Summary
本文介绍了蟑螂腹神经索解剖，并从塞卡尔神经和连接词外记录。由塞卡尔神经或尾叶的直接机械刺激的电刺激产生诱发反应。
Abstract
蟑螂腹神经索制剂是易于处理的系统，用于神经行为学实验，神经网络建模和测试杀虫剂的生理效应。本文介绍了可用于测定昆虫的神经系统如何响应环境扰动蟑螂感官方式的范围。这里强调的是由尾叶在美洲大蠊巨头光纤传输介导的逃避行为。这在原位制备只需要适度的解剖技能和专长电产生的神经元活动的可重复的记录。肽或其它化学试剂然后可以在与生理盐水溶液直接施加到神经系统。杀虫剂也可事先对解剖给药和避让电路可以作为中枢神经系统的兴奋性状态的代理。在这样的背景下在此描述的测定法也是有用的对r感兴趣的肢体再生和神经系统发育的演化esearchers为其P.美洲是一个既定的模式生物。
Introduction
有超过4000种的蟑螂，但只有约30是家喻户晓的害虫。也许最认可的是名不副实的美洲大蠊美洲大蠊起源于非洲，现在发现几乎无处不在这个星球上。除了 它的运行速度快1，回避行为，在热带P。美洲是能够飞行2,3。
蟑螂的中枢神经系统（CNS）的主要特点是它的分段控制的性质和权力下放进程4,5。脑，胸，腹部神经节是由成对的interganglionic连接词连接在一起形成腹神经索（VNC）。
在每个段的神经节整合中心。它们是由含有负责血 - 脑屏障渗透性只是它们下面的细胞外，皮层区域，以及神经元原稿的胞体的内廷中的神经节。这些胞体可能属于的interneurons，调节神经元，或运动神经元。他们提供保持原点（本地interneuron）的神经节内的神经轴突，或中枢神经系统（interganglionic的interneurons）的神经节或周围肌肉细胞（运动神经元）的终止之间的轴突投射。大多数胞体位于腹侧或ventrolaterally在皮层神经节5。配对，interganglionic连接词只包含轴突和无神经元胞体。
一个神经节的神经纤维含有胶质细胞（神经胶质），轴突束，轴突束和神经元的树突（突起）。该神经纤维缺乏是神经元细胞体。这就是神经细胞和整合投入之间的直接突触的沟通出现神经节内的区域。
美洲大蠊P的能力美洲检测和突然接近的捕食者回应（脚，汉d， 等等 。）已被归因于一种条件反射电路，包括尾叶和巨纤维系统6,7。的尾叶是一对位于上腹部的端部（ 图1）喇叭状，风敏感结构。在体育美洲每个尾须的腹面含有约200毫（线程），它们分为14列毛。这些列的九个可以在不同的动物被一致认定根据相关联的受体细胞和轴突的响应特性。每个头发是在一个插座，它允许弯曲最容易在一个平面上，作为列特异性的。头发在沿其平面沿一个方向的运动导致在受体细胞去极化和脉冲串的动作电位（AP）的中的感觉神经元。移动在相反的方向抑制任何正在进行的自发的AP 8。偏转的响应和方向性的优选平面是不同在每列中。因此，filifor米毛发受体复合物不仅用于检测空气的运动，但也为“编码”，在接入点，从该气流源自的方向的形式负责任。此信息由中枢神经系统的处理结果在“合适的”逃避反应6,7。在感觉毛的这种功能，柱状特异性保存从动物到动物。
每个丝状毛发的受体细胞是负责转导毛发的机械偏转成神经事件（导致受影响的受体细胞的轴突9的突发或抑制该接入点通过塞卡尔行进到终端腹腔神经节（A6）神经XI，在那里它们与腹神经索（VNC）的巨轴突突触的巨轴突被认为是负责运动神经元的传输和随后的激励而导致的逃避行为6,10,11。
行为延迟Øf P的逃避反应美洲是最短的任何动物7中的一个。行为延时是一个刺激的在机械感受器的到来和逸出反应的开始之间的时间。在使用高速摄影记录从一个攻击蟾蜍的企图逃跑的实验中，蟑螂被观察到开始轮到它离蟾蜍在大约40毫秒（时间从舌头延伸的开始蟑螂运动7,12。使用控制喷风，行为延迟可以减少到11毫秒，其他的实验表明，12毫米/毫秒的最小风速度粉扑（用600毫米/毫秒2的加速度）可以唤起一个转义响应，而更低的速度（0.1毫米/秒）引起缓缓地走蟑螂停止移动12。
强相关性是巨大的光纤系统和逃逸行为之间通常存在已经有据可查13,14。在研究所元代其中一个特定的细胞是必要的和足够的唤起特定行为的小区被称为命令神经元15,16。巨人的interneurons（GIS）在P的风遁电路美洲是没有必要的反射。已经烧蚀实验动物大兵仍然表现，因此这些美国大兵不考虑命令的神经元17,18的逃避行为。切断颈连接词是喙的感觉电路也会影响行为，这表明从大脑降序输入有对逃逸19的方向的效果。精细控制和冗余的这些方面是最重要的有机体的生存，并通过生物 胺20的补充，神经化学调制。
该P.美洲神经索的准备一直是neuroethologists一个优雅的模型系统在过去的几十年开始，罗德<的开创性工作燮> 21。它允许学生记录，显示和分析由巨型的interneurons初级感觉活动，所得响应他们的输入22,23,24。除了传达的想法，可识别的神经回路背后的行为反应的环境，这些练习应该灌输给这个普通的家庭害虫作出的生物贡献的赞赏。
Protocol
1。解剖
在本协议中使用的蟑螂生理盐水溶液具有下列组成：
蟑螂生理盐水溶液36：（克为100ml）中
210 mM氯化钠（1.227克）
2.9毫米氯化钾（0.0216克）
1.8毫米氯化钙2（0.0265克）
0.2毫米的NaH 2 PO 4•2H 2 O（0.0032克）
1.8毫米的Na 2 HPO 4•7H 2 O（0.0483克）
（pH值7.2。调节pH，用1M的NaOH或1M的HCl）。
- 选择雄性蟑螂从贮水箱，具有强大的尾叶（ 图1）。相比于女性的男性的最后段狭窄，且不含卵巢和卵子的质量，男性更容易剖析。 P的男性美洲有一对尾叶之间的短测针。这些测针未在女性观察。
- 切断翅膀，腿和头脚的身体，腹面朝上，以二SH内衬有机硅弹性体。
- 用钳子拿起腹板和他们剪除用细剪刀，开始在后端和工作向前。总是用生理盐水保持内脏湿润，同时试图保持尾叶干。人们可以使用蜡或橡胶件定位在腹部向上，以防止盐水浸湿的尾叶。如果他们不被淋湿，干他们用一张纸巾。推到一边内脏和白质（脂肪体）。 VNC的是在该领域的中心，运行腹部的长度，并且应该有光泽的气管之间可见。神经索是半透明的，并且最初可能很难看到，直到照明的适当调整（ 图2）。不处理VNC用镊子或昆虫针，而是用玻璃探头操纵它。
- 清除动物的气管系统尽可能最佳的用钳子神经线和一对精美的玻璃制品需要LES，非常仔细地分裂VNC连接词A6和A5或A5和A4神经节（ 图3）纵向之间。底座上的尾叶和腹部向上出盐水浴缩短昆虫标签和蜡或有机硅弹性体，可以以适合的制剂（ 图4A和B）的一个楔形的。要格外小心，在过去的腹节不损坏该项目进入神经 节的神经塞卡尔（ 图2D和5）。
2。细胞外记录
- 解剖的制备，显微镜，和记录装置应该设置一个法拉第笼内，以阻止外部，特别是交流电源，电场可以重写信号从神经元（ 图6）。
- 放置显微镜，使其俯瞰显微镜载物台。一旦该制剂放置在台上，调节高强度照明光束的位置对于它的最佳视觉效果。
- 交流/直流差动放大器连接到集成数据记录单元（具体硬件和软件设置的详细信息之前已经描述了25）。头阶段保持抽吸电极应连接到放大器。银地线已涂有Cl -的插入更稳定的记录腹部的结果。其原因是，如果在体腔中的溶液不与在盘的浴液接触，以保持接地的记录电极相关联的流体。
- 录制频率设置为4千赫。设定电压量程（y轴）为500 mV（这可以被调整以优化轨迹的可视化）。运行该录音软件在连续或示波器模式，以响应刺激记录神经活动。
- 切VNC连接词接近A5的一个，然后将切口端连接到A6成吸电极。请务必为pULL生理盐水吸吸电极在神经前盖里面的银线。
- 上到位于每个尾须毛干吸管吹空气。看是否刺激对尾须同侧的毛发所记录的连通性提供了比健侧一个不同的反应。采取的响应的幅度和峰值在刺激过程中给定时间间隔的数量的注释。
- 将吸电极的塞卡尔神经进行录制。为了获得更好的贴合，开关电极尖端与一个较小的开口，如果必要的。
- 切塞卡尔神经接近A6，然后吸了通向尾须神经。应该有动作电位的自发放电。现在，吹气到尾须，并注意反应。
3。电刺激感觉神经，以确定招聘
- 改变录音软件扫模式，这样它记录的痕迹（100-500 MSE角），每次刺激触发。
- 刺激电极连接，刺激器的输出。
- 与两个小钩引线或片段连接的刺激电缆。
- 从激励器输出的BNC触发器连接到所述记录装置上的触发输入。
- 下面的刺激参数应该唤起反应：持续时间：0.3秒;延迟：10毫秒;频率：1赫兹，电压：根据需要在录音得到的信号调节（刚刚超过阈值，并能够获得的最大响应）。我们没有理由去电压高于最大阈值高得多招聘作为一个高电压可损坏的神经。
- 切塞卡尔神经的末梢尽可能使长期神经根可拉成的刺激吸引电极（ 图7，箭头）。可用于A6和A5或另一段更前壁之间的连通。
- 设置录音吸电极，因此您可以PULL了切连通到电极。一定要拉一些生理盐水吸吸电极在神经前盖里面的银线。确保刺激电极也接地在洗澡液（在靠近A3腹部是理想的）。
- 提供了一系列单一的刺激增加电压，直到动作电位出现在屏幕上。每个人都应该做的最小激励电压和持续时间的记录招募的响应。增加强度，直到连接词一个突触反应观察。从巨轴突的大穗（外接入点）先出现，然后其他较小的AP的也可以观察到。
Representative Results
对尾叶毛发通过空气的吹刺激引起，可以使用附加或腹腔神经节或神经塞卡尔本身（ 如图8所示 ）之间的联结外抽吸电极进行记录的初级感觉神经元的放电。从两个区域记录尖峰振幅的几个微伏到毫伏的数量级。由于在神经节感觉整合在复合动作电位或从塞卡尔神经记录个人尖峰观察到尖峰的个数比在记录从连接词观察到显着更高。但是也可以注意到，基本上在记录由于在电极和神经组织之间的紧密密封噪声在结缔组织少。
通过喷着气在尾叶大穗可以在连接词（ 图8A）进行观察。使用该刺激方法，A3和A4之间的录音典型 LY显示巨头interneuron（S）的大穗的特性。从塞卡尔神经录制时擦身体用钳子的尾叶生产活动的一个强有力的胸围（ 图8B 1）。在另一个记录，2喷空气的每个产生于塞卡尔神经快速猛击响应（ 图8B 2）。当电刺激神经 塞卡尔在A3和A4之间的连通的抽吸电极和记录，可以观察到一个阈值的刺激，以诱发反应（ 图8C 1）。该塞卡尔神经的电刺激诱 发清楚在连接词的响应可被量化为与药剂或局部环境包围，如温度操控的研究（ 图8C 2）。
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图1。 美洲大蠊具有完好尾叶。
图2。蟑螂的神经索的观察与腹角质层去除腹面观（A）。由箭头所概述的段的放大图可见于（B）。 （C）中的连接词是A4和A3之间洒落用玻璃探头。 第六届腹神经节中显示（D）与两个塞卡尔离开神经在尾端。
图3。蟑螂的神经索的示意图腹面观。
图4，尾叶是向上时出盐水浴的。打开的腹部可以用生理盐水（A）与蟑螂的尾端被提升用小楔形形片有机硅弹性体，以保持尾叶出被洪水淹没镀液的（B）。
图5， 第 6腹节与塞卡尔神经（箭头概述）。
图6。设备设置。 点击这里查看拉尔GER的身影。
图7。刺激和记录电极设置。
图8的连接词和塞卡尔神经与各种刺激手续神经录音。录音与A3和A4之间的连接词吸电极，而膨化的空气中，尾叶（A）。从主塞卡尔神经元具有吸电极记录，而无论是身体上摩擦（B 1）或提供空气喷（B 2）的结果在活动中迅速爆发的塞卡尔神经。电刺激塞卡尔神经产生的连接词回应（
Discussion
其中一个原因，参展的技术为这个经典的准备是，尾叶系统一直并且仍然是研究解决神经电路的发展问题以及关于突触的修复和再生26-31题的活跃领域。唤起活性的蟑螂腹神经索的任一方法可以用来检验的药理剂或杀虫剂对神经系统功能的影响。这些实验是通过简单地溶解神经活性化学物质进入盐水进行。交换这种解决方案与正常洗澡介质后，改变诱发或自发的活动可能会同时从连接词或运动神经记录给对中枢神经系统功能的化学品的效果一致的读数进行观察。
正如在所有的神经生理学实验的一个常见问题是电气噪声。可能是在为这些准备信号质量的最大因素我S上的神经组织抽吸电极密封。一个密封不完全在塞卡尔神经或结缔组织画是理想的。记录，也可以与神经索和绝缘的VNC与矿物油和凡士林的混合物下放置双钩电极制成。该混合物可以被加载到一个注射器和神经索32周围排出。还仔细解剖这里是至关重要的，因为在中枢神经系统的任何准备。有些人可能会发现更容易通过解剖背角质层进入中枢神经系统。虽然这减小了损坏腹神经索的可能性也可以是更难以用这种方法除去所有的内脏。
这里不描述，但该制剂是适合于细胞内记录的巨型的interneurons 32,33。整个神经索，也可以拆下来同时容纳几个记录和刺激电极。在触角叶，蘑菇博其实探索DY，和其他中枢神经系统前部结构仍在进行中34-35。而蟑螂中枢神经系统继续阐明现代神经生物学研究光这个特殊的准备是很简单的本科学术实验室使用。
Disclosures
作者宣称，有没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Hyewon库珀的插图。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | 182 silicone elastomer kit |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| NaH2PO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Material Name | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt's brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Full, R. J., Tu, M. S. Mechanics of a rapid running insect: two-, four- and six-legged locomotion. J. Exp. Biol. 156, 215-231 (1991).
- Ritzmann, R. E., Tobias, M. L., Fourtner, C. R. Flight activity initiated via giant interneurons of the cockroach: Evidence for bifunctional trigger interneurons. Science. 210, 443-445 (1980).
- Libersat, F., Camhi, J. M. Control of cercal position during flight in the cockroach: a mechanism for regulating sensory feedback. J. Exp. Biol. 136, 483-488 (1988).
- Ganihar, D., Libersat, F., Wendler, G., Cambi, J. M. Wind-evoked evasive responses in flying cockroaches. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 175, 49-65 (1994).
- Pipa, R. aD., F, The American Cockroach. , Chapman and Hall. 175-216 (1981).
- Westin, J., Langberg, J. J., Camhi, J. M. Responses of giant interneurons of the cockroach; Periplaneta americana to wind puffs of different directions and velocities. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 121, 307-324 (1977).
- Camhi, J. M., Tom, W., Volman, S. The escape behavior of the cockroach Periplaneta americana. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 128, 203-212 (1978).
- Nicklaus, R. Die Erregung einzelner Fadenhaare von Periplaneta americana in Abhängigkeit von der Grösse und Richtung der Auslenkung. Z. Vgl. Physiol. 50, 331-362 (1965).
- Westin, J. Responses to wind recorded from the cercal nerve of the cockroach Periplaneta americana. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 133, 97-102 (1979).
- Ritzmann, R. E. Neural Mechanisms of Startle Behavior. , Plenum Press. 93-131 (1984).
- Ritzmann, R. E., Pollack, A. J. Identification of thoracic interneurons that mediate giant interneuron-to-motor pathways in the cockroach. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 159, 639-654 (1986).
- Plummer, M. R., Camhi, J. M. Discrimination of sensory signals from noise in the escape system of the cockroach - the role of wind acceleration. J. Comp. Physiol. 142, 347-357 (1981).
- Bullock, T. H. Neural Mechanisms of Startle Behavior. , Plenum Press. 1-14 (1984).
- Pollack, A. J., Ritzmann, R. E., Watson, J. T. Dual pathways for tactile sensory information to thoracic interneurons in the cockroach. J. Neurobiol. 26, 33-46 (1995).
- Atwood, H. L., Wiersma, C. A. Command interneurons in the crayfish central nervous system. J. Exp. Biol. 46, 249-261 (1967).
- Olson, G. C., Krasne, F. B. The crayfish lateral giants as command neurons for escape behavior. Brain Res. 214, 89-100 (1981).
- Comer, C. M. Analyzing cockroach escape behavior with lesions of individual giant interneurons. Brain Res. 335, 342-346 (1985).
- Comer, C. M., Dowd, J. P., Stubblefield, G. T. Escape responses following elimination of the giant interneuron pathway in the cockroach, Periplaneta americana. Brain Res. 445, 370-375 (1988).
- Keegan, A. P., Comer, C. M. The wind-elicited escape response of cockroaches (Periplaneta americana) is influenced by lesions rostral to the escape circuit. Brain Res. 620, 310-316 (1993).
- Casagrand, J. L., Ritzmann, R. E. Biogenic amines modulate synaptic transmission between identified giant interneurons and thoracic interneurons in the escape system of the cockroach. J. Neurobiol. 23, 644-655 (1992).
- Roeder, K. D. Organization of the ascending giant fiber system in the cockroach, Periplaneta americana. J. Exp. Zool. 108, 243-261 (1948).
- Ramos, R. L., Moiseff, A., Brumberg, J. C. Utility and versatility of extracellular recordings from the cockroach for neurophysiological instruction and demonstration. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 5, (2007).
- Oakley, B., Schafer, R. Experimental neurobiology. , University of Michigan Press. Ann Arbor. (1978).
- Welsh, J. H., Smith, R. I., Kammer, A. E. Laboratory exercises in invertebrate physiology. , Burgess Publishing Company. Minneapolis. (1968).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Bacon, J. P., Blagburn, J. M. Ectopic sensory neurons in mutant cockroaches compete with normal cells for central targets. Development. 115, 773-784 (1992).
- Blagburn, J. M. Co-factors and co-repressors of Engrailed: expression in the central nervous system and cerci of the cockroach, Periplaneta americana. Cell Tiss. Res. 327, 177-187 (2007).
- Blagburn, J. M., Gibbon, C. R., Bacon, J. P. Expression of engrailed in an array of identified sensory neurons: comparison with position, axonal arborization, and synaptic connectivity. J. Neurobiol. 28, 493-505 (1995).
- Booth, D., Marie, B., Domenici, P., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. Transcriptional control of behavior: engrailed knock-out changes cockroach escape trajectories. J. Neurosci. 29, 7181-7190 (2009).
- Schrader, S., Horseman, G., Cokl, A. Directional sensitivity of wind-sensitive giant interneurons in the cave cricket Troglophilus neglectus. J. Exp. Zool. 292, 73-81 (2002).
- Libersat, F., Goldstein, R. S., Camhi, J. M. Nonsynaptic regulation of sensory activity during movement in cockroaches. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8150-8154 (1987).
- Stern, M., Ediger, V. L., Gibbon, C. R., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. Regeneration of cercal filiform hair sensory neurons in the first-instar cockroach restores escape behavior. J. Neurobiol. 33, 439-458 (1997).
- Blagburn, J. M. Synaptic specificity in the first instar cockroach: patterns of monosynaptic input from filiform hair afferents to giant interneurons. J. Comp. Physiol A. 166, 133-142 (1989).
- Watanabe, H., Ai, H., Yokohari, F. Spatio-temporal activity patterns of odor-induced synchronized potentials revealed by voltage-sensitive dye imaging and intracellular recording in the antennal lobe of the cockroach. Front. Sys. Neurosci. (6), 55 (2012).
- Nishino, H., et al. Visual and olfactory input segregation in the mushroom body calyces in a basal neopteran, the American cockroach. Arthropod Struct. Dev. 41, 3-16 (2012).
- Elia, A. J., Gardner, D. R. Long-term effects of DDT on the behavior and central nervous system activity in Periplaneta americana. Pestic. Biochem. Physiol. 21, 326-335 (1984).
