Summary
우리는 세 개의 시험 샘플의 제조 방법들이 최적화 STORM 현미경의 성능을 평가하는 데 사용될 수를 기술한다. 이 예제를 사용하여 우리는 원시 데이터를 수집 한 후 약 30 ~ 50 nm의 해상도의 세포에서 최고 해상도의 이미지를 얻기를 처리하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
STORM 표준 형광 현미경 기술보다 최대 10 배 더 좋은 해상도로 최근에 개발 된 초 고해상도 현미경 기술이다. 이미지가 이미지 분자에 의해 분자를 구축하여, 평소보다 매우 다른 방식으로 획득 그러나, 자신의 이미지 수집을 최적화하기 위해 노력하고있는 사용자에 대한 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 이 과정을 돕고 STORM 우리가 3 시료의 준비와 30 ~ 50 나노 미터 사이의 일반적인 해상도가 최고 해상도의 이미지를 수집하고 처리 STORM의 방법론을 제시 작동하는 방법에 더 많은 통찰력을 얻기 위해. 개방 비바람 처리 소프트웨어를 이용하여 시험 샘플을 조합하여 이미지 품질 및 해상도에 대한 많은 정보를 얻을 수있다. 이러한 메트릭을 사용하여 그 제제, 염료의 선택, 버퍼 상태, 및 화상 획득 설정을 샘플링하기 위해, 광학 이미징에서 절차를 최적화하는 것이 가능하다. 우리이러한 이미지 수집 및 밀도 동안 시료가 이동 'mislocalization'현상이 발생하는 문제를 관련 측면 드리프트, 가난한 이미지 품질이 저하 될 몇 가지 일반적인 문제의 lso의 예를 보여줍니다.
Introduction
최근 광학 현미경 기술의 범위는 일반적으로 회절 한계를 우회하고 100 ㎚ 이상 1,2 나은 해상도의 이미지를 생성 할 수있는 초 - 해상도 현미경 또는 nanoscopy,라고도 개발되었다. 2008 년 올해의 방법 자연 방법 것으로 초 고해상도 현미경의 발표 이후, 현지화 기반 현미경의 개발의 큰 거래되고있다. 예를 들어, 다색 애플리케이션 3-6, 3D 구현 7-12, 심지어 생균 애플리케이션 5,13-17있다. 이 시스템은 세포 생물학의 손에 광학 실험실 밖으로 상용화되고 있으며, 지금 그들의 방법을하고 있습니다 더욱이, 생물 의학 질문에 대한 자신의 사용 및 응용 프로그램에서 더 증가 될 가능성이있다.
이 가족의 한 지점은 이미지 분자에 의해 분자를 구축하여 작동 현지화 기반의 방법입니다. 나는단지 약간 공간적으로 분리 된 분자는 한번에 활성화되도록 이렇게 N 순서는, 샘플 내의 형광 분자의 대부분은 스위치 오프되어야한다. 이 분자는 빠른 속도에 꺼지는 인구의 상당 부분이 서브 회절 정밀도의 기본 구조를 반영하는 이미지가 될 수 있도록 많은 이미지를 촬영하고 있습니다. 방법의 수는 GSDIM 18, PALM 19 fPALM 20, STORM 21 RESOLFT 22 등의 발표되었다. 단일 분자 검출의 위치를 측정하는 알고리즘은 다음 예 rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 palm3d 및 비바람 27, 가우시안 피트 (23)를 사용하여 20 nm의보다 좋은 정밀도로 분자의 실제 위치를 찾는 데 사용될 수있다. 셀 또는 높은 분자 밀도가 다른 생물학적 샘플을 영상화 할 때, 프레임의 수천을 취할 필요가있다이것은, 공간적으로 분리, 깜박 이미지 순서라는 분자의 상당한 부분에 신호.
확률 적 광학 재건 현미경 (STORM)과 매우 관련 dSTORM 및 GSDIM 방법은 상업적으로 이용 가능한 유기 염료 (21)와 함께 작동하도록 입증 된 현지화 기반 슈퍼 확인 방법입니다. 그들은 이후 때문에 특이 형광 현미경을 수행 할 수있는 잘 설립 immunolabeling 방식의 상대적 편익의 방법론은 특히 매력에게 서로 다른 염료의 번호 28 ~ 30에 해당하는 것으로 표시되었습니다. 따라서, 지역화 기반 수퍼 - 해상도 이미징에 사용될 가능성이있는 색소 및 항체 염색 생체 분자 접합체의 범위로 접근이 용이하다. 폭풍과 유사한 방식의 일반적인 원리는 비교적 간단하다, 한눈에 하드웨어 및 샘플 준비는 상대적으로 스트라 보인다 동안ightforward, 품질 이슈없는, 최고 해상도의 이미지를 달성하기위한 중요한 공정 단계들의 수가있다.
모든 현미경 기술과 마찬가지로 처리는 3 가지 주요 단계로 간주 할 수있다 : 첫 번째, 두 번째 샘플 준비, 화상 취득하고, 셋째, 화상 처리 및 / 또는 이미지를 분석 및 해석. 추가 해결 능력과 현지화 기반의 접근 방식을 사용하여 최고 해상도의 이미지를 생성하는 방법은 몇 가지 새로운 문제 및 고려 사항 31-33을 소개합니다. immunolabeling, 일차 및 이차 항체의 조합이 사용되는 특히 간접 면역 형광을 수행 할 때 샘플 준비를 시작으로, 그 형광 염료가 떨어져 그 분자로부터 최대 20 ㎚에있을 수 있다는 것을 주목해야한다. 미세 소관의 경우, 이것은 25 nm의 28, 30의 예상 미세 소관 직경에 비해 35 ~ 50 ㎚의 직경을 초래한다. 또한, 표시 밀도가해야 m고품질의 이미지 (14)를 생성하기 위해 나이 퀴 스트 기준을 EET. 필라멘트 구조를 따라 20 ㎚의 예상 이미지 해상도에 대한 예를 들어 적어도 매 10 나노 27 염료 분자가 있어야합니다. 에 평형 - 많은 염료는 현지화 기반의 염료의 전반적인 성능은 적어도 네 가지 중요한 기준, 이벤트를 전환 당, 즉 검출 된 광자 (밝은이 더 각 깜박임의 밝기)의 혼합이다 접근을 위해 일에 게시 된 반면 오프 듀티 사이클 (국가에 비해 떨어져있는 염료의 명암비 - 오프 더 일반적으로 더 나은), 생존 분획 (낮은 표백 속도가 더 낫다) 및 스위칭주기의 수 (형광 당 깜박의 수 - 더 형광 당 깜박임)이 분자 계산을 위해 장점이 될 수 있지만, 높은 해상도를 위해 더 낫다. 상황은 더 이상 특정 염료에 대한 이러한 속성은 다른 버퍼 조건이 다를 수 있다는 사실에 의해 복잡레이저 전원 (28, 29)와 함께. 또, 물론 이들 고유 STORM 고려로서, 화질이 정착 조건의 변형 및 급냉 시약의 사용에 의해 자기 형광을 최소화하여, 예를 들어 전통적인 형광 현미경 기술과 동일한 방식으로 샘플 준비를 최적화함으로써 개선 될 수있다. 또한, 비특이적 결합 형광체를 최소화 라벨 농도, 배양 시간 및 차단 및 세척 단계를 조정함으로써 수행 될 수있는 것이 중요하다.
화상 획득의 두 번째 단계는 매우 중요하다. 현미경의 최적 설정은 염료, 버퍼 상태, 레이블링 밀도 및 샘플 타입, 유리, 세포 또는 조직 샘플에서 예를 들어 단층에 의존 할 것이다. 주요 고려 사항은 카메라 노출 시간, 프레임 번호, 조명 각 (TIRF, HILO, 에피) 및 레이저 파워이다. 목표는 가능한 한 빨리 많은 밝은 공간적으로 분리 깜박를 수집하는 것입니다. 만약 배경 I재구성 알고리즘이 정확하게 위치를 지역화 할 수 없을 것이며, 매우 높은 발 또는 점멸은 매우 밝지 않다 즉 신호 대 잡음비가 좋지 않습니다. 뿐만 아니라 측정 할 수있는 각 분자의 위치와 정확성, 즉 지역화 정밀도를 극대화로, 이미지 품질도 현지화의 높은 수에 따라 달라집니다. 또한 분자의 수가 충분하지가 묘화되는 경우에는 나이키 스트 기준 14,27을 충족하지 않으므로, 어느 빈약 라벨링 효율 과도한 광표백 또는 불충분 프레임 번호로 다음 결과 초해 콘텐츠 점상 불연속 것 .
그리고 마지막 세 번째 단계, 화상 처리는, 표준 형광 현미경 기술과 비교하여 특히 중요하다. 그것은 w를 알고 혼란 스러울 수 있다는 점에서 선택의 측면에서 장점과 단점이 둘 다 자유롭게 상업적으로 이용 가능한 알고리즘의 범위가있다HICH는 사용하기에 가장 적합합니다. 예를 들어, 원시 데이터가 공간적으로 구별 깜박 잘 간격 경우 다음 단일 분자 피팅 알고리즘은 폭풍우 27에서 사용할 수있는 스파 스 피팅 알고리즘에 의해, 예를 들어, 매우 정확하고 효율적으로 할 수있다, rapidSTORM (24, 25)는 QuickPALM 26 소프트웨어 (12)를 palm3d 및 . 원시 데이터가 다음 더 적합 할 수 있습니다 알고리즘을 신호를 중복이 많이 포함되어있는 경우 DAOSTORM (34), (b) 35 deconSTORM 36 (가) 있습니다. 더욱이, 이러한 알고리즘은 그러한 신호 카운트 또는 깜박임 당 광자뿐만 아니라, 평활화 가우시안 함수로 시각화로서 또는 초해 픽셀 크기가 될 수있는 픽셀 그리드와 히스토그램 같은 각종 다른 이미지 디스플레이 옵션과 같은 다양한 기준에 대한 임계 값을 포함 사용자에 의해 선택된. 이러한 모든 옵션은 최종 이미지의 모양을 변경하고 이미지의 해석과 분석에 영향을 미칠 수있다.
27 일반적으로 전체 폭의 절반 최대 (FWHM)의 측정을 수행하는 이상적인 구조를 제공의 필라멘트는 해상도 (37)의 경험적 추정치로 주어진다. 그것은 지역화 기반 수퍼 - 해상도 현미경 해상도 형광 광도, 배경 잡음 및 지역화 밀도 (27)의 함수이며, 이들 시험편에 걸쳐 반드시 일정하지 않기 때문에 해상도는 샘플 사이와 동일한 샘플 내의 이미지 사이에서 변화 주목해야한다. 액틴 필라멘트와 같은 mislocalizations 잠재적 이슈를 설명하고 표류하는 데 사용하고 그들이 폭풍우 내에서 소프트웨어의 기능을 식별 할 수있는 방법을합니다. 더욱이, 우리는 측정 및 올바른 드리프트 모두에 형광 기준 마커의 사용을 설명한다. 셋째, 표피 성장 인자 (EGF) - 염료 접합체와 세포의 염색을 설명한다. 세포 표면 수용체의 비율은 약 50 ~ 150 N의 서브 회절 크기의 구조이다 소체를 통해 엔도 시토 시스를 겪는다 때문에 EGF는, 초 - 해상도 이미지 성능의 유용한 지표를 제공한다직경 27,38,39에서 m.
Protocol
참고 :이 프로토콜 전반에 걸쳐 조언과 제안은 특정 단계에 따라 발견된다. "* 1"표기는 주 1 등등이 특정 단계에 관련하고 있음을 나타냅니다.
1. 유리의 형광 덱스 트란 코팅
- 8 챔버 커버 글라스의 각 웰에 0.01 %의 폴리-L-라이신 솔루션 200 μl를 추가하고 10 분 동안 품어. 더 남은 액체를 보장하기 위해 피펫으로 제거합니다.
- 2 ㎎ / ㎖의 원액을 만드는 제조 업체의 지침에 따라 덱스 트란 - 알렉사 647 * 1을 재구성. 이로부터, 20 ㎍ / ㎖의 솔루션을 만들 탈 이온수 25 μL로 0.25 μl를 희석.
- 덱스 트란 알렉사 647 용액의 고밀도 코팅을 만들려면 탈 이온수 200 μL의 전체에 20 ㎍ / ㎖의 용액을 20 ㎕를 희석. 중간 밀도 솔루션을 탈 이온수 (원래 원액에서 1:10,000 희석)의 200 μL 2 μL를 희석. 저에 대한밀도 솔루션은 탈 이온수 (원래 원액에서 1:100,000 희석)의 200 ㎕의 0.2 μl를 희석.
- 각 웰에 희석 된 덱스 트란 - 알렉사 647 솔루션 200 μl를 추가하고 10 분 동안 품어. 긴 배양 시간은 밀도 덱스 트란 코팅을 초래할 수있다 사용될 수있다. 세 번을 제거하고 H 2 O로 세척 * 2
주 1 : 기타 덱스 트란 염색 복합체를 사용할 수 있습니다. 원하는 조합은 상업적으로 사용할 수없는 경우 비 결합 덱스 트란은 염료에 접합 될 수있다.
주 2 : 형광의 균일 성이 저하 될 수 있지만, 동일한 덱스 트란 챔버 주에 걸쳐 재 이미징 할 수있다. 모든 버퍼가없는 상태에서 4 ° C에서 보관하는 것이 좋습니다.
2. 유리에 형광 액틴 필라멘트
- 챔버의 각 웰에 0.01 %의 폴리-L-라이신 솔루션 200 μl를 추가하고 * 3 10 분 동안 품어. 다시어떤 액체가 남아 있지 않은지 확인하기 위해 피펫으로 이동합니다.
- 각 실에 일반 말라 버퍼 (제조업체의 지침에 따라 재구성)의 90 μl를 추가합니다. (제조 업체의 지침에 따라 메탄올 1.5 ㎖에 용해하면 0.2 단위) 액틴 필라멘트 용액 1 μL phalloidin도 - 알렉사 647 미리 형성된 10 μM의 10 μl를 추가하고 부드럽게까지 피펫 믹스 다운. * 4 30 분 동안 품어.
주 3 : 폴리-L-라이신 코팅 유리에 결합 닫기 필라멘트 챔버 결과 내에 필라멘트 용액의 부피를 증가시킨다.
4 주 : 4 ° C에서 최대 48 시간의 배양 시간을 좋은 결과로 테스트되었습니다. 챔버가 하루 이상 동일한 샘플을 사용하는 것이 추천되지 않도록 버퍼를 스위칭에 노출 된 후에 액틴 필라멘트 이미지 품질이 저하된다.
3. 기준 마커로 미세 형광 구슬
- 영상 실에 희석 구슬을 추가하고 * 5 15 분을 기다립니다. 솔루션을 제거하고 이전의 영상을 PBS로 3 회 세척한다.
주 5 - 희석 배양 시간은 비드의 다른 밀도를 얻기 위해 조정될 수있다. 20.5 μm의 당 10 구슬 X 20.5 μm의 시야 -이 프로토콜은 일반적으로 3 사이에 발생합니다.
4. 표피 성장 인자 세포 염색법
- 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 약 80 % 컨 플루로 촬상 챔버 농경 HeLa 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액으로 보충.
- 배지를 제거하고 PBS로 세척. 그런 다음 10 분 동안 4 % 포름 알데히드 용액 (4 ㎖의 10 % 포름 알데히드 용액 1 ㎖ 10X PBS, 5 ㎖의 물)의 500 μl를 추가합니다. 포름 알데히드를 제거하고 PBS로 3 회 세척한다. 세포가 D 유지하는 것을 허용하지 않는다공예 항상 사용하는 PBS는 저장성 스트레스를 방지하기 위해 솔루션을 버퍼.
주의 - 포름 알데히드는 매우 독성이다. 적절한 장갑, 눈 보호 및 실험실 코트를 착용하고 있는지 확인합니다. 포름 알데히드의 처리를위한 로컬 가이드 라인을 확인합니다.
- 50 ㎍ / ㎖의 원액을 만드는 제조 업체의 지침에 따라 EGF - 알렉사 647을 재구성. (PBS에서) 0.1 % BSA 용액 200 μL이 원액 2 μl를 추가합니다. 세포에서 PBS를 제거, EGF 솔루션을 추가하고 30 분 동안 품어.
- 솔루션을 제거하고 15 분 동안 (PBS에서) 0.1 % BSA의 차단 솔루션을 추가하기 전에 PBS로 3 회 세척한다. 이를 제거하고 이전의 이미지에 PBS에 추가하는 과정을 3 회 반복한다.
5. 버퍼 준비를 전환
- 카탈라아제의 10 μL (20 ㎍ / ㎖), 1 M 트리스 (2 - carboxyelthyl) 포스 하이드로 클로라이드 (4 ㎜), 2.5 ml의 글리세린 (50 %) 20 ㎕, 125 ㎕ 씩 효소 원액 (A)를 확인1 M의 KCl (25 ㎜)의 1 M의 pH를 7.5 트리스 - 염산 (20 ㎜)의 100 μL, 5 포도당 산화 효소 (1 ㎎ / ㎖)의 MG와 diH20와 5 ㎖ 볼륨에 가득 부어. 이 -20 ° C에서 저장까지 1 년간 사용할 수있는 100 × 50 ㎕의 분취 량을 확인하기에 충분하다.
- ) 4g 혈당 (100 ㎎ / ㎖), 4 ㎖의 글리세린 (10 %), 36 ML의 diH20과 포도당 주식 솔루션 (B)를 확인합니다. 20 ° C와 1 년까지 사용 -이 저장 될 수있는 100 × 400 ㎕의 분취 량을 확인하기에 충분하다.
- MEA-염산 (1M)의 113.6 밀리그램 DIH 2 0 1 ㎖와 환원제 원액 (C)를 확인합니다. 신선한를 사용하거나 -20 ° C에서 저장까지 1 달 동안 사용할 수있는 10 × 100 ㎕의 분취 량을, (분취 량을 재 냉동하지 않음)합니다.
- 직전 이미징, 효소 (A), 포도당 (B) 및 비율 50 μL에서 함께 에이전트 (C) 주식 솔루션을 감소, 400 μL, 100 μL를 혼합 * 6 PBS 1 ml로 구성한다. 이 버퍼는 현재 산소를 폐품 및 환원 환경 (100 MM의 MEA을해야합니다염산) * 7. 최종 pH의 범위는 6.0에 있어야합니다 - 8.5 (조정은 일반적으로 필요하지 않습니다) * 8.
6 주 -이 버퍼는 Cy5에 알렉사 647로 carbocyanine 기반의 염료로 사용하기에 적합하다.
7 주 - 최종 효소 농도는 포도당 산화 효소의 50 μg / ㎖ (5 개 / ㎖), 카탈라제의 1 ㎍ / ㎖ (40 ~ 60 단위 / ㎖)이다. 효소 활성 (단위) 공급 업체에 의해 부여 될 수 있습니다. 카탈라제에 대한 계산 단계 5.4 이후 1 ㎍ / ㎖의 최종 농도는 효소의 50 단위를 포함한다고 가정합니다. 유사한 산소 소거 성분 등 여러가지 버퍼 조성물은 21,30,40 찾을 수있다. 버퍼와 염료의 조합에 대한 요약 참조 (28, 29)을 참조하십시오. 글리세린과 TCEP는 -20 ° C에서 장기 저장에 필요한
8 주 - 영상 액틴 필라멘트 t을 안정화하는 데 도움이 2 mM의 MgCl2를 0.2 mM의 ATP를 추가하는 경우그는 필라멘트.
6. (알렉사 647 염료를 사용하여) STORM 데이터의 현미경 취득
- 열 평형에 도달 할 수 있도록 STORM / PALM 현미경, 영상 전에 바람직하게는 3 시간에 스위치. 이 전 영상은 드리프트의 증가 기회가있다.
- 현미경 단계 샘플 홀더에 영상 실을 삽입합니다. 샘플 홀더에 단단히하고 평평한 지 확인합니다.
- 영상 실에서 PBS를 제거하고 스위칭 버퍼 상단에 입력합니다. 조심스럽게 확인 기포가 전혀 없다고하고 전체 챔버가 적용되어 제작, 챔버의 상부에 커버 슬립을 배치합니다. 기포가 보이는 경우 추가 버퍼 또는 PBS와 맨 그렇지 않으면 성능이 감소 할 수 있습니다 버퍼.
주의 - 대물 렌즈와 관련하여 샘플의 횡 방향 및 축 드리프트의 가능성을 최소화하기 It는 샘플 및 버퍼 평형화 남아있는 것을 권장이전 영상에 적어도 15 분 동안 실온에.
- 몇 군데에 관심 형광 구조를 찾습니다. 이것은 세포 샘플에 특히 이익이다 포커스 아웃 광을 최소화하여 신호 대 잡음비를 향상이 경우 조명의 원하는 각도, TIRF 또는 높은 경사각을 선택 추천. 이전 STORM 영상에 구조의 기준 회절 제한 이미지를 가져 가라.
- 약 2 킬로와트 / cm (2)에 대응하는, 높은 전력으로 (약 640 ㎚의 적절한 여기 파장을 가진) 여기 레이저를 증가하는 동안 10 msec의 노출의 카메라 설정, 약 50 Hz의 사이클 시간에 이미징 (초당 프레임) . 형광 (대부분의 샘플 아마 10 초 이내) 스파 스 점멸 패턴으로 전환 한 후 * 9 10,000 프레임을 수집합니다.
9 주 - 10,000 프레임은 여기에 설명 된 샘플에 적합합니다그러나, 다른 샘플 50000 이상으로 프레임 번호를 증가시킬 필요가있을 수있다.
7. 원시 데이터에서 최고 해상도의 이미지를 재구성 (폭풍우를 사용)
- MATLAB 내에서 rainSTORM.m 파일을 열고 (그림 1A)를 실행합니다.
- 폭풍우 창 (그림 1B)에서 찾아보기 버튼을 사용하여 분석 할 수있는 이미지 파일을 선택합니다. 이것은. TIF 파일 (ImageJ에가 TIF 포맷으로 다른 파일 형식을 변환하는 데 이용 될 수있다)이어야한다. * (10) 데이터를 획득하는 데 사용되는 현미경 시스템의 원시 데이터와 일치하는 픽셀 너비를 바꾼다. 기본값으로 다른 값을 둡니다.
10 주 - 이미지의 픽셀 크기가 160 나노 될 것 100X 대물 렌즈와 시스템에 따라서 일반적인 EMCCD 카메라는 16 ㎛의 픽셀 크기를 가지고 있습니다. 상용 시스템의 픽셀 크기는 일반적으로 소프트웨어에 표시됩니다. 픽셀 크기는 대부분의 현지화 현미경 100 nm의 160 nm의 사이에 다릅니다.
- '공정 이미지'버튼을 누르면 예비 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 처리 시간은 파일 크기, 컴퓨터 명세서 및 * 11 원시 데이터 내의 후보 점멸의 수에 의존 할 것이다.
주 11 - 액틴과 EGF 데이터 10,000 프레임 시퀀스는 인텔 제온 E5420의 CPU와 함께 PC를 사용하여 각각 처리하는 데 23 초, 25 초를했다. MATLAB에서 병렬 처리 도구 상자없이 동일한 컴퓨터를 사용하거나 여러 개의 코어 처리하지 않고 컴퓨터와, 시간은 각각 66 초와 81 초이었다.
- 업데이트 된 최고 해상도의 이미지를 눌러 '열기 리뷰어'버튼을 생성하고 두 번째 창 (그림 1C)가 나타납니다. (그림 1D) 원하는대로 이미지 표시를 변경하기 위해 '명암 조정'버튼을 누릅니다. 일부의 경우, 화상이 매우 어두운 곳 최대 값은 감소한다.
- 회전을 사용하여유용한 이미지 품질 메트릭을 생성하고, 상기 초 - 해상도 화상을 세분화하기 iewer 창 (도 1C). 각각 4000, 0.1 및 0.8 ~ 2.0의 값 * (12)에 처음 세 개의 품질 제어 파라미터를 설정한다. 어느 광자 캘리브레이션 측정 또는 특정 EM 게인 카메라 제조자에 의해 지정된 광자 곡선 검량선 값을 이용에 근거한다 광자 값마다 카운트를 업데이트한다. 이것은 정확한 정밀도와 * 13 해상도의 측정을 얻기위한 중요합니다.
12 주 - 신호의 수는 밝기 기준에 따라 깜박을 거부합니다. 값이 밝은 높은 깜짝 최종 이미지에서 지역화로 인정 될 수 있어야합니다. 이 염료 및 노출 시간과 카메라의 감도의 광자 출력에 따라 변경해야 할 수 있습니다. 신호 및 장착 가우스 즉, D 사이에 상당한 광장에 에러가 발생했을 경우 공차가 깜박 거부ouble 봉우리. PSF의 장착 폭이 범위를 벗어난에있는 경우 PSF 시그마 범위가 깜박 거부, 즉 좁은 범위의 포커스 아웃 신호와 일정한 형광의 큰 집계 얼룩을 거부 할 수 있습니다. 넓은 범위를 사용하여 최종 이미지에 나타나는 mislocalization 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 실제로,이 지역화 정밀 컷오프 파라미터를 이용하여 초기 품질 관리를 실시하도록 권장한다.
13 주 - 해상도 메트릭에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 23, 27을 참조하십시오. 각에 의해 생성 된 광자의 수는 각 지역화의 현지화 정도를 계산하고 그 결과 전체 이미지 전체에 대한 정밀 추정치를 평균 산출 할 수있다 깜박 아는하여 간단히. 광자 값 당 200 카운트의 이득 설정과 도르 IXON DU-897E를 사용하면 9.04입니다.
- 평균 현지화 PRECIS을 최적화 사이의 절충 현지화 정밀 컷오프 (그림 1C)를 변경최종 이미지의 현지화 수에 이온. 30-50 ㎚의 값은 데이터의 품질과 샘플에 따라 추천된다. 히스토그램 및 info.txt 파일은 모두이 결정 (그림 1 층 및 1G)를 알릴 수 있습니다.
- 재구성 스케일 팩터 (도 1C)는 기본적 원래 이미지에서 픽셀 폭이 160 ㎚이다 가정 32 ㎚의 초 - 해상도의 화소를 생성하는 것, 5이다. RAW 이미지는 100 nm의 픽셀 크기가있는 경우이 20 ㎚의 화소 최고 해상도의 이미지를 생성합니다. * 14 최종 이미지에서 작은 슈퍼 해상도 픽셀을 생산하는 규모 계수를 증가시킨다.
주 14 - 지역화 현미경의 분해능은 (간단한 히스토그램 재구성 픽셀 크기 즉) 시각화뿐만 아니라 지역화 정밀도에 필요에 따라 평활. 실제, 재구성 픽셀 크기는 일반적으로 지역화보다 작아야정밀도는 (정보 텍스트 파일의 평균 정밀 견적 메트릭을 참조 - 6.11 및 6.12 단계). 이 경우에 의한 재구성 화소 크기로 해상도의 손실 23,27 작은 것이다. 예를 들어 행과도 4E의 열 방향의 평균 추정 정밀도는 16.1 nm 내지 16.2 nm의이다. 16 ㎚의 픽셀 크기는 (160 ㎚의 원래 픽셀 폭 (10)의 재구성 스케일 팩터)이 데이터를 시각화하는데 사용되었다.
- 예를 들어, 원시 데이터의 하위 집합에 재건을 제한하는 제한 프레임 범위 (그림 1C)을 수정 [2001-INF] 원시 데이터의 초기 2,000 프레임을 제외한다.
- 업데이트 된 최고 해상도 이미지 (그림 1E)를 생성하는 '실행 리뷰어'버튼 (그림 1C)를 누릅니다.
- 화상 품질 메트릭 (도 1F) * 15을 표시하기 위해, '뷰 히스토그램'버튼 (도 1C)을 누른다. 주 15 - 카메라의 프레임 번호와 오른쪽 아래 (그림 1 층)에서 톰슨 현지화 정밀도 히스토그램에 대한 허용 현지화의 수를 묘사 오른쪽 상단에있는 그래프는 현지화 정밀 차단 검토 옵션을 알릴 수 있습니다. 예를 들어, 50 nm의 컷오프를 사용하여 최종적인 수퍼 - 해상도 화상에 포함되는 나쁜 정밀도 모두 현지화 제외 된 것이다.
- 이 모든 데이터 * 16을 저장하기 위해 검토 (그림 1C)에서 '이미지 저장'버튼을 누릅니다.
- 7.6 단계 원하는 경우 다른 검토 매개 변수를 사용하여 다음 단계를 반복 할 데이터를 검사 한 후 (예 : Info.txt 파일 및 히스토그램)으로 돌아갑니다. 단계 7.11에서 '이미지 저장'을 누르면 이전에 저장된 데이터를 덮어 쓰게됩니다.
- 일반적인 방법으로 이미지를 생성하는 7.9 - 7.1 단계를 따릅니다.
- 검토 (그림 1C)의 '상자 추적'버튼을 눌러 클릭하고 검토 된 이미지에 대한이자의 기준 마커 또는 구조에 상자를 드래그합니다.
- 새로운 이미지가 나타날 때까지 '박스형 포지션'(예제 그림의 (b), (c) 및 6 층 참조) 표시되는, 기다립니다. 원하는 경우이 이미지를 저장합니다.
- 관심의 대상이 기준 마커 인 경우, 정정을 표류하는 '하위 다음'설정 앵커 '버튼을 클릭하여 수행 할 수 있습니다요로 드리프트 '버튼을 누릅니다. 마지막으로 '실행 리뷰어'다시 이제 현지화가 기준 마커의 위치에 따라 해결해야 할 새로운 STORM 이미지를 생성합니다. 구슬의 위치는 최종 검토 이미지에서 삭제됩니다.
- 최종 드리프트 보정 된 이미지 내의 다른 기준 마커가있는 경우, 이러한 '상자 추적'을 눌러 제거 할 수있다, '박스형 삭제'를 한 후 원하는대로 '실행 리뷰어'로 여러 번.
16 주 - 3에서 5 사이의 파일 (합계 이미지, STORMdataImage, STORMprocessed, 정보 및 hists) 선택한 옵션에 따라 저장 될 수있다, 그림 1G 참조하십시오. STORM 처리 된 이미지가 수정 명암 및지도와 함께 표시됩니다. STORMdataImage 각 픽셀의 그레이 레벨이 마비에 해당하는, 그레이 스케일 이미지입니다그 안에 확인 된 현지화의 어.
8. 박스 추적 및 편차 수정 (폭풍우를 사용)
Representative Results
덱스 트란
덱스 트란의 성공적인 코팅 형광 단일 층을 생성한다. 높은 농도로이 비교적 균일 나타납니다. 낮은 농도에서는 (그림 2A) 드문 드문 나타납니다. 많은 STORM / PALM 현미경 TIRF에 표면 형광에서 조명의 각도를 변경하는 기능이 있습니다. 일반적인 EMCCD 카메라의 512 X 512 픽셀로, 예를 들어, 풀 프레임 카메라 뷰를 사용하는 경우, 심지어 조명을 준수해야합니다. 어떠한 스트라이프 나 포커스 아웃 영역이 존재하는 경우이 시료는 대물 렌즈에 신선한 오일 샘플 홀더로 재 삽입되어야한다는 것을 나타낼 수있다. 다른 방법으로는 현미경으로 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다.
최고 해상도의 원시 데이터를 수집 할 때 영상 레이저는 약 2 kW 급 / ㎠에 힘을 증가해야한다. 형광이 구동된다 점멸 다음에 형광의 초기 버스트가있을 것입니다임시 어두운 상태에. 하이 덱스 트란에 깜박 특히 이미지 수집의 시작 부분, 중복 가능성이 밀도를 (비디오 1). 중간 및 낮은 밀도에서이 깜박 즉 공간적으로 분리, 스파해야하고, 명백한 배경에 초점 (그림 2A, 영화 2, 3 프레임 2000, 5000 및 8000를 참조). 이 이미지 수집 단계에서 일정한 레이저 조명에, 깜박의 수 (고밀도 샘플, 그림 (a)에 프레임 8000 프레임 2,000 비교) 시간이 감소합니다. 덱스 트란 상이한 농도 (높은, 중간 및 낮은)의 다양한 초 해상 이미지 간의 주요한 차이는 현지화의 수가 감소 (도 2a 및도 2b)이다. 즉, 형광 분자의 농도는, 원시 데이터 점멸 수와 현지화의 수는 비례 관계가있다. 이 관계,그러나, 매우 높은 분자에로 (그림 2C를 빨간색과 파란색 라인을 비교) 소프트웨어가 성공적으로 분자를 지역화 할 수없는 밀도를 간단한 선형 아니다. 그 이유는 처리 소프트웨어는 점멸 비 스파 스 가우시안 피팅 알고리즘을 사용하여 위치를 맞추기 위해 위해 고농도로 할 수 없기 때문이다. 깜박 인해 그들은 (그림 2A와 2C) 희소 해짐에 따라 소프트웨어가 더 깜박 더 적합 할 수 photobleaching에에 수집 단계를 통해 감소로. 또한, 각각의 염료 분자가 깜박일 수 있고, 따라서 더 많은 28,41,42 번 이상을 지역화 할 수.
이러한 샘플의,하지만, 특히 고밀도 덱스 트란을 이미징 일반적인 문제는, 신속하게 STORM 이미지 수집 단계에서 확산 될 것으로 보인다 밝지 만 초점이 맞지 형광 안개의 존재가 될 수 있습니다. 이에 높은 콘트라스트 형광 구별된다(도 3a, 비디오, 5)를 점멸 알 수있는 유리의 표면. 이러한 분리 된 형광 분자 전에 스위칭 버퍼를 추가로 PBS와 세척 단계의 수를 증가시킴으로써 또는 챔버 (도 3b, 비디오, 6)에 신선한 스위칭 용 완충액을 첨가함으로써 방지 또는 제거 할 수있다. 처리 및 지역화의 수와는 (도 3C, 3D, 3E 깜박 국산화 소프트웨어를 장착 할 수있는 정밀도 모두에서 감소가 매우 다른 수퍼 - 해상도 이미지 내의 각 이미지 시퀀스 검색 결과의 데이터를 비교 및 3 층).
액틴 필라멘트
예비 성형 액틴 필라멘트 회절 한정 영상 (도 4a 내지도 4c)에 의한 유리의 표면에 붙은 알 수있다. 필라멘트의 수가 매우 낮음 나타나는 경우, 더 긴 배양 시간은 사용 또는 액틴의 양이 감소 될 수있다필라멘트 솔루션은 도움이됩니다. 더 나은 품질의 이미지에 하나의 비교적 밝은 필라멘트 (그림 4D)보다는 얽힌 지역 결과를 초래합니다. 수집 단계에서 밝은에 초점이 깜박 필라멘트의 길이 (비디오 7) 함께 볼 수 있어야합니다. 스파 스 깜박임은 취득 단계에서 볼 수 있어야하고 이후에 처리 된 데이터에 얇은 연속 필라멘트 (그림 4E)이 있어야하고, 프레임 당 현지화해야 그림 3E와 달리 완만 한 하락 (그림 4 층).
깜박이는 경우가 아닌 스파, 또는 소프트웨어가 분자를 지역화 할 수없는 경우, 더 미묘한 이슈는 mislocalization (32)라는이 발생할 수 있습니다. 소프트웨어 평균 겹치는 두 분자의 위치 및 지역화 그들 사이의 위치 중도 인 경우가 발생한다. BLI 겹치는 상당수가되지 않았 음을 표시NKS, 결과적 mislocalizations는, 평균 밀도 추정은 행 및 열 방향, 즉 수평 및 수직에서 동일해야한다는 것이다; mislocalizations가 어디에 이러한 필라멘트의 길이를 따라 발생했을 생산 통상 깜박임 (보다 큰 즉, 결과적으로 방향 중 한 방향으로 덜 정확하게 지역화 된 것하는) 더 많은 픽셀에 걸쳐. 거기 촬상 영역에서 단일 액틴 필라멘트이고 수평 또는 수직으로 누워있는 곳이 가장 쉽게 볼 수있다. 이 경우, STORM 현미경은 두 방향으로 16 nm의 평균 정밀도를 달성했다. 이 정밀 제한, 약 34 ㎚의 효과적인 이미지 해상도의 측정 결과. 우리는 이미지의 해상도를 추정 FWHM의 측정 값을 취할 수있는 극소 phalloidin도-알렉사 647 라벨 균일 한 직경 12 ㎚의 필라멘트 구조를 가질 이러한 메트릭은, 그러나, 비바람 (27)에 의해 제공된다. DRA으로날개 플롯 프로필 기능 (그림 4H)를 사용하여 연속적으로 FWHM이 43.2 나노 미터로 계산됩니다 가우스 맞는 (그림 4I)을 수행 ImageJ에 (그림 4G)의 최고 해상도 이미지의 필라멘트를 통해 직선을,. 이 측정을 시도 할 때 우리는 픽셀 크기가 (info.txt 파일 그림 1G 참조) 일치하거나 이미지의 평균 밀도 추정치보다 약간 작아야하는 것이 좋습니다. 이 경우, 16 nm의 픽셀은 이미지를 재구성하기 위해 사용되었다.
두 개의 관련 문제가 깜박이는 형광 동시에 약 250 nm의 깜짝 내에서 비 스파 스, 즉 개별 분자가되고, 따라서 신호가 중첩 STORM, 발생할 수 있습니다. 첫 번째는 알고리즘이 사용하는 품질 관리 기준에 따라 깜박 모두에서 지역화되지 않을 수 있다는 것입니다. 이것은 거의 또는 전혀 현지화와 최고 해상도의 이미지가 발생합니다. 의 제 문제두 깜박 하나의 깜박임으로 표시 서로 충분히 부근에 발생했을 때 mislocalizations가 발생합니다. 이 경우, 최종 이미지의 위치는 두 가지의 평균을 나타낸다. 이에 대한 자세한 사항은 참조 (32)를 참조하십시오. 두 경우 모두 매우 고밀도 샘플 불충분 레이저 파워로 또는 버퍼 문제 스위칭 발생할 수있다. 액틴 필라멘트의 수는 분기 및 / 또는 (그림 5A-D, 비디오 9) 서로 교차되는 곳이 문제는 명백하다. 프레임의 부분 집합을 처리하고, 첫 번째 및 마지막 프레임 5000를 비교함으로써, 우리는 서로 다른 결과 이미지를 볼 수있다. 제 5000 프레임들 (도 5c)를 사용하여 초 - 해상도 이미지에서 우리는 이미지의 중간에 많은 현지화 지난 5000 프레임을 이용한 경우에는, 이들 중 거의가 겉보기와 우리가 함께 남아 있다는 것을 알 수 다만 필라멘트, IMAG에서 현지화의 낮은 수 ...에 기인하는 다소 불연속 불구하고전자 (그림 5D). 너무 높은 점멸 밀도가 의심되는 경우 프레임 당 데이터 지역화와 이미지의 비교는 강하게이 문제가 발생하는 것을 제안 할 수 있습니다 제 1 세트의 프레임 중에 마지막 세트에 비해 이상 10 프레임 당 현지화의 평균 수는있다 약 4 (그림 5E)입니다 프레임. 묘화하는 분자의 수가 많을 경우, 즉, 고밀도의 샘플에 대해, 이것은 필요하지만 그것이 가능한 프레임 당 적게 현지화를 가지고 최적 발생 mislocalizations의 가능성을 최소화하기 위해 그 획득 다수 프레임은 드리프트입니다 STORM 현미경의 또 다른 문제로 이어지는 촬영.
드리프트 측면 - 액틴 필라멘트와 기준 마커
드리프트가 발생하면 데이터 획득 단계를지나 대물 렌즈에 관하여 샘플 이동한다. 이 DURIN 확인하기 어렵거나 불가능하다g 화상 취득 단계는 일반적으로 비교적 안정되어 현미경 시스템을위한 몇 분에 걸쳐 50nm 이하이기 때문에 그것을 구체적으로, 측정되고 않으면 오히려 축 또는보다 횡 경우 특히. 그러나, 잘 정의 된 구조로 액틴 필라멘트로서 알려진 구조의 재구성 된 이미지에서, 상기 수퍼 - 해상도 이미지로 검출 될 수있다. 횡 드리프트가 발생했을 수 있다는 첫번째 신호 구조가 67 nm의 비교이 경우, 비바람으로부터 정밀 제한 데이터와 비교하여 상대적으로 큰 FWHM으로 (예를 들어도 6A, 비디오 8) 90 nm의 예상보다 큰 것이있다. 그러나, 드리프트를 검출하는 좋은 방법은 이후의 프레임에서 지역화는 초기 프레임과 비교하여 변위되는 경우, 즉보고, 시간의 함수로서 현지화를 비교하는 것이다. 이것은 분명히 매우 작고 균일 한 구조이다 액틴 필라멘트의 경우에서 알 수있는 경우박스 추적 기능 비바람에 (도 6B 및 6C)를 이용하여 컬러 코드로 표시.
드리프트는 잘 인식 문제와 19를 최소화하거나 인수 후 하나를 기준 마커 21,43 또는 교차 상관 관계 (44)를 사용하여 교정하는 데 사용할 수있는 전략은 여러 가지가있을 수 있습니다. 드리프트 및 그것을위한 정확한 측정을 위해, 100 nm의 직경의 형광 비드는 기준 마커 (도 6D)로 사용될 수있다. 그들은 작고 밝은 때문에 자신의 위치를 정확하게 같은 폭풍우로 가우시안 피팅 알고리즘을 사용하여 측정 할 수있다. 3 분 10 초에 걸쳐 약 100 ㎚의 상대적으로 심각한 드리프트이 예에서, 취득 단계 (그림 6E) 동안 동일한 상자 추적 기능은 컬러 코드를 사용한다 (그림 6 층 그 편차가 발생 확인 할 수있다 ). 이 예에서 네 개의 구슬이 거의 동일한 편차를 보여준다는 P입니다참고로 사용하고 다른 구슬 (그림 6 세대)에서 드리프트를 뺀,이 경우 구슬이 그들 중 하나를 선택 ossible. 그 다음의 기본 구조를 알 수없는 또는 훨씬 더 많은 변수 액틴 필라멘트 또는 형광 구슬보다 어떤 드리프트를 측정하고 보정 할 수있다 그 생체 시료에 기준 마커를 추가하여.
표피 성장 인자
마지막으로, EGF 염색 HeLa 세포는 세포 (도 7a, 비디오, 10)의 영상 해상도의 실제 예를 제공하는데 사용될 수있다. 그들이 커버 글라스에 근접 세포 표면 평면의 초점에서 EGF-형광의 대부분 있어야 이러한 세포는 이미지에 비교적 간단하다. 덜 밝은 영역은 중앙에 핵의 위치에 해당한다. TIRF 조명은 셀 m의 부분에서 오는 포커스 아웃 형광을 제거하여 화질을 향상시킬 수있다embrane 유리 (세포에 약 150 nm의 침투)에 근접. 회절 제한 이미지의 관심 영역을 확대하지 않는 것은 (그림 (b)와 (c)) 일반적으로 불명료 한, 그러나 최고 해상도의 이미지에 혼합이 있어야한다 클러스터 및 비정기 고립 된 하나의 화소 (그림 7D-7F)의. 이들은 세포 표면 또는 비 - 특이 적 결합의 수 소량에 절연 EGF 수용체를 나타낼 것이다. 클러스터는 직경 약 100 ㎚ 일 성형 피트와 소포, EGF는 주로 다운 규제 endocytosed 인을 통해 통로에 해당 할 가능성이 있습니다. 전형적인 평균 정밀 추정은 대략 45 ㎚의 정밀도 한계 샘플 이러한 유형의 약 20 나노 미터이다. 그것은 효과적인 해결책이 정밀 한계 측정 기준 마커로 측정 할 수있는 계정 라벨 크기, 또는 어떤 드리프트를 고려하지 않는 것을 지적하지만, 여전히 NOTIC입니다해야클러스터 또는 그림 6에 설명 및 프로토콜 제 8 항에 설명 된대로 상자 추적 기능 사용에 대한 "혜성 꼬리"로 eable.
| 구성 요소 | 최종 농도 |
| 카탈라제 | 1 ㎍ / ㎖ (50 단위) |
| 포도당 | 40 ㎎ / ㎖ |
| 포도당 산화 효소 | 50 ㎍ / ㎖의 |
| 글리세린 | 12.50 % |
| 의 KCl | 1.25 밀리미터 |
| MEA-염산 | 100 ㎜ |
| TCEP | 200 μM |
| 트리스 | 1 ㎜ |
표 3. 버퍼를 전환
| 일반적인 취득 설정 | 값 |
| 픽셀 크기 (NM) (160) | |
| 노출 시간 (밀리 초) | 10 |
| 이득 | (200) |
| 프레임 크기 (픽셀) | 128 x 128의 |
| 사이클 타임 (FPS) | 52.5 |
| 프레임 번호 | 10,000 |
| 640 nm의 레이저 파워 밀도 (KW / cm 2) | 2 |
표 4. 취득 설정
그림 1. 폭풍우를 사용 STORM 이미지 재건. (A) MATLAB 내에서 폭풍우를 엽니 다. (B) 비바람 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI). (C) 비바람 리뷰어 GUI. (D) 대비 창을 조정합니다. (E) 검토 및 대비 조정 후 STORM 이미지를. (F) 그의이미지 품질 메트릭들의 tograms. 검토 자 GUI에 이미지 저장 버튼을 누른 후 생성 (G) 파일. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. (A) 회절 제한 (DL) 이미지는 덱스 트란 이전 STORM 영상에 서로 다른 농도를 보여줍니다. 슈퍼 해상도 (SR) 이미지 복원은 25 nm의 픽셀 크기가있다. 만 영상이 128 X 128 화소 프레임 사이즈 및 개별 프레임 (2000, 5000, 8000)로부터 그 시퀀스 나타낸다으로 수집 하였다. 초당 52.5 프레임의 속도로 10 밀리 초 노출 시간을 인수했다. 이미지는 160 ㎚의 픽셀 크기를 갖는다. 0.1 % 화소 포화 콘트라스트 개선을 볼의 명확화를 위해 ImageJ에를 사용하여 적용 하였다. 평균 정밀도추정치는 28 나노 미터 (높음), 24 nm의 (중간) 및 다른 덱스 트란 이미지 (낮음) 16 나노 미터입니다. 현지화 밀도가 2 ㎛ (높음) 당 724이며, 2 ㎛ (중) 당 526 (낮음) 2 음 당 13. (B) 수 그래프 덱스 트란의 각 농도의 세 만 프레임 시퀀스의 평균을 도시. 오차 막대는 표준 편차를 보여줍니다. 압연 100 프레임의 평균을 사용하여 프레임 당 허용 현지화의 수를 플로팅 (C) 그래프. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 별로 품질 덱스 트란 데이터. 15,000 프레임 STORM 시퀀스에서 (A) 회절 제한된 프레임. 이미지를 가로 질러 확산 형광 안개를합니다. 이것은 fluoropho에 의해 발생합니다 고해상도 매체를 통해 확산. 128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임으로 인수했다. (B) 버퍼 후의 (A)와 동일한 변화가 있었다. 언 바운드 형광 물질이 씻겨 된대로 개선 된 대비를합니다. (C) (A)에서 수집 된 데이터에 대응하는 초 - 해상도 화상 재구성. 동일한 이미지 크기 만 25 ㎚의 화소. 평균 정밀 추정은 35 ㎚이다. (D) (B)에서 수집 된 데이터에 대응하는 초 - 해상도 화상 재구성. 동일한 이미지 크기 만 25 ㎚의 화소. 평균 정밀 추정은 30 ㎚이다. (E) 그래프 압 백 프레임 평균을 이용하여 프레임 당 허용 현지화의 수를 플롯. 빨간색 선은 높은 배경이 STORM 순서 (A & C)에 해당한다. 파란색 선은 배경이 낮은 (B & D)에 해당하는 데이터를 보여줍니다. 고에 해당하는 이미지를 받아 현지화 번호를 표시 (F) 그래프 (C)과 낮은 (D) 백그라운드 데이터.HREF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg"대상 = "_blank"> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 일반적인 굴지의 데이터. 이전 버퍼와 STORM 영상을 전환 첨가 액틴 필라멘트 (AC) 회절 제한 이미지. 필라멘트의 가변 길이 볼 수 있습니다. 매우 밝은 필라멘트들은 서로 얽힌 여러 필라멘트이다. 픽셀 사이즈는 160 ㎚이다. (D) 단일 액틴 필라멘트의 회절 제한 이미지. (E) STORM 이미지 (ImageJ에 적용 0.1 % 대비 향상). 128 X 128 화소 프레임 크기, 10 msec의 노출 시간 및 초당 52.5 프레임으로 취득한으로 만 프레임 시퀀스로부터. 픽셀 크기는 16 ㎚이다. 평균 정밀 추정은 16 ㎚이다. (F) 그래프 허용 현지화의 수를 플로팅롤링 100 프레임의 평균을 사용하여 프레임 당 초. 에서 그려진 노란 선 프로파일을 향상 대조하기 전에 (E)에서 액틴 필라멘트의 지역 확대 (G). (H) 액틴 필라멘트에 걸쳐 그려진 노란 선에서 플롯 프로필보기. ImageJ에에 생성됩니다. (I) ImageJ에있는 커브 피팅 도구를 사용하여 플롯 프로파일의 가우시안 적합했다. 표준 편차, D는 43.2 nm의 FWHM 측정을 얻으려면 2.35을 곱했다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. Mislocalized 액틴 필라멘트. (A) 회절 제한 액틴 필라멘트. 160 nm의 픽셀. (A)에 도시 액틴 필라멘트 (B) STORM 이미지. 128 x 128의 화소 FRAM과 20,000 프레임 시퀀스에서E 사이즈, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임으로 인수했다. STORM의 픽셀 크기는 16 ㎚이다. 모든 20,000 프레임을 처리했다. 평균 정밀 추정은 17 ㎚이다. (B)으로 만 처리 20000 프레임 시퀀스의 첫 번째 프레임 5000 (C). 평균 정밀 추정은 18 ㎚이다. (D) (B)으로 만 처리 20000 프레임 시퀀스의 마지막 프레임이 5000. 평균 정도의 평가는 17 ㎚이다. 전체 128 X 128 픽셀 프레임보기에서 프레임 당 데이터 현지화 버전 (E) 그래프.
그림 6. 드리프트 측면. 64 X 64 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 64.6 프레임의 속도로 촬영에 10,000 프레임 시퀀스에서 재구성 액틴 필라멘트 (A) STORM 이미지를. STORM의 픽셀 크기는 32 ㎚이다. 평균 정도의 평가는32 뉴 멕시코. (B) STORM 이미지는 '상자 추적'기능 비바람을 사용 표시. 현지화는 그들이 취득한 때의 프레임 번호에 해당하는 색으로 표시됩니다, 예를 들어, 초기 인수 시퀀스에서 현지화은 파란색, 늦게 취득 순서에서 현지화는 빨간색입니다. 난민 색상 편차가 발생했음을 나타냅니다. (C) (A)의 영역에 확대 박스 추적 기능 비바람을 사용 표시. 난민 색상 편차가 발생했습니다 나타냅니다. (D) 기준 마커로 사용할 수있는 네 개의 100 nm의 형광 구슬의 회절 제한 이미지. 픽셀 크기가 160 나노 미터. 숫자 1-4 표시립니다 개별적으로 구슬을 확대. (E) 128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임의 취득에 10,000 프레임 시퀀스에서 폭풍우에 재건 (D)에 해당하는 각각의 형광 구슬. STORM 픽셀 크기가 5 ㎚이다. 평균 정도의 평가는 7 ㎚이다. (F) (D)에 해당하는 구슬 및 (E),'상자 추적'기능을 사용하여 표시. 난민 색상 편차가 발생했습니다 나타냅니다. (G) 구슬 숫자 2를 사용하여 참고로, 구슬 1, 3, 4는 '빼기 드리프트'기능 후에 표시가 폭풍우에 사용됩니다. (E)과의 비교는 측면 드리프트가 해결 된 것을 보여줍니다. STORM 픽셀 크기가 5 ㎚이다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. 일반적인 EGF 데이터. 기저 세포 표면에 초점을 맞춘 헬라 세포의 일부 (A) 회절 제한 이미지. 노란색 상자는 (B)에 도시 한 관심 영역에 확대 표시 & (C). (B), 셀 (박스 B)의 가장자리 근처 영역에서 회절 제한된 이미지 확대. (C) 제한 회절을 확대 핵 (박스 C)에서 지역의 이미지. (D)에 해당하는 STORM 이미지 (A). 128 X 128 화소 프레임 크기, 10 msec의 노출 시간 및 초당 52.5 프레임으로 취득한으로 만 프레임 시퀀스로부터. STORM의 픽셀 크기는 25 ㎚이다. 평균 정밀 추정은 21 ㎚이다. (E) E (D)를 상자에 해당 STORM 이미지. (F) F (D)를 상자에 해당 STORM 이미지를. (D)에서 프레임 당 데이터 (G) 버전은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
. 동영상 1-4 비디오 다양한 덱스 트란의 농도도 2a에 해당하지 : 1 = 고, 2 = 보통, 3 = 저, 4 = 없음). 초당 52.5 프레임의 속도로 10 밀리 초 노출 시간과 인수 128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10,000 프레임 시퀀스는. 비디오를 보려면 여기를 클릭 ,load/50579/50579video2.mov "대상 ="_blank "> 비디오 2, 영상 3 , 비디오 4
동영상 5-6. 동영상 3 A & B. 비디오 그림 5에 해당 언 바운드 형광 물질이 제거 된 후 미리 세척 및 비디오 (6) 세척 후입니다. 128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임의 인수를 사용하여 15,000 프레임 시퀀스는. 비디오 5 보려면 여기를 클릭 , 비디오 6 .
비디오 7. 비디오도 4E의 STORM 이미지를 생성하기 위해 처리 된 원시 프레임 시퀀스를 표시합니다. 10,000 프레임 seque128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임의 인수와 후부는. 비디오 7를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
비디오 8. 비디오는 그림 (b)의 STORM 이미지를 생성하기 위해 처리 된 원시 프레임 시퀀스를 표시합니다. 128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임의 취득 20,000 프레임 시퀀스는. 비디오 8를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
비디오 9. 비디오도 6A의 STORM 이미지를 생성하기 위해 처리 된 원시 프레임 시퀀스를 표시합니다. 64 X 64 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 64.6 프레임의 속도로 촬영. 10,000 프레임 시퀀스 cli를여기 CK 비디오 9을 볼 수 있습니다.
비디오 10. 그림 7D의 STORM 이미지를 생성하기 위해 처리 된 원시 프레임 시퀀스를 보여주는 비디오. 128 X 128 픽셀의 프레임 크기, 10 밀리 초 노출 시간과 초당 52.5 프레임의 취득 10,000 프레임 시퀀스는. 비디오 10를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
우리는 몇 가지 간단한 테스트 샘플하고 STORM 최고 해상도의 이미지를 최적화 할 수있는, 자유롭게 사용 가능한 처리 소프트웨어 비바람 보여. 이러한 도구 및 방법은 새로운 사용자와 사용자의 현미경에 대한 자신감과 전례없는 세부 사항을 생물학적, 세포 구조를 연구하기 위해 그들의 사용을 증가하는 숙련 된 사용자를위한 방법에 대한 유용한 시작점을 제공 할 것입니다. 그것은 이미지 품질을 향상시키기 위해 더 큰 신뢰를 갖는 것이 가능하다 보여주는 그러한 평균 정밀 추정 지역화 번호 및 히스토그램으로 유용한 이미지 품질 메트릭의 개수를 생산할 수 알려진 또는 널리 알려진 구조 및 알고리즘과 함께 시료의 조합을 사용하여 STORM 이미징 과정에서. 아무도 크기가 사용될 수있는 다른 상업적 자체 내장 현미경 구성 개수가로 데이터를 획득하는 모든 방법을 적합하지가있다. 또한, influ 수있는 많은 샘플 준비 및 이미지 수집 단계가 있습니다최종 이미지는 따라서 소프트웨어 툴과 테스트 샘플을 갖는 이해와 STORM 이미지 품질을 최적화하는 데 중요합니다 줬어.
또한이 프로토콜은 발생할 수있는 모든 문제를 해결하는 유용한 덜 모호한 방법을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어 덱스 트란 시료는 레이저 빔의 오정렬 또는 샘플의 고르지 조도가 있는지 확인하기 위해 매우 유용한 방법이다. 스위칭 버퍼가 어떤 '깜박이'가 도움이 될 것입니다가 있는지 확인하기 위해 매우 간단한 시각적 테스트를 작동하지 않을 우려가있는 경우. 액틴 필라멘트 FWHM 비교를 사용하여뿐만 아니라 드리프트 mislocalization 유물을 강조 해상도를 측정하는 유용한 방법입니다. 그러나, 지역화 기반 수퍼 - 해상도 방법과 같은 노출 시간, 프레임 속도, 레이저 파워 및 화상 처리 방법과 같은 다른 요인에도 불구 민감한 형광 물질 농도가 될 수 있음을 유의해야한다, 그것은 할당 불가 의 해결특히 현미경 모든 이미지는 그 해결책이있을 것이라는 점을 가정합니다. 무엇을 할 수는 있지만, 이러한 평균 현지화 정밀도, 현지화 번호와 같은 해상도의 다양한 측면을 측정하고 27 표류하는 것입니다. 기준 마커는 그들이 할 수있는 모든 실험에 포함되지 않을 수 있더라도, 적어도, 현미경 시스템, 그 환경의 특성과 잘 같은 많은 시간 후에 시작 열 평형에 도달하는 데 필요한 방법으로서 작동 고려 사항을 이해하는데 사용될 수. 이것은 이미지 (43)를 획득되는 동안 샘플 위치를 보정하는 난시 렌즈의 사용 및 피드백 메커니즘을 필요하지만뿐만 아니라 측 방향 드리프트 보정으로서, 기준 마커는, 특성화하기 위해 사용 및 축 드리프트에 대한 정확한 수있다. 상용 최고 해상도 시스템은 일반적으로 안정성 제어 또는 초점 드리프트를 보정하기위한 실제적인 솔루션이 될 수 있습니다 초점 잠금을 메커니즘의 일종을 포함 할 것이다.
이비 구체적으로 염료 직접 또는 보조 항체와 같은 다른 공액 분자를 사용하는 등 덱스 트란과 유리 코팅에 대한 대안 재. 이러한 방법의 한계는 유리에 결합 분자의 개수를 알 수없는 점이다. 사용 된 대체 필라멘트 구조는 미세 소관 (28)와 DNA 21이 (가) 있습니다. 그러나, 매우 작은 크기와 편리한 시판 시약의 조합이 발산 또는 분지 필라멘트의 이격 거리가 또한 시스템 성능 (27)의 유용한 측정 될 수 특별히, 매력적인 대안 악틴 만든다.
테스트 샘플의 발전을위한 공간이 지역 28,29,46,47 최근 진행에도 불구하고 있습니다. 특히, 다색 화상이 촬상 모든 세 주요 측면에서 도전의 개수, 샘플 라벨링 화상 획득 (하드웨어), 소프트웨어 (영상 처리 및 정렬)을 제시한다. 가 있었다출판물 이러한 측면 4-6을 해결하고 적절한 시료 및 방법은 이미지의 이러한 유형을 생성하고 신뢰성 해석에 중요한 것을 따라서 분명하다의 수. 실제로, 최근은 dSTORM는 두 가지 컬러 이미지를 가지고 가고, 해결, 핵 기공 복합체의 높은 대칭성하는 데 사용할 수와 저자는이 색수차 보정 (45)의 성능을 평가하는 이상적인 방법이 될 것이라고 제안 것으로 나타났다. 또 다른 흥미로운 방법은 떨어져 46 특정 하위 회절 거리에 위치 형광체의 가능성을 만들어 nanoruler을 만들 수있는 DNA 종이 접기를 사용하는 것입니다. 이것은 해상도를 평가하고 거리 측정의 제조 방법을 제공한다. 그러나, 궁극적 인 목적은 복잡한 3 차원 구조이다 같은 세포 같은 비 이상화 샘플, 이러한 초 해상 기술을 적용하는 것이다. 이때, t의보다 철저한 이해를 배합그 데이터를 취득하는 적절한 방법으로 처리하고, 화상 메트릭스를 제공 한 사용자를 돕는 소프트웨어 도구와 결합 기법은 궁극적 해답이 될 가능성이있다. 28,29,47,48
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 영국의 국가 측정 사무실의 화학 및 생물 계측 프로그램에서 자금을 인정합니다. 우리는 기술적 조언과 제안 세바스티안 반 데 린데, 미 크로스 Erdelyi 에릭리스 감사합니다. 우리가 도움의 의견과이 원고에 대한 논의를 위해 미 크로스 Erdelyi, 에릭리스 및 최대 Ryadnov 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents | |||
References
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