Summary
Fermentorer används för att öka kultur utbyte och produktivitet bioengineered celler. Efter screening flera mikrobiella eller djurcellodlingskandidater i skakkolvar, är nästa logiska steg för att öka den valda kulturens biomassa med fermentorn. Denna video visar installationen och driften av en typisk bänk bioreaktor systemet.
Abstract
Jäsning system används för att ge en optimal tillväxtmiljö för många olika typer av cellkulturer. Möjligheten ges av fermentorer att noggrant kontrollera temperaturen, pH och löst syre koncentrationer i synnerhet gör dem avgörande för effektiv storskalig tillväxt och uttryck av fermentationsprodukter. Denna video kommer att kortfattat beskriva fördelarna med fermentorn över skakkolven. Det kommer också att identifiera viktiga komponenter i ett typiskt bänk jäsningssystemet och ge grundläggande instruktioner om installationen av fartyget och kalibrering av sina sonder. Tittarna kommer att bekanta sig med steriliseringsprocessen och visat hur man ympa odlingsmediet i kärlet med kulturen. Grundläggande driftsystem, provtagning, och skörd kommer även att demonstreras. Enkel analys av data och system för sanering kommer också att diskuteras.
Introduction
Basic jäsning teknik är en förlängning av den enkla skakkolv teknik för att odla kulturerna. Den växte fram ur en önskan att styra tillväxtmiljöer för levande kulturer i en mer komplett och kvantitativt sätt. Satsvis odling skakflaskor är vanligen begränsade genom oprecis styrning av temperaturen. Temperatur enhetlighet i en inkuberade shaker eller varmt rum är mycket varierande, ibland förirra 5 ° C eller mer från den avsedda börvärdet. Eftersom skakkolv normalt agiterades vid en fixerad hastighet, är syreupptag och gasutbyte begränsad. När den tillgängliga omgivande syret är slut, de flesta kulturer inte mår bra. Det finns ingen pH-kontroll i skakkolvar. I många fall, om kulturen inte begränsas av råvara blir det surt till den grad att skada för kultur och andning saktar dramatiskt. De flesta skaka kolv kulturer också köras som ett parti, vilket innebär att de matas endast en gång vid eller nära början av kulturerna inoculation. Efter denna initiala kolkällan förbrukats avbryts odlingen växer. I vissa fall dess metabolism kan flyttas och börjar konsumera andra metaboliter i odlingsbuljongen, ibland som ändrar egenskaperna hos den resulterande biomassan eller protein. Skakflaskor är också oftast föremål för media avdunstning i varmare kulturmiljöer, normalt 10% av volymen per 24 timmar vid 37 ° C. Denna förlust ändrar densiteten hos kulturen och förbjuder långsiktiga driften av systemet. Slutligen kan användaren stöter skummande från media efter omröring. Förekomsten av skummet i det övre utrymmet ovanför kulturen kommer att begränsa gasutbyte och ytterligare dämpa tillväxten.
Grundjäsnings Systemet är utformat för att ta itu med alla dessa begränsningar. Noggrann temperaturstyrning uppnås i jäsningstankar genom användning av pumphjulet omrörning och en värmemantel. En sensor in i kärlet och återkoppling av uppvärmning och kylning av den här jackan brukarresulterar i temperaturreglering ± 0,1 ° C runt börvärdet. Stationär fermentorer ger i allmänhet kontroll av pH via flytande reagens förutom genom en pump. PH-värdet övervakas kontinuerligt i ett försök att hålla miljön optimal för celltillväxt. Korrekt luftning upprätthålles genom den tidigare nämnda blandnings impellern eller genom infusion av luft eller syre kompletterat gas direkt in i kulturen. Med skjuvkänsliga kulturer är syre kompletterat gas den primära mekanismen för upprätthållande av syrenivån i kulturen. Mätning av syre i lösning uppnås vanligen genom en polarografisk sond, som normalt inte är tillgängliga för användning i skakflaskor. Det är också möjligt att kontinuerligt eller med jämna mellanrum lägga foder till fartyget för att bibehålla tillväxt på ett linjärt eller exponentiellt sätt. Utträdes gas kondensor ger en kall yta för ånga i avgasflödet för att kondensera och därmed skydda kulturvolym och densitet. Periodisk tillsats av skumdämpare ytaktivt manövrerasav en konduktivitetssond i kulturen, minska skum på ytan och tillåter gasutbyte.
Fartyget, med alla givare, beslag, impellrar, skörd rör och slangar, monteras och steriliseras i en vanlig autoklav. Efter sista sond kalibreringar och stabilisering till omvärlden, är kulturen till kärlet. Systemet kan sedan användas för att karakterisera den kultur på ett sätt som är mer kvantitativt och exakt än med en skakkolv metod. Tät kontroll av temperatur, pH, syrehalt, foderförbrukning, vätskeavdunstning och skumnivåer bidrar till en mycket högre biomassa och bättre proteinutbytet.
Protocol
- Börja drift med fartyg setup. En konventionell fermentorn har följande komponenter som måste installeras (Figur 1):
- pH-sond - för mätning av pH-värdet i den levande kulturen. Kalibrera sond före installation och sterilisera med fartyget. Installera sond i huvudplattan.
- pO 2 prob - för mätning av halten löst syre inne i fartyget under jäsningen. Installera i huvudplattan.
- Harvest rör för provtagning av kulturen. Installera den här justerbar höjd komponent i huvudplattan.
- Gas sparger - befinner sig vid botten av kärlet och tillhandahåller gas infusion till odlingen. Haka sparger upp till gaskällan på fermentorn och montera i huvudplattan.
- Impeller axeln och pumphjulet - impellern rör om kultur och är kritisk för att upprätthålla kulturen likformighet i kärlet.
- Avgas kondensor - för att stävja evaporativ förlust i kärlet genom att kyla gasen vägen avgas.
- Reagenspump linjer för reglering av pH-eller fodertillsats.
- Rengör kärlet och huvudplattan med tvål och vatten. En mjuk borste rekommenderas för skurning av fartyget och huvudplattan. Blekmedel eller rengöringsmedel med klor kan inte användas för att rengöra kärlet.
- Om media inte värma labila, lägg till den rent kärl. Bara lägga till maximalt arbetsvolym har uppnåtts. I detta fall är maximal arbetsvolym 3.3 L för en 5 L total volym kärl.
- Montera fartygets huvudplattan, se till att O-ringen sitter korrekt.
- Installera avgaskylare.
- Montera skumdämpningssonden till sin 10 mm-porten.
- Installera skörden röret in i dess 10 mm port. Sätt ett rörstycke på toppen av den och spänna fast den.
- Montera slang och en 0,20 ìm filter på strilinloppet och sedan klämma detta off.
- Kalibrera pH-sond:
- Samla 2 referens buffertar i små bägare, en tvättflaska och en reserv wash bägare.
- Haka pH-sonden upp till fermentorn och slå på fermentorn på.
- Bläddra till pH parameter och med hjälp av menyknappen, bläddra till "Cal" alternativ, och tryck på "Enter".
- Välj 2 "för 2-punktskalibrering.
- Tvätta sondspetsen och dränka in den låga referensbufferten. Värdet på fermentorn kommer att stabiliseras. Med hjälp av + och - knapparna, justera det visade värdet för att matcha värdet av referensbuffert pH. När det slutar blinka, tryck på "Enter".
- Tvätta proben och sätt in den andra referensbufferten. Låt värdet stabiliseras och sedan använda knappsatsen för att göra det visade värdet matcha den höga referensbuffertvärdet. Tryck på "Enter" för att bekräfta.
- Tvätta sondspetsen och koppla bort den från fermentorn. Sätt på skyddslocket på anslutningen och installera den i huvudplattan.
- Öppna pO 2 sondspetsen och kontrollera för att säkerställa att detfinns tillräckligt med elektrolyt för att täcka spetsen. Om inte, tillsätt lite till reservoaren och stäng den igen.
- Installera PO2 sonden i huvudplattan och se till att autoklaven locket läggs på för att skydda sina elektriska anslutningar. Det kommer att kalibreras efter sterilisering.
- Skaffa en flaska för reagens foder med ett stigrör och luftfilter. Lägg pumpslangen till dopprör-port och den andra änden till inloppsöppningen på fermentorn.
- Placera slangen på alla oanvända portar klämma sedan slangen av.
- Installera ett 0,45 ìm filter på avgas kondensorn. Detta filter gör att fartyget inte pressa i autoklaven.
- Kontrollera att alla rör som sträcker sig under nivån för medierna är klämda av för att förhindra material från att komma ut.
- Placera kärlet i autoklav under 25-30 minuter vid 121 ° C, flytande cykel. Varning: När det kommer ut kommer det att bli mycket het.
- Installera fartyget på jäsningsbasen.
- Anslut pHsond kabeln.
- Fäst PO2 sondkabeln.
- Haka sparger upp till gas tillägg rotameter.
- Sterilt tillsätt 1 M NaOH-reagens till flaskan med stigröret och montera pumphuvudet på huvudspindeln basen pumpen.
- Placera temperatursensorn i dykrör på huvudplattan. Se till att det går hela vägen till botten av skyddsficka.
- Sänk agitation armen på fartyg pumphjulskopplingen.
- Se till att fermentorn är på.
- Kontrollera att vatten finns tillgängligt för fermentorn.
- Sätt på lufttillförseln till fermentorn.
- Bläddra till parametern temperatur och ställ in temperaturen på 37 ° C. Tryck på "Enter"-knappen för att starta temperaturkontroll. Fartyget kommer att värmas upp i 15 min eller mindre.
- Stäng av gasflödet till en kärlvolym av media per minut eller mindre. För detta inrättas, är gasflöde 3 L / min. Bubblor ska visas längst ner.
- Bläddra till agitation parameter och satt till 300 rpm. Tryck på "Enter" för att slå på agitation.
- När temperaturen nått 37 ° C, bläddra till pH-parametern och ställ in den på 6,8. Vrid pH-kontroll genom att trycka på "Enter"-knappen.
- Ställ agitation till maximal hastighet på 1000 rpm för körningen.
- Se till att PO2 sonden är polariserat korrekt att visa korrekta värden. Efter 2 timmar, bläddra till PO2 parameter och använda "Meny"-knappen för att välja "Kalibrera Function" och välj 1 poäng kalibrering.
- Efter 15 minuter, använd markörer för att ställa in värdet till 100 och tryck på "Enter". Detta kommer att kalibrera pO 2.
- Bläddra till agitation och satt till 300 rpm.
- Med hjälp av "Meny"-knappen, vrid "Cascade" till "på" i agitation menyn. Detta kommer att öka hastigheten på agitation i ett försök att hugga upp luftbubblor och tvinga mer syre i lösning som efterfrågan ökar tillväxten. Bläddra till PO2 parameter och ange värdet till 30. Tryck på "Enter"-knappen för att starta PO2.
- Starta kontroll mjukvara på datorn.
- När proberna är kalibrerade, är agitation stabil vid 300 rpm, temperatur på 37 ° C och pH-värdet är nära 6,8, är det dags att ympa. Använda alkohol, sterilisera den port som kommer att användas för ympning.
- Draw inokulatet i en spruta och tillsätt den i den steriliserade porten. Stäng porten.
- Märk tidpunkten för ympning i en loggbok.
- Det är också viktigt att ta ett prov på sterilisering tid. Sterilisera slutet av skörderöret rör med alkohol.
- Öppna klämman täcker skörden porten och använda en spruta för att göra ett urval. Det första provet är oftast bort eftersom det har suttit i röret.
- Använd en annan spruta för att dra ett annat prov.
- Med en tredje sprutan, tryck luften tillbaka genom röret för att ta bort så mycket dödvolymfrån linjen och klämma linjen av.
- Bestäm celldensitet och pH och registrera värdena. Med mikroorganismkulturer, är det användbart att logga värden varje timme. Intervall är kulturberoende.
- Harvest metod beror på uppsåt för kulturen efter att tillväxten är klar. I detta fall är provet odlings en sista gång för att ta emot ändpunktsvärden för celldensitet och eventuell pH eller mätning av våt cellvikt. Öppna huvudplattan avyttras innehållet i en utsedd "kill tank" med blekmedel eller andra antimikrobiella medel.
Representative Results
Bioreaktorn kan köras med eller utan IRIS mjukvaran. Men för att fånga data, är det bäst att använda programvaran. Före tillsats av bakterier, måste pH-och syresensorer kalibreras, impellern hastighet n och den inställda temperaturen. I figur 2 är data utgång för en bioreaktor körning presenteras. Temperaturen inställdes till 30 ° C, pumphjulets hastighet med 200 varv per minut. De parametrar som kan vara olika för varje experiment, men före tillsats av bakterier bör systemet vara i stationärt tillstånd. I figur 3 är ändringen i syrekoncentration med tillsats av bakteriekulturen visas. Börvärden för detta experiment är 37 ° C, omrörare vid 200 rpm, O 2 vid 70%. Vid tiden 19:20, levererar matarpumpen bakterie ympkulturen vid ett OD på 0,1 orsakar ett omedelbart släppa i O 2-nivå. Bioreaktom reagerar på förändrade O 2-nivå med en ökning av luftflödet och impeller hastighet. Than börvärden för ökningarna fastställs i kaskaden (steg 35). Reaktor pH övervakas i realtid, med pH-värdet minskar då ökar vilket framgår av pH-linjen variationer över tiden (Figur 4). Hela körningen kan analyseras och parametrar justeras för senare experiment.
Figur 1. Fasta bioreaktor med alla delar märkta och anslutna. Figuren visar tankreaktor vid början av en körning rörs. De delar av reaktorn är märkta och omfattar sensorer, pumphjul, temperaturmätare, foder-och provtagningsflaskor, avgasporten, lufttrycksmätare, värmemantel, kondensor torn och kontrollpanelen.
Figur 2. Skärm bild av bioreaktor SOFtware vid början av körningen. Vid starten av en omrörd tank körningen hölls temperaturen inställd på 30 ° C (gul linje), impeller hastighet med 200 varv per minut (röd linje), pH-värdet vid 6,5 (grön linje), och pO 2 på 57,2% (blå linje). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Skärm bild av bioreaktor programvara under körningen som syre minskar. När kulturen är i aktiv tillväxtfas, förbrukar det syre och mängden syre i reaktorn minskas (blå linje). Genom att öka impellerhastighet, kan mer syre tillsättas till kulturen (röd linje). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Skärm bild av bioreaktor programvara visar pH förändras över tiden. PH för kulturen övervakas kontinuerligt och med tiden minskar när mjölksyra bildas och ökar sedan som bas läggs till bioreaktorn (blå linje). Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Omröringstank bioreaktorer är standard inom bioteknikindustrin och har använts i över 40 år 1. Den lilla omröringstank har varit viktigt för uppskalning, skala ner, stam optimering, karakterisering, och processutveckling. Det kan också ha en viktig roll i utvecklingen av individualiserad medicin 2. Det småskaliga bioreaktorn är mest likt in situ-förhållanden för celltillväxt, eftersom den kan följas och optimeras under en körning. Oftast är inledande experiment utförs med skakflaskor men villkoren i den småskaliga bioreaktor skiljer sig avsevärt från skakkolven. I ett experiment, fann vi att villkoren för optimal tillväxt av E. coli och framställning av grönt fluorescerande protein (GFP) i skakflaska inte översätta till den omrörda tanken (opublicerade data).
Andra metoder för att odla celler i stor skala innefattar rullflaskor, enkel use gungande plattform bioreaktorer 3 och större engångs bioreaktorer med arbetsvolymer från 50 till 5.000 L. Varje metod ger utmaningar för uppskalning, men har funnit en plats i produktionen. Den enda användning gungande plattform bioreaktor liknar omröringstanken, och åstadkommer en reglerad miljö. Den skiljer sig från den omrörda tanken i att blandning uppstår på grund av en vaggande rörelse för att generera vågor för att förhindra cellsedimentering och tillhandahålla syresättning. De hydrodynamik för denna metod skiljer sig från den omrörda tanken och maximal volym är begränsad till 1000 L. Skillnaderna kan påverka celltillväxt och produktproduktion. Övriga engångssystem kombinerar den omrörda tanken med engångs reaktorn för att ge en plattform med ett minimum av infrastruktur och tillhörande overhead, och möjligheten för high-throughput bioprocessning 4.
Nya användare av stationär bioreaktorer kan ha problem att bestämma initiala börvärden för pH, PO2 och temperatur, men publicerad forskning kan refereras för denna information 5, 6, 7, 8, 9. Med bakteriekulturer i synnerhet, är det rekommenderat att starta omrörning vid samma hastighet som den skakkolv och temperaturen på samma börvärde. Kultur pH från tidigare skakkolvar körningar kan också användas som en startpunkt. Inställning av värdet Po 2 är svårare och är normalt bestämmas empiriskt. Men börjar med 50% PO2 är en rekommenderad startpunkt.
Disclosures
Författare A. Magno är anställd av ATR Biotech som producerar reagenser och instrument som används i den här artikeln.
Acknowledgments
Detta projekt var stöd delvis av Johns Hopkins University, kontoret för Provost genom Gateway Science Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Sigma | L3022 | |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G | |
| LB broth | Sigma | L3022 | |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 | |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R | |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 | |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 | |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 | |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 | |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 | |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 | |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 | |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 | |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
- Shuler, M., Kargi, F. Bioprocess Engineering Basic Concepts. , 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Wave [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave (2012).
- Xcellerex [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).
- Bioreactors [Internet]. , Applied Technical Resources. Available from: http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf (2012).
- Infors, H. T. Minifors operating Manual and user guide. , Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.
