (وحدة) من قبل الموردين ويمكن أن تختلف. تفترض الحسابات لالكاتالاز أن 1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي بعد الخطوة 5.4 سيتضمن 50 وحدة من الانزيم. التراكيب العازلة المختلفة بما في ذلك مكونات الكسح الأكسجين مماثلة يمكن العثور 21،30،40. للحصول على ملخص تركيبات العازلة وصبغ انظر المراجع 28،29. ويلزم الجلسرين وTCEP للتخزين الطويل الأجل في -20 درجة مئوية.

ملاحظة 8 - إذا شعيرات أكتين التصوير إضافة 2 ملي MgCl 2 و 0.2 ملي ATP للمساعدة في استقرار رانه خيوط.

6. المجهر اقتناء STORM البيانات (باستخدام صبغة اليكسا 647)

  1. التبديل على المجهر STORM / النخيل، ويفضل أن لا يقل عن 3 ساعة قبل التصوير للسماح التوازن الحراري التي سيتم التوصل إليها. التصوير قبل هذا لديه فرصة زيادة الانجراف.
  2. إدراج غرفة التصوير في حامل العينة مرحلة المجهر. تأكد من أن العينة بقوة في حامل ومسطح.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني من غرفة التصوير ثم ملء إلى الأعلى مع المخزن المؤقت التبديل. وضع بعناية ساترة على الجزء العلوي من الغرفة، والتأكد من عدم وجود فقاعات على الإطلاق، والتي يتم تغطيتها الحجرة بأكملها. أعلى حتى مع العازلة إضافية أو برنامج تلفزيوني إذا رأيت أي فقاعات العازلة خلاف ذلك الأداء يمكن أن تنخفض.

تحذير - لتقليل فرص الانحراف الجانبي ومحوري من العينة فيما يتعلق عدسة الهدف فمن المستحسن أن يتم ترك العينة وعازلة للتوازنإلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل التصوير.

  1. تحديد موقع هيكل الفلورسنت التي تهم يمكن تصوير. حدد المطلوب من زاوية الإضاءة، في هذه الحالة، TIRF أو زاوية شديدة الميل ينصح لأن هذا يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تقليل خارج التركيز الخفيفة، والتي هي على وجه الخصوص من فائدة لعينات الخلايا. تأخذ إشارة محدودة حيود صورة للهيكل قبل التصوير STORM.
  2. زيادة الإثارة ليزر (مع الطول الموجي الإثارة المناسبة من حوالي 640 نانومتر) لقوة عالية، والمقابلة إلى ما يقرب من 2 كيلو واط / سم 2 في حين التصوير مع إعدادات الكاميرا من 10 مللي ثانية والتعرض لدورة الزمن ما يقرب من 50 هرتز (لقطة في الثانية) . مرة واحدة وقد انتقلت على fluorophores في نمط وامض متفرق (وربما في غضون 10 ثانية بالنسبة لمعظم العينات) جمع 10،000 الإطارات * 9.

ملاحظة 9 - 10،000 إطارات مناسبة لعينات الموصوفة هناولكن قد يكون من الضروري زيادة عدد الإطار إلى 50،000 أو أكثر للحصول على عينات أخرى.

7. إعادة فائقة الدقة صور من البيانات الخام (باستخدام عاصفة مطيرة)

  1. فتح ملف rainSTORM.m من داخل MATLAB وتشغيل (الشكل 1A).
  2. في إطار العواصف الممطرة (الشكل 1B) حدد ملف الصورة التي سيتم تحليلها باستخدام الزر استعراض. هذا ينبغي أن يكون ملف TIF (يماغيج يمكن استخدامها لتحويل أنواع الملفات الأخرى إلى تنسيق TIF). تغيير عرض بكسل لمطابقة البيانات الخام لنظام الاداة المستخدمة للحصول على البيانات * 10. ترك القيم الأخرى إلى الافتراضي.

ملاحظة 10 - كاميرا EMCCD نموذجية لديها حجم بكسل من 16 ميكرون حتى على نظام مع عدسة الهدف 100X حجم بكسل على الصورة ستكون 160 نانومتر. على النظم التجارية وعادة ما يتم عرض حجم بكسل داخل البرنامج. أحجام بكسل تختلف بين 100 نانومتر و 160 نانومتر لمعظم المجاهر التعريب.

  1. اضغط على زر 'معالجة الصور "وانتظر حتى تظهر صورة أولية. ومدة المعالجة تعتمد على حجم الملف، مواصفات الكمبيوتر وعدد يومض المرشح ضمن البيانات الخام * 11.

ملاحظة 11 - استغرق 10،000 تسلسل الإطار من الأكتين وبيانات صندوق تعديل العولمة الأوروبي و 23 ثانية و 25 ثانية على التوالي لمعالجة باستخدام جهاز كمبيوتر مع وحدة المعالجة المركزية إنتل زيون E5420. باستخدام نفس الكمبيوتر بدون الأدوات المعالجة المتوازية في MATLAB، أو مع جهاز كمبيوتر من دون معالجة جوهر متعددة، ومرات 66 ثانية و 81 ثانية على التوالي.

  1. لتوليد فائقة الدقة الصورة إضغط على زر تحديث 'فتح المعلقين' وسوف تظهر النافذة الثانية (الشكل 1C). اضغط على زر 'ضبط التباين "من أجل تغيير صورة العرض كما تريد (1D الشكل). في بعض الحالات، حيث كانت الصورة مظلمة جدا وينبغي انخفضت القيمة القصوى.
  2. استخدام لفةiewer النافذة (الشكل 1C) لتوليد مفيدة مقاييس جودة الصورة وصقل فائقة دقة وضوح الصورة أكثر. تعيين أول ثلاث معلمات لمراقبة الجودة لقيم 4،000، 0.1 و 0،8-2،0 التوالي * 12. تحديث التهم لكل قيمة الفوتون، والتي ينبغي أن تكون إما على أساس قياس الفوتون الفوتون المعايرة أو باستخدام منحنى منحنى المعايرة القيم المحددة من قبل الشركة المصنعة للكاميرا لتحقيق مكاسب خاصة إعداد EM. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على الدقة وقياسات دقيقة القرار * 13.

ملاحظة 12 - التهم الإشارة ترفض يومض على أساس معايير السطوع. وارتفاع قيمة أكثر إشراقا يجب أن يكون وميض لتصبح مقبولة باعتبارها التعريب في الصورة النهائية. قد تحتاج هذا أن يتغير اعتمادا على الانتاج الفوتون من الصبغة والتعرض الوقت وحساسية الكاميرا. التسامح ترفض يومض إذا كان هناك خطأ مربع كبير بين إشارة والمجهزة جاوس أي دقمم ouble. PSF المدى سيغما ترفض يومض إذا كان العرض المجهزة من قوات الأمن الفلسطينية تقع خارج هذا النطاق، أي مجموعة أضيق يمكن استخدامها لإشارات رفض الخروج من التركيز والنقط مجمعة كبيرة من مضان ثابتة. باستخدام مجموعة أوسع قد يؤدي إلى القطع الأثرية mislocalization الظهور في الصورة النهائية. في الممارسة العملية، فمن المستحسن لأداء مراقبة الجودة الأولية باستخدام قطع المعلمة الدقة التعريب.

ملاحظة 13 - لمعرفة المزيد عن مقاييس القرار، انظر المراجع 23،27. في سطور من خلال معرفة عدد الفوتونات التي تنتجها كل وميض فمن الممكن لحساب الدقة توطين كل التعريب وبالتالي اشتقاق يعني عموما تقديرات الدقة للصورة بأكملها. باستخدام أندور iXON DU-897E مع إعداد كسب 200 من التهم في قيمة الفوتون هو 9.04.

  1. تغيير قطع الدقة التعريب (الشكل 1C) إلى المفاضلة بين تحسين نبذة توطين متوسطايون ضد عدد التعريب في الصورة النهائية. ينصح قيم 30-50 نانومتر تبعا لنوعية البيانات والعينة. كل من رسوم بيانية وملفات info.txt يمكن استخدامها لإبلاغ هذا القرار (أرقام 1F و1G).
  2. عامل المقياس إعادة الإعمار (الشكل 1C) الافتراضي هو 5، والتي سوف تولد فائقة القرار بكسل من 32 نانومتر على افتراض أن عرض بكسل في الصور الأصلية هو 160 نانومتر. إذا كانت الصور الخام لديها حجم بكسل من 100 نانومتر وهذا سوف تنتج صورا فائقة الدقة مع بكسل من 20 نانومتر. زيادة عامل مقياس لإنتاج أصغر فائقة القرار بكسل في الصورة النهائية * 14.

ملاحظة 14 - قرار التعريب المجهري يعتمد على تجانس اللازمة لالتصور (أي حجم بكسل لإعادة الإعمار الرسم البياني بسيطة)، وكذلك دقة الترجمة. في الواقع، يجب أن يكون حجم بكسل إعادة الإعمار عموما أصغر من التعريبالدقة (انظر متري متوسط ​​تقديرات دقيقة في ملف نصي المعلومات - الخطوات 6.11 و 6.12). في هذه الحالة فقدان القرار بسبب إعادة الإعمار حجم بكسل ستكون صغيرة 23،27. على سبيل المثال تقديرات متوسط ​​الدقة في الصف والتوجيه عمود الشكل 4E هي 16.1 و 16.2 نانومتر نانومتر. وقد استخدم حجم بكسل 16 نانومتر إلى تصور هذه البيانات (عامل المقياس إعادة إعمار 10 مع عرض بكسل الأصلي من 160 نانومتر).

  1. تعديل نطاق الإطار الحد (الشكل 1C) لتقييد إعادة الإعمار إلى مجموعات فرعية من البيانات الخام، وعلى سبيل المثال [2001-الوقود النووي المشع] تستبعد 2،000 إطارات الأولي من البيانات الخام.
  2. اضغط على "تشغيل المعلقين 'زر (الشكل 1C) لإنشاء فائقة دقة وضوح الصورة المحدثة (الشكل 1E).
  3. اضغط على زر 'مشاهدة المدرج الإحصائي "(الشكل 1C)، وذلك لعرض مقاييس جودة الصورة (الشكل 1F) * 15.
    4. ملاحظة 15 - الرسم البياني في أعلى الصفحة على اليمين تصور عدد من تعريب المقبولة ضد عدد الإطار الكاميرا والرسم البياني طومسون التعريب توضيحات في أسفل اليمين (الشكل 1F) يمكن استخدامها لإبلاغ الخيار الدقة توطين استعراض قطع. على سبيل المثال، فإن استخدام قطع 50 نانومتر استبعاد جميع تعريب بدقة أسوأ من الإدماج في فائقة دقة وضوح الصورة النهائية.

    1. اضغط على زر 'حفظ الصورة' في المراجع (الشكل 1C) من أجل إنقاذ كل هذه البيانات * 16.

    ملاحظة 16 - يمكن حفظ ما بين 3 و 5 ملفات اعتمادا على الخيارات المحددة (صورة خلاصة القول، STORMdataImage، STORMprocessed، معلومات وhists)، انظر الشكل 1G. يتم عرض الصورة STORM معالجتها مع تعديل التباين واللون الخرائط. وSTORMdataImage هي صورة الرمادي، والتي مستوى الرمادية من كل بكسل يساوي خدرإيه تعريب التي تم تحديدها في داخلها.

    1. بعد دراسة البيانات (مثل ملف Info.txt ورسوم بيانية) العودة إلى الخطوة 7.6 وكرر الخطوات اللاحقة مع معلمات مراجع مختلفة اذا شئت. والضغط على 'حفظ الصورة' في الخطوة 7.11 الكتابة فوق البيانات المحفوظة سابقا.

    8. تتبع مربع وتصحيح الانحراف (باستخدام عاصفة مطيرة)

    1. اتبع الخطوات من 7،1-7،9 لتوليد صورة بالطريقة العادية.
    2. اضغط على زر 'تتبع صندوق "في المراجع (الشكل 1C) وانقر واسحب مربع فوق علامة إيمانية أو هيكل الفائدة على الصورة التي تم استعراضها.
    3. انتظر حتى يظهر صورة جديدة، والتي سوف تعرض 'المراكز محاصر' (انظر الأرقام 6B، 6C و6F للحصول على أمثلة). حفظ هذه الصورة اذا شئت.
    4. إذا كان موضع اهتمام هو علامة إيمانية ثم الانجراف التصحيح لا يمكن أن يؤديها من خلال النقر على زر 'مراسيها' تليها 'الفرعيةزر الجهاز الانجراف. أخيرا انقر على "تشغيل المعلقين 'مرة أخرى لتوليد صورة جديدة STORM، والتي سيكون لها الآن جميع تعريب تصحيحها وفقا لمواقف إيمانية علامة. يتم حذف المناصب حبة من الصورة النهائية التي تم استعراضها.
    5. إذا كانت هناك علامات إيمانية أخرى داخل الانجراف تصحيح الصورة النهائية، وهذه يمكن إزالتها عن طريق الضغط على 'تتبع صندوق'، 'حذف محاصر' ثم 'تشغيل المعلقين' عدة مرات كما تريد.

Representative Results

ديكستران

A الطلاء الناجح لديكستران يجب أن ينتج أحادي الطبقة الفلورسنت. في تركيز عال هذا يجب أن تظهر موحدة نسبيا. بتركيزات أقل سيظهر تناثرا (الشكل 2A). العديد من المجاهر STORM / PALM لديها القدرة على تغيير زاوية الإضاءة من epifluorescence TIRF ل. عند استخدام عرض الكاميرا الإطار الكامل، على سبيل المثال في 512 س 512 بكسل على كاميرا EMCCD نموذجية، ينبغي مراعاتها حتى الإضاءة. إذا كان هناك أي خطوط أو المناطق خارج التركيز هذا يمكن أن تشير إلى أنه ينبغي إعادة إدراجها العينة في حامل العينة مع زيت جديد على عدسة الهدف. بدلا من ذلك فإنه قد تشير إلى وجود مشكلة مع المجهر.

عند الحصول على البيانات الخام فائقة القرار ينبغي زيادة الليزر التصوير في السلطة إلى ما يقرب من 2 كيلو واط / سم 2. وسوف يكون هناك انفجار الأولي من مضان يليه امض كما هي الدافع وراء fluorophores فيللدول الظلام مؤقتة. في ديكستران عالية الكثافة من المحتمل أن تتداخل يومض، لا سيما بالقرب من بداية الحصول على الصور (فيديو 1). بكثافات متوسطة ومنخفضة وينبغي أن تكون هذه يومض متفرق، أي فصل مكانيا، والتركيز مع عدم وجود خلفية واضحة (انظر الأطر 2،000، 5،000 و 8،000، الشكل 2A، فيديو 2 و 3). خلال هذه المرحلة الحصول على الصور، في إضاءة الليزر المستمر، فإن عدد يومض تتناقص مع الوقت (مقارنة مع الإطار الإطار 2،000 8،000 في العينة كثافة عالية، والشكل 2A). والفرق الرئيسي بين مختلف الصور فائقة الدقة من تركيزات مختلفة ديكستران (عالية ومتوسطة ومنخفضة) هو تناقص عدد تعريب (أرقام 2A و 2B). وبعبارة أخرى، فإن تركيز جزيئات الفلورسنت، وعدد من يومض في البيانات الخام وعدد تعريب لها علاقة النسبي. هذه العلاقة،ومع ذلك، ليس واحد الخطي البسيط كما في جزيء كثافات عالية جدا البرنامج غير قادر على توطين الجزيئات بنجاح (قارن خطوط حمراء وزرقاء، الشكل 2C). السبب في ذلك هو أن في تركيز عال أنه ليس من الممكن لبرامج معالجة لتناسب المواقف باستخدام خوارزمية المناسب التمويه حيث يومض غير قابلة للمتفرق. كما خفض يومض خلال المرحلة اقتناء بسبب photobleaching من البرنامج يمكن أن يصلح أكثر وأكثر من يومض عندما تصبح متفرق (أرقام 2A و 2C). وعلاوة على ذلك، قد جزيئات الصبغة الفردية وميض، وبالتالي تكون مترجمة أكثر من مرة 28،41،42.

وهناك مشكلة شائعة عند التصوير أي من هذه العينات، ولكن لا سيما ذات الكثافة العالية ديكستران واحد، يمكن أن يكون وجود مشرق ولكن غير مركزة الضباب الفلورسنت التي يبدو أن نشرها بسرعة خلال صورة المرحلة اقتناء STORM. هذا يختلف عن fluorophores التباين العالي علىسطح الزجاج، وهو ما يمكن ملاحظته وامض (الشكل 3A، فيديو 5). هذه الجزيئات الفلورسنت منفصلة يمكن الوقاية منها أو إزالتها عن طريق زيادة عدد الخطوات يغسل مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة العازلة التبديل أو عن طريق إضافة جديدة عازلة التحول إلى غرفة (الشكل 3B، فيديو 6). تجهيز ومقارنة البيانات من كل النتائج تسلسل الصور في مختلف جدا صور فائقة الدقة والتي لديها انخفاض في كل من عدد تعريب والدقة التي يمكن تركيبها من البرنامج في توطين يومض (أرقام 3C، 3D، 3E و3F).

خيوط الأكتين

ويمكن رؤية خيوط الأكتين بريفورميد عالقة على سطح الزجاج بواسطة محدودة حيود التصوير (الشكل 4A-4C). إذا يبدو أن عدد خيوط منخفضة جدا، ثم وقتا أطول الحضانة يمكن استخدامها أو انخفاض في حجم الأكتينيساعد حل خيوط أيضا. اختيار واحد خيوط مشرقة نسبيا (الشكل 4D) بدلا من النتائج في مجالات متشابكة صور ذات جودة أفضل. خلال مرحلة الاستحواذ، وينبغي أن ينظر مشرق يومض في التركيز على طول خيوط (فيديو 7). وينبغي أن ينظر امض متفرق أثناء مرحلة اكتساب ثم بعد ذلك في البيانات التي تتم معالجتها يجب أن يكون هناك خيوط رقيقة المستمر (الشكل 4E) وتعريب في الإطار ينبغي انخفاض تدريجي (الشكل 4F)، على خلاف في الشكل 3E.

إذا امض هو غير متفرق، أو إذا كان البرنامج لا تكون قادرة على توطين الجزيئات، وهو قطعة أثرية أكثر دهاء، ودعا mislocalization 32، يمكن أن تؤدي. هذا ينشأ عندما المتوسطات البرمجيات موقف جزيئين متداخلة والتعريب هو موقف في منتصف الطريق بينهما. إشارة إلى أن لم يكن هناك عدد كبير من تداخل BLINKS، وبالتالي mislocalizations، هو أن تقديرات الدقة يعني يجب أن تكون هي نفسها في الصف والعمود الاتجاهات، أي أفقيا وعموديا؛ حيث هناك mislocalizations كانت ستحدث هذه على طول خيوط، أنتجت أكبر من طرفة العادي ( أي موزعة على أكثر بكسل) وهو ما يؤدي الي تم المترجمة مع أقل دقة في واحدة من الاتجاهات. ويعتبر هذا أكثر سهولة حيث هناك خيوط الأكتين واحد في مجال التصوير وذلك هو الكذب أفقيا أو عموديا. في هذه الحالة، المجهر STORM، حققت الدقة متوسط ​​16 نانومتر في كلا الاتجاهين. هذه النتائج في الحد من الدقة، وهو مقياس لدقة وضوح الصورة فعالة من حوالي 34 نانومتر. يتم توفير هذه المقاييس التي كتبها عاصفة مطيرة 27، ولكن، كما لدينا البنية الخيطية قطرها موحد، 7 نانومتر مع صغيرة جدا phalloidin اليكسا-647 التسمية يمكن أن نأخذ قدرا من FWHM لتقدير دقة الصورة. بواسطة جدرانالجناح خط مستقيم من خلال خيوط من فائقة دقة وضوح الصورة في ImageJ (الشكل 4G)، وذلك باستخدام ميزة الشخصي مؤامرة (الشكل 4H) وأداء لاحقا نوبة جاوس (الشكل 4I) يحسب كما FWHM 43.2 نانومتر. عند محاولة هذا القياس نوصي أن حجم بكسل يجب أن تطابق أو يكون أصغر قليلا من تقدير متوسط ​​الدقة للصورة (انظر ملف info.txt الشكل 1G). في هذه الحالة، استخدمت 16 بكسل نانومتر لإعادة بناء صورة.

يمكن أن تحدث اثنين من المشاكل ذات الصلة مع STORM، حيث تصبح fluorophores امض غير متفرق، أي الجزيئات الفردية ضمن ما يقرب من 250 نانومتر وميض في نفس الوقت، وبالتالي فإن إشارات التداخل. الأول هو أن الاعتماد على خوارزمية ومعايير مراقبة الجودة التي يستخدمها، قد لا تكون مترجمة يومض على الإطلاق. هذه النتائج في صور فائقة الدقة مع عدد قليل أو أي تعريب. المشكلة الثانيةيحدث mislocalizations عندما وقع يومض اثنين قريبة بما فيه الكفاية لبعضها البعض لتبدو وكأنها وميض واحد. في هذه الحالة الموقف في الصورة النهائية يمثل في المتوسط ​​من الاثنين. لمزيد من التفاصيل حول هذا انظر المرجع 32. في كلتا الحالتين هذا يمكن أن يحدث مع العينات كثافة عالية جدا، وعدم كفاية قوة الليزر أو مع التحول مشاكل العازلة. هذه المشكلة هو واضح حيث كان عدد من خيوط الأكتين والمتفرعة و / أو عبور بعضهما البعض (أرقام 5A-D، فيديو 9). من خلال تجهيز مجموعات فرعية من الإطارات، ومقارنة الأطر 5،000 الأول والأخير يمكننا أن نرى الصورة الناتجة مختلفة. في فائقة دقة وضوح الصورة باستخدام إطارات 5،000 الأول (الشكل 5C) يمكننا أن نرى أن هناك العديد من تعريب في منتصف الصورة، ولكن عند استخدام إطارات 5،000 مشاركة، وعدد قليل جدا من هذه واضحة ونحن مع اليسار فقط خيوط، وإن كانت متقطعة نوعا ما المستحق للانخفاض عدد تعريب في ايماجه (الشكل 5D). إذا اشتبه كثافة عالية جدا مقارنة امض من الصور مع التعريب في بيانات الإطار يمكن أن توحي بقوة بأن هذه المشكلة هي التي تحدث، وخلال أول مجموعة من الأطر هناك عدد متوسط ​​من تعريب في إطار أكثر من 10 مقارنة مع المجموعة الأخيرة من الإطارات حيث هو حوالي 4 (الشكل 5E). من أجل تقليل احتمال حدوث mislocalizations وهو مثالي لديك عدد قليل من تعريب في إطار ممكن، على الرغم من أن إذا كان هناك عدد كبير من الجزيئات ليمكن تصوير أي لعينة عالية الكثافة، وهذا يتطلب أن عددا كبيرا من الاستحواذ أن تؤخذ إطارات تؤدي إلى مشكلة أخرى في المجهر STORM وهو الانجراف.

الانجراف الوحشي - شعيرات أكتين وإيمانية علامات

يحدث الانجراف عندما يتحرك العينة فيما يتعلق عدسة الهدف من خلال مرحلة الحصول على البيانات. هذا هو الصعب أو المستحيل أن نرى الزيتوز مرحلة الحصول على الصور، وخاصة إذا كان الجانبي بدلا من محوري، أو ما لم يتم قياسه على وجه التحديد، كما هو عادة أقل من 50 نانومتر على مدى عدة دقائق لأنظمة المجهر مستقرة نسبيا. ومع ذلك، في الصور التي أعيد بناؤها من الهياكل المعروفة مثل خيوط الأكتين مع هيكل واضحة المعالم، ويمكن الكشف عنها في الصور فائقة الدقة. أول علامة على أن الانحراف الجانبي قد حدث هو ​​أن هيكل هو أكبر من المتوقع (الشكل 6A، فيديو 8) على سبيل المثال مع FWHM كبيرة نسبيا مقارنة مع البيانات الحد من الدقة عاصفة مطيرة، في هذه الحالة 90 نانومتر مقارنة مع 67 نانومتر. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة للكشف عن الانجراف هو بمقارنة تعريب بوصفها وظيفة من الوقت، أي رؤية ما إذا مشردون في تعريب في الإطارات في وقت لاحق مقارنة مع تلك الموجودة في إطارات في وقت مبكر. هذا ويمكن رؤيتها بوضوح في حالة من خيوط الأكتين، والتي هي صغيرة جدا وذات هيكل موحد، عندماعرض مع رمز اللون باستخدام ميزة تتبع مربع في عاصفة مطيرة (أرقام 6B و 6C).

الانجراف مشكلة المعترف بها جيدا، وهناك عدد من الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها للحد منه 19 أو تصحيحها بعد الحيازة إما باستخدام علامات إيمانية 21،43 أو الارتباطات عبر 44. من أجل قياس الانجراف والصحيح لذلك، والخرز الفلورسنت من 100 نانومتر قطرها يمكن أن تستخدم كعلامات إيمانية (الشكل 6D). لأنها صغيرة ومشرق موقفهم يمكن قياس بدقة باستخدام خوارزميات المناسب التمويه، مثل العواصف الممطرة. في المثال حيث هناك الانجراف الشديد نسبيا من حوالي 100 نانومتر على مدار 3 دقيقة 10 ثانية، خلال مرحلة اكتساب (الشكل 6E)، ميزة تتبع نفس مربع يمكن استخدامها لرمز اللون وتأكيد أن وقعت الانجراف (الشكل 6F ). وجميع حبات الأربعة في هذا المثال تظهر الانجراف شبه متطابقة فمن عossible لاختيار واحد منهم، في هذه الحالة حبة 2، لاستخدامها كمرجع وطرح الانجراف من حبات أخرى (الشكل 6G). بإضافة علامات إيمانية لعينة بيولوجية من الفائدة ثم يصبح من الممكن قياس وتصحيح أي انحراف حيث البنية الأساسية غير معروف أو متغير أكثر بكثير من مجرد خيوط الأكتين أو حبة الفلورسنت.

عامل نمو البشرة

أخيرا، خلايا هيلا صندوق تعديل العولمة الأوروبي الملون ويمكن أن تستخدم لإعطاء مثال واقعي لدقة الصورة في الخلايا (الشكل 7A، فيديو 10). هذه الخلايا هي واضحة نسبيا للصورة كما ينبغي أن يكون للأغلبية صندوق تعديل العولمة الأوروبي ومضان في التركيز الطائرة من على سطح الخلية على مقربة من ساترة. المنطقة أقل مشرق في مركز يتوافق مع موقف النواة. TIRF الإضاءة يمكن أن تعزز جودة الصورة من خلال القضاء خارج التركيز مضان القادمة من أجزاء من الخلية مembrane لا على مقربة من الزجاج (حوالي 150 نانومتر تغلغل في الخلايا). المركزة المناطق ذات الاهتمام في الصورة محدودة وعادة ما تكون غير واضحة حيود (أرقام 7B و7C)، ولكن في الصور فائقة الدقة ينبغي أن يكون هناك خليط من التكتلات وأحيانا بكسل واحدة معزولة (أرقام 7D-7F). وهذه تمثل إما مستقبلات EGF معزولة على سطح الخلية أو ممكن كمية صغيرة من الربط غير محددة. سوف تكون مجموعات حوالي 100 نانومتر في القطر، ومن المرجح أن تتوافق مع تشكيل الحفر والحويصلات، المسار الذي عبر صندوق تعديل العولمة الأوروبي هو في الغالب أسفل تنظيم وendocytosed. نموذجي متوسط ​​تقديرات الدقة حوالي 20 نانومتر لهذا النوع من العينة مع حد من الدقة ما يقرب من 45 نانومتر. تجدر الإشارة إلى أن هذا الإجراء الحد من الدقة القرار الفعال لا يأخذ بعين الاعتبار حجم التسمية، أو أي الانجراف، والتي يمكن قياسها مع علامات إيمانية، ولكن لا يزال NOTICeable من قبل "ذيول المذنب" على مجموعات أو باستخدام ميزة تتبع مربع كما هو مبين في الشكل (6) والموضحة في قسم البروتوكول 8.

عنصر تركيز النهائي
الكاتالاز 1 ميكروغرام / مل (50 وحدة)
جلوكوز 40 ملغ / مل
الجلوكوز أوكسيديز 50 ميكروغرام / مل
الجلسرين 12.50٪
بوكل 1.25 ملي
MEA، حمض الهيدروكلوريك 100 ملي
TCEP 200 ميكرومتر
تريس 1 ملم

الجدول 3. التبديل العازلة

إعدادات اقتناء نموذجية قيمة
حجم بكسل (نانومتر) 160
وقت التعرض (ميللي ثانية) 10
ربح 200
حجم الإطار (بكسل) 128 × 128
دورة الزمن (الثانية) 52.5
عدد الإطار 10،000
640 نانومتر ليزر كثافة الطاقة (كيلوواط / سم 2) 2

الجدول 4. إعدادات اقتناء

الشكل 1
الشكل 1. STORM إعادة الإعمار عن طريق صورة عاصفة مطيرة. (A) فتح عاصفة مطيرة من داخل MATLAB. (B) عاصفة مطيرة واجهة المستخدم الرسومية (GUI). (C) عاصفة مطيرة المعلقين واجهة المستخدم الرسومية. (D) ضبط نافذة التباين. (E) صورة STORM بعد مراجعة وتعديل التباين. (F) صاحبtograms من مقاييس جودة الصورة. (G) ملفات لدت بعد الضغط على زر حفظ الصورة في المراجع واجهة المستخدم الرسومية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2: (أ) حيود محدودة (DL) الصور تظهر تركيزات مختلفة من ديكستران قبل التصوير STORM. فائقة الدقة (SR) إعادة بناء صورة لها حجم بكسل من 25 نانومتر. وقد تم جمع الصور مع 10،000 ترد 128 × 128 بكسل حجم الإطار والأطر الفردية من هذا التسلسل (2،000، 5،000، 8،000). اكتسبت مع الوقت 10 ميللي ثانية في التعرض 52.5 لقطة في الثانية. الصور لها حجم بكسل من 160 نانومتر. لوضوح بعرض 0.1٪ بكسل تشبع تعزيز النقيض تم تطبيقها باستخدام يماغيج. الدقة متوسطالتقديرات هي 28 نانومتر (عالية)، 24 نانومتر (متوسطة) و 16 نانومتر (منخفض) للصور ديكستران مختلفة. كثافة التعريب هي 724 ​​ميكرون في 2 (عالية)، 526 ميكرومتر في 2 (متوسطة) و 13 في أم 2 (منخفضة). (ب) يظهر الرسم البياني في المتوسط ​​ثلاثة متواليات 10،000 الإطار كل تركيز ديكستران. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. (C) رسم بياني بالتآمر عدد تعريب المقبولة في الإطار باستخدام المتداول 100 متوسط ​​الإطار. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الرقم 3. جودة الفقراء ديكستران البيانات. (A) حيود إطار محدود من تسلسل 15،000 الإطار STORM. لاحظ الضباب الفلورسنت منتشر عبر الصورة. ويتسبب هذا عن طريق fluoropho الدقة نشرها من خلال وسيلة. 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. (ب) نفس (A) بعد المخزن المؤقت قد تغير. لاحظ تحسنا على النقيض حيث تم غسلها fluorophores غير منضم بعيدا. (C) وإعادة بناء صورة فائقة الدقة المقابلة لجمع البيانات في (A). مطابقة حجم الصورة ولكن مع بكسل من 25 نانومتر. التقدير الدقة متوسط ​​هو 35 نانومتر. (D) وإعادة الإعمار صورة فائقة الدقة المقابلة لجمع البيانات في (B). مطابقة حجم الصورة ولكن مع بكسل من 25 نانومتر. التقدير الدقة متوسط ​​هو 30 نانومتر. (E) رسم بياني بالتآمر عدد تعريب المقبولة في الإطار، وذلك باستخدام المتداول 100 متوسط ​​الإطار. الخط الأحمر يتوافق مع تسلسل STORM (A & C) حيث يوجد خلفية عالية. الخط الازرق تظهر بيانات المقابلة ل(B & D)، حيث الخلفية منخفضة. (F) رسم بياني يوضح عدد توطين مقبولة للصور عالية الموافق (C) و (D) البيانات الأساسية منخفضة.أ href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" الهدف = "_blank"> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

الرقم 4
الشكل 4. نموذجية البيانات أكتين. (AC) وصور محدودة حيود خيوط الأكتين قبل إضافة التبديل العازلة والتصوير STORM. ويمكن رؤية أطوال متغير من خيوط. خيوط مشرقة جدا وغالبا ما تكون عدة خيوط متشابكة معا. حجم بكسل هو 160 نانومتر. (D) صورة محدودة الحيود من خيوط الأكتين واحد. (E) صورة STORM (0.1٪ تعزيز النقيض تطبيقها في ImageJ). من تسلسل 10،000 الإطار مع 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. حجم بكسل هو 16 نانومتر. التقدير الدقة متوسط ​​هو 16 نانومتر. (F) رسم بياني المتهم بالتآمر في عدد من توطين مقبولةق لكل إطار، وذلك باستخدام المتداول 100 متوسط ​​الإطار. (G) والتكبير في المنطقة من خيوط الأكتين من (E) قبل النقيض تعزيز مع ملف الخط الأصفر رسمها عبر. (H) A مشاهدة الملف الشخصي مؤامرة من الخط الأصفر رسمها عبر خيوط الأكتين. ولدت في ImageJ. (I) A تناسب التمويه من التشكيل الجانبي المؤامرة باستخدام أداة منحنى المناسب في ImageJ. الانحراف المعياري، د، كان مضروبا 2.35 للحصول على قياس FWHM من 43.2 نانومتر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5
الرقم 5. Mislocalized شعيرات أكتين. (A) محدودة حيود خيوط الأكتين. 160 بكسل نانومتر. (ب) صورة STORM من خيوط الأكتين هو مبين في (A). من تسلسل 20،000 الإطار مع 128 × 128 بكسل فرامحجم ه، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. حجم STORM بكسل هو 16 نانومتر. تم تجهيز جميع الأطر 20،000. التقدير الدقة متوسط ​​هو 17 نانومتر. (C) و(B)، ولكن فقط مع إطارات 5000 الأول من تسلسل 20،000 الإطار معالجتها. التقدير الدقة متوسط ​​هو 18 نانومتر. (D) و(B)، ولكن فقط مع إطارات 5،000 الأخير من تسلسل 20،000 الإطار معالجتها. التقدير الدقة متوسط ​​هو 17 نانومتر. (E) رسم بياني لتعريب في بيانات الإطار الكامل من 128 × 128 بكسل وعرض إطار.

الرقم 6
الرقم 6. الوحشي الانجراف. (A) الصورة STORM من خيوط الأكتين بناؤها من تسلسل 10،000 الإطار مع 64 × 64 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض والتي اتخذت في 64.6 لقطة في الثانية. حجم STORM بكسل هو 32 نانومتر. التقدير هو متوسط ​​الدقة32 نانومتر. (ب) عرض الصور STORM باستخدام ميزة "تتبع صندوق" في عاصفة مطيرة. يتم عرض تعريب مع اللون المطابق لعدد من الإطار عندما تم الحصول عليها، على سبيل المثال، من تعريب في تسلسل اكتساب المبكرة الأزرق؛ تعريب من في وقت متأخر من تسلسل حيازة هي الأحمر. الألوان النازحين تشير إلى أن الانجراف قد حدث. (C) والتكبير في منطقة (أ) عرض باستخدام ميزة تتبع مربع في عاصفة مطيرة. الألوان النازحين تشير حدث الانجراف. (D) وحيود صورة محدودة من أربع حبات 100 نانومتر الفلورسنت، والتي يمكن أن تستخدم كعلامات إيمانية. حجم بكسل 160 نانومتر. أرقام 1-4 المعرض اقتصاص والتكبير الخرز بشكل فردي. (E) كل حبة الفلورسنت الموافق (D) أعيد بناؤها في عاصفة مطيرة من تسلسل 10،000 الإطار مع 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. حجم STORM بكسل 5 نانومتر. التقدير الدقة يعني هو 7 نانومتر. (F) الخرز الموافق (D) و (E)،عرض باستخدام ميزة "تتبع صندوق". الألوان النازحين تشير حدث الانجراف. (G) عن طريق عدد 2 حبة كمرجع، والخرز 1، يتم عرض 3 و 4 بعد ميزة "اطرح الانجراف 'يتم استخدامها في عاصفة مطيرة. مقارنة مع (E) يدل على أنه قد تم تصحيح الانحراف الجانبي. حجم STORM بكسل 5 نانومتر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 7
الرقم 7. نموذجية بيانات صندوق تعديل العولمة الأوروبي. (A) حيود صورة محدودة لجزء من خلية هيلا ركزت على سطح الخلية القاعدية. تشير المربعات الصفراء في أسرع المناطق ذات الاهتمام هو مبين في (B) و (C). (ب) تم تكبيره في صورة الحيود محدودة من منطقة بالقرب من حافة الخلية (مربع B). (C) المركزة حيود محدودة صورة من المنطقة تحت نواة (مربع C). (D) STORM الصورة المقابلة ل(A). من تسلسل 10،000 الإطار مع 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. حجم STORM بكسل هو 25 نانومتر. التقدير الدقة متوسط ​​هو 21 نانومتر. (E) STORM الصورة المقابلة إلى مربع E (D). (F) STORM الصورة المقابلة إلى مربع F (D). (G) في تعريب بيانات الإطار من (D). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

فيديوهات 1-4 فيديو تتوافق مع الشكل 2A مع اختلاف تركيزات ديكستران: 1 = عالية، 2 = متوسط، 3 = منخفض، 4 = لا شيء). 10،000 الإطار متواليات مع 128 × 128 بكسل الأحجام الإطار، استحوذت مع الوقت 10 ميللي ثانية في التعرض 52.5 لقطة في الثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو 1 ،load/50579/50579video2.mov "الهدف =" _blank "> فيديو 2، فيديو 3 ، فيديو 4

أشرطة الفيديو 5-6. فيديو تتوافق مع الشكل 3 A & B. الفيديو 5 هو قبل غسل والفيديو 6 هو آخر يغسل بعد أن تم إزالة fluorophores غير منضم. 15،000 الإطار تسلسل باستخدام 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو 5 ، 6 الفيديو .

الفيديو 7. يظهر الفيديو تسلسل الإطار الخام التي تم معالجتها لتوليد الصورة STORM في الشكل 4E. 10،000 الإطار sequeالامتحانات التنافسية الوطنية مع 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو 7 .

الفيديو 8. يظهر الفيديو تسلسل الإطار الخام التي تم معالجتها لتوليد الصورة STORM في الشكل 5B. 20،000 تسلسل الإطار مع 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو 8 .

الفيديو 9. يظهر الفيديو تسلسل الإطار الخام التي تم معالجتها لتوليد الصورة STORM في الشكل 6A. 10،000 تسلسل الإطار مع 64 × 64 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض والتي اتخذت في 64.6 لقطة في الثانية. المبادرة القطريةالمسيخ هنا لمشاهدة الفيديو 9.

الفيديو 10. فيديو يبين تسلسل الإطار الخام التي تم معالجتها لتوليد الصورة STORM في الشكل 7D. 10،000 تسلسل الإطار مع 128 × 128 بكسل حجم الإطار، 10 ميللي ثانية زمن التعرض وحصلت على 52.5 لقطة في الثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو 10 .

Discussion

وتبين لنا مع بعض عينات اختبار بسيط وبحرية المتاحة تجهيز عاصفة مطيرة البرمجيات فمن الممكن لتحسين STORM فائقة التصوير القرار. وهذه الأدوات والأساليب توفير نقطة انطلاق مفيدة للمستخدمين الجدد وطرق للمستخدمين ذوي الخبرة لزيادة الثقة في المجاهر واستخدامها منهم لدراسة البنيات البيولوجية والخلوية مع التفاصيل لم يسبق لها مثيل. باستخدام مزيج من عينات مع هياكل معروفة أو مفهومة جيدا وخوارزمية التي يمكن أن تنتج عددا من المفيد مقاييس جودة الصورة، مثل تقديرات الدقة متوسط، عدد التعريب ورسوم بيانية تظهر أنه من الممكن لتحسين جودة الصورة والحصول على قدر أكبر من الثقة في عملية التصوير STORM. ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع النهج إلى الحصول على البيانات كما أن هناك عددا من تكوينات مختلفة المجهر التجاري والذي يتم بناؤه ذاتيا التي يمكن استخدامها. وعلاوة على ذلك، هناك العديد من إعداد العينات وصورة الخطوات التي يمكن الاستحواذ influجربت بالتالي فإن الصورة النهائية لها أدوات البرمجيات واختبار عينات أمر بالغ الأهمية لفهم وتحسين جودة الصورة STORM.

بالإضافة هذه البروتوكولات يمكن أن توفر وسائل مفيدة وأقل غموضا من أي استكشاف المشكلات التي قد تنشأ. على سبيل المثال العينة ديكستران هو وسيلة مفيدة جدا لتحديد إذا كان هناك أي اختلال شعاع الليزر أو الإضاءة غير المتكافئ للالعينة. إذا كانت هناك مخاوف من أن المخزن المؤقت التحول قد لا تعمل اختبار بصرية بسيطة جدا لمعرفة ما إذا كان هناك أي و'امض' مساعدة. خيوط الأكتين هي طريقة مفيدة لقياس القرار باستخدام مقارنات FWHM فضلا عن تسليط الضوء على الانجراف وmislocalization التحف. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن وسائل فائقة الدقة على أساس التوطين يمكن أن يكون كثافة fluorophore الحساسة، وبغض النظر عن العوامل المساهمة الأخرى، مثل التعرض مرات، ومعدلات الإطار، القوى الليزر والطريقة تتم معالجة الصورة، فمن المستحيل لتعيين قرار لالمجهر معين ونفترض أن جميع الصور سوف يكون هذا القرار. ما هو ممكن، ولكن هو لقياس الجوانب المختلفة للقرار مثل توضيحات يعني التوطين، توطين عدد 27 والانجراف. حتى لو لم يمكن إدراج علامات إيمانية في كل تجربة ما في وسعهم، على الأقل، يمكن استخدامها لوصف نظام المجهر، والبيئة، وفهم أفضل الاعتبارات التشغيلية مثل كيفية مطلوب الكثير من الوقت للوصول إلى التوازن الحراري بعد بدء التشغيل. وكذلك تصحيح الانحراف الجانبي لل، علامات إيمانية يمكن استخدامها لتوصيف والصحيح لالانجراف المحوري، رغم أن هذا يتطلب استخدام عدسة اللابؤرية وآلية التقييم لتصحيح موقف العينة في حين أن الصور يتم الحصول عليها 43. وسوف تشمل أنظمة فائقة الدقة التجارية عادة نوعا من السيطرة على الاستقرار أو التركيز قفل آلية، والتي قد يكون حلا أكثر عملية لتصحيح الانحراف التركيز.

هناكإعادة بدائل لطلاء وجه التحديد غير الزجاج مع ديكستران، مثل استخدام الأصباغ مباشرة أو الجزيئات المكورات أخرى، مثل الأجسام المضادة الثانوية. وجود قيود على هذه النهج هو أن عدد الجزيئات بد أن الزجاج غير معروف. هياكل الخيطية البديلة التي استخدمت تشمل الأنابيب الدقيقة 28 والحمض النووي 21. ومع ذلك، فإن الجمع بين حجم صغير جدا ومريحة الكواشف المتاحة تجاريا جعل الأكتين بديلا جذابا، خاصة أن مسافة الفصل بين شعيرات المتباينة أو متفرعة يمكن أن يكون أيضا من المفيد قياس أداء النظام 27.

هناك مجالا لمزيد من عينات الاختبار التنمية، على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في هذا المجال 28،29،46،47. على وجه الخصوص، يقدم التصوير متعدد الألوان عددا من التحديات في جميع الجوانب الرئيسية 3 من التصوير، ووضع العلامات العينة، الحصول على الصور (الأجهزة)، وبرنامج (معالجة الصور والمحاذاة). لقد كان هناك لعدد من المنشورات معالجة هذه الجوانب 4-6 وبالتالي فمن الواضح أن العينات واختبار المنهجيات المناسبة حاسمة لتوليد وتفسير موثوق هذه الأنواع من الصور. في الواقع، في الآونة الأخيرة تبين أن dSTORM يمكن استخدامها لاتخاذ صورتين لون، ولحل، وطبيعة متناظرة للغاية من مجمع المسام النووية واقترح المؤلفان أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة مثالية لتقييم أداء تصويبات انحراف لوني 45. نهج آخر للاهتمام هو استخدام اوريغامي الحمض النووي لإنشاء nanoruler، مما يخلق إمكانية fluorophores المواقع على مسافات حيود فرعية محددة بصرف النظر 46. وهذا يوفر وسيلة لتقييم القرار وصنع قياسات المسافة. ومع ذلك، فإن الهدف النهائي هو تطبيق هذه التقنيات فائقة الدقة لعينات غير مثالية، مثل الخلايا، والتي هي معقدة هياكل ثلاثية الأبعاد. في هذه الحالة، وهو مزيج من أكثر فهم دقيق لرانه أسلوب جنبا إلى جنب مع أدوات البرمجيات التي تساعد المستخدم في الحصول على البيانات ومعالجتها بالطرق المناسبة، وتوفير مقاييس الصورة من المرجح أن يكون الجواب النهائي. 28،29،47،48

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نحن نعترف التمويل من البرنامج الكيميائية والبيولوجية المقاييس من مكتب الوطني للقياس في المملكة المتحدة. نشكر سيباستيان فان دي ليندي، ميكلوس Erdelyi واريك ريس للحصول على المشورة والاقتراحات الفنية. نشكر ميكلوس Erdelyi، اريك ريس وماكس Ryadnov للتعليقات مفيدة والمناقشات حول هذا المخطوط.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labtek Imaging chamberglass Fisher CBR-166-390E Sample preparation
Inverted Microscope Olympus IX71 * See below for alternatives
100 X TIRF Objective Lens Olympus UAPON 100XOTIRF * See below for alternatives
EMCCD Camera Andor iXon 897 * See below for alternatives
640 nm laser Toptica iBEAM-SMART-640-S *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes
LabVIEW National Instruments *Acquisition software (controlling hardware)
PC Dell Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing
ImageJ Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM Laser Analytics Group (Cambridge) software http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB Running rainSTORM http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Example of self-built STORM/PALM microscopes Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes
Table 1. Materials & Equipment
Name Company Catalog Number Comments
PBS (10X) Fisher VX70013065 1; 2; 3; 4
Poly-L-Lysine Sigma P4707 1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647 Invitrogen D-22914 1.2
General actin buffer Cytoskeleton Inc BSA01 2.2
Preformed-actin filaments Cytoskeleton Inc AKF99 2.2
Phallodin-Alexa fluor 647 Invitrogen A22287 2.2
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) Invitrogen T-7279 3.1
HeLa cells ATCC CCL-2 4.1
DMEM Fisher VX31966021 4.1
FBS Fisher VX10500064 4.1
Pen/Step Invitrogen 15070063 4.1
Plastic dishes Invitrogen 734-0006 4.1
EGF - Alexa fluor 647 Invitrogen E35351 4.3
BSA Sigma A7906 4.3, 4.4
Formaldehyde - 10 % solution EM grade Polysciences 04018-1 4.2
Catalase Sigma C100 5.1
Glucose oxidase Sigma G2133 5.1
KCl Sigma P9541 5.1
TCEP Sigma C4706 5.1
Tris Sigma 93352 5.1
Glucose Sigma C7528 5.2
MEA-HCl Sigma M6500 5.3
Glycerin Sigma G2289 5.1; 5.2
Table 2. Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galbraith, C., Galbraith, J. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124, 1607-1611 (2011).
  2. Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26, 285-314 (2010).
  3. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317, 1749-1753 (2007).
  4. Bates, M., Dempsey, G., Chen, K. H., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13, 99-107 (2012).
  5. Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical journal. 99, 2686-2694 (2010).
  6. Baddeley, D., et al. 4D Super-Resolution Microscopy with Conventional Fluorophores and Single Wavelength Excitation in Optically Thick Cells and Tissues. PLoS ONE. 6, (2011).
  7. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3125-3130 (2009).
  8. Huang, B., Jones, S., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5, 1047-1052 (2008).
  9. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  10. Juette, M., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
  11. Vaziri, A., Tang, J., Shroff, H., Shank, C. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 20221-20226 (2008).
  12. York, A., Ghitani, A., Vaziri, A., Davidson, M., Shroff, H. Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM with genetically expressed probes. Nature Methods. 8, 327-333 (2011).
  13. Jones, S., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8, 499-505 (2011).
  14. Shroff, H., Galbraith, C., Galbraith, J., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5, 417-423 (2008).
  15. Hess, S., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 17370-17375 (2007).
  16. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
  17. Klein, T., et al. Live-cell dSTORM with SNAP-tag fusion proteins. Nature Methods. 8, 7-9 (2011).
  18. Folling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nature Methods. 5, 943-945 (2008).
  19. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  20. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  21. Rust, M., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
  22. Hofmann, M., Eggeling, C., Jakobs, S., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17565-17569 (2005).
  23. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  24. Wolter, S., et al. Real-time computation of subdiffraction-resolution fluorescence images. Journal of Microscopy. 237, 12-22 (2010).
  25. Wolter, S., et al. rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy. Nat. Methods. 9, 1040-1041 (2012).
  26. Henriques, R., et al. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7, 339-340 (2010).
  27. Rees, E., et al. Blind Assessment of Localisation Microscope Image Resolution. Journal of Optical Nanoscopy. 1, 12 (2012).
  28. Dempsey, G., Vaughan, J., Chen, K., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1036 (2011).
  29. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature. 6, 991-1009 (2011).
  30. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angewandte Chemie International Edition. 47, 6172-6176 (2008).
  31. Owen, D. M., Sauer, M., Gaus, K. Fluorescence localization microscopy: The transition from concept to biological research tool. Commun Integr Biol. 5, 345-349 (2012).
  32. van de Linde, S., Wolter, S., Heilemann, M., Sauer, M. The effect of photoswitching kinetics and labeling densities on super-resolution fluorescence imaging. Journal of biotechnology. 149, 260-266 (2010).
  33. Veatch, S., et al. Correlation Functions Quantify Super-Resolution Images and Estimate Apparent Clustering Due to Over-Counting. PLoS ONE. 7, e31457 (2012).
  34. Holden, S., Uphoff, S., Kapanidis, A. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nature. 8, 279-280 (2011).
  35. Cox, S., et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics. Nat Methods. 9, 195-200 (2012).
  36. Mukamel, E., Babcock, H., Zhuang, X. Statistical deconvolution for superresolution fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 102, 2391-2400 (2012).
  37. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13978-13983 (2012).
  38. Parkar, N. S., et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1301-1312 (2009).
  39. Clague, M. J., Urbe, S. The interface of receptor trafficking and signalling. J Cell Sci. 114, 3075-3081 (2001).
  40. van de Linde, S., Sauer, M., Heilemann, M. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of proteins in the mitochondrial inner membrane with photoswitchable fluorophores. Journal of Structural Biology. 164, 250-254 (2008).
  41. Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M., Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society. 127, 3801-3806 (2005).
  42. Heilemann, M., Mukherjee van S,, A,, Sauer, M. Super-Resolution Imaging with Small Organic Fluorophores. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6903-6908 (2009).
  43. Lee, S. H., et al. Using fixed fiduciary markers for stage drift correction. Opt Express. 20, 12177-12183 (2012).
  44. Mlodzianoski, M., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Optics express. 19, 15009-15019 (2011).
  45. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, 570-575 (2012).
  46. Steinhauer, C., Jungmann, R., Sobey, T. L., Simmel, F. C., Tinnefeld, P. DNA origami as a nanoscopic ruler for super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 8870-8873 (2009).
  47. Laevsky, G. S., O'Connell, C. B. Comparative and practical aspects of localization-based super-resolution imaging. Current protocols in cytometry. Chapter 2, Unit2 20 (2013).
  48. Gould, T., Verkhusha, V., Hess, S. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nature. 4, 291-308 (2009).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 79، علم الوراثة، الهندسة الحيوية، والهندسة الحيوية الطبية، الفيزياء الحيوية، البروتوكولات الأساسية، خلايا هيلا، الهيكل الخلوي أكتين، المغلفة الحويصلات، مستقبلات، عامل نمو البشرة، Actins، الإسفار، الإلتقام، المجهري، STORM، فائقة الدقة المجهر، nanoscopy، بيولوجيا الخلية، مضان المجهري، عينات الاختبار، والقرار، خيوط الأكتين، علامات إيمانية، عامل نمو البشرة، والخلية، والتصوير
عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Metcalf, D. J., Edwards, R.,… More

Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50579, doi:10.3791/50579 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter