Summary
Cet article décrit le cafard ventrale dissection du nerf de la moelle et des enregistrements extracellulaires du nerf et connecteurs cercal. Réponses évoquées sont générés par la stimulation électrique du nerf cercal ou stimulation mécanique directe de la cerques.
Abstract
Le ventrale préparation nerf de la moelle de cafard est un système souple pour les expériences de neuroéthologie, la modélisation des réseaux de neurones, et en testant les effets physiologiques d'insecticides. Cet article décrit le champ d'application de modalités sensorielles de blattes qui peuvent être utilisés pour analyser la façon dont un système nerveux des insectes répond aux perturbations de l'environnement. L'accent est mis ici sur le comportement de fuite médiée par cerques de transmission à fibre géant dans Periplaneta americana. Cette préparation in situ nécessite seulement des compétences de dissection modérée et l'expertise pour produire des enregistrements électrophysiologiques reproductibles de l'activité neuronale. Des peptides ou d'autres agents chimiques peuvent ensuite être appliqués directement sur le système nerveux en solution avec la solution saline physiologique. Insecticides peuvent aussi être administrés avant la dissection et le circuit d'échappement peuvent servir d'indicateur de l'état excité du système nerveux central. Dans ce contexte, les essais décrits ici peuvent aussi être utiles pour res chercheurs intéressés à la régénération des membres et l'évolution du développement du système nerveux pour laquelle P. americana est un organisme modèle établi.
Introduction
Il existe plus de 4000 espèces de blattes, mais seulement environ 30 sont des parasites domestiques. Peut-être la plus reconnue est la blatte américaine Periplaneta americana mal nommée qui est originaire d'Afrique, et on retrouve maintenant un peu partout sur la planète. En plus de sa vitesse rapide de course 1 et le comportement d'évitement, dans les régions tropicales P. americana est capable de voler 2,3.
Les caractéristiques prédominantes du système nerveux central de cafard (CNS) sont sa nature segmentée et la décentralisation des processus de contrôle de 4,5. Le cerveau, thoracique et abdominale ganglions sont reliés par les connecteurs interganglionic appariés pour former la corde nerveuse ventrale (VNC).
Les ganglions à chaque segment intègrent les centres. Elles sont composées d'une région externe, corticale contenant des cellules responsables de la perméabilité hémato-encéphalique barrière juste sous eux, et le corps cellulaires des neurones originaires en ce que ganglion. Ces corps cellulaires peuvent appartenir à des interneurones, neurones modulateurs ou des neurones moteurs. Ils fournissent des axones qui restent dans le ganglion d'origine (interneurones local), ou axones qui projettent entre les noyaux du système nerveux central (les interneurones interganglionic) ou qui se terminent sur les cellules musculaires périphérique (neurones moteurs). La plupart des corps cellulaires sont positionnés sur le ventre ou ventrolatéralement dans le cortex ganglionnaire 5. Les paires de connecteurs, interganglionic ne contiennent que des axones et aucun corps cellulaires neuronaux.
Le neuropil d'un ganglion contient des cellules gliales (névroglie), les secteurs de l'axone, faisceaux d'axones et des dendrites, (neurites de neurones). Le neuropile est dépourvue de corps cellulaires neuronaux. C'est la région dans le ganglion où la communication synaptique directe entre les cellules et l'intégration des entrées nerveuses se produit.
La capacité de la blatte américaine P. americana pour détecter et tout à coup face à un prédateur approche (pied, hand, etc.) a été attribué à un circuit réflexe qui consiste à cerques et le géant de 6,7 système de fibres. Le cerques sont une paire de cornes comme des structures de vent sensible situés à l'extrémité de l'abdomen (figure 1). Dans P. americana la surface ventrale de chaque Cercus contient environ 200 filiforme (fil) les poils qui sont organisés en 14 colonnes. Neuf de ces colonnes peut être systématiquement identifiées dans les différents animaux selon les propriétés de la cellule associée au récepteur et axone réponse. Chaque poil se trouve dans une douille qui lui permet de fléchir plus aisément dans un plan qui est spécifique colonne. Le mouvement de la chevelure dans une direction le long de son plan entraîne une dépolarisation de la cellule réceptrice et une salve des potentiels d'action (PA) dans le neurone sensoriel. Mouvement dans la direction opposée inhibe toute PA spontanées en cours 8. Le plan préféré de flexion et la directionnalité de la réponse est différente dans chaque colonne. Ainsi, la filiforcomplexes m cheveux récepteurs sont responsables non seulement pour détecter le mouvement de l'air, mais aussi pour «codage», sous la forme de points d'accès, la direction à partir de laquelle le courant d'air est originaire. Traitement de cette information par le système nerveux central se traduit par une réaction de fuite «approprié» 6,7. Cette spécificité fonctionnelle en forme de colonne des poils sensoriels est préservée d'un animal à.
La cellule réceptrice de chaque poil filiforme est responsable de la transduction de la déflexion mécanique des cheveux en un événement de neurones (donnant lieu à une explosion ou à l'inhibition de PA dans l'axone de la cellule du récepteur 9. Les PA se déplacent vers le ganglion abdominal terminal (A6) par l'intermédiaire cercal nerf XI, où ils font synapse avec les axones géants de la corde nerveuse ventrale (VNC). Les axones géants sont soupçonnés d'être responsables de la transmission et de l'excitation ultérieure des neurones moteurs qui se traduit par un comportement de fuite 6,10,11.
Le temps de latence du comportement of la réaction de fuite de P. americana est un des plus courts de tous les animaux 7. Latence de comportement est le temps entre l'arrivée d'un stimulus à un mécanorécepteurs et l'ouverture d'une réaction de fuite. Dans des expériences à l'aide de la cinématographie à grande vitesse pour enregistrer la tentative d'évasion d'un crapaud attaque, le cafard a été observée pour commencer son tour à partir du crapaud dans environ 40 ms (temps de début de l'extension de la langue à la blatte mouvement 7,12. Utilisation vent bouffées contrôlées , le temps de latence de comportement pourrait être réduit à 11 ms. D'autres expériences ont montré qu'une vitesse de bouffée de vent minimum de 12 mm / ms (avec une accélération de 600 mm / ms 2) peut évoquer une réaction de fuite, tandis que des vitesses encore plus faibles (3 mm / sec) causé cafards pour arrêter mobile 12 en marchant lentement.
La forte corrélation qui existe généralement entre les systèmes de fibres géantes et comportement de fuite a été bien documenté 13,14. Dans instances où une cellule particulière est nécessaire et suffisante pour évoquer un comportement particulier de la cellule est appelée une commande neurone 15,16. Interneurones géants (IG) dans le circuit d'échappement vent de P. americana ne sont pas nécessaires pour le réflexe. Les animaux qui ont subi une ablation IG expérimentalement présentent encore le comportement de fuite donc ces indications géographiques ne sont pas considérés comme des neurones de commande 17,18. Découpage des connecteurs col de l'utérus qui sont rostrale au circuit sensori-moteur influe également sur le comportement, indiquant que descendant entrée du cerveau a un effet sur le sens de la fuite 19. Ces aspects de la lutte amende et la redondance sont primordiaux pour la survie de l'organisme et sont complétées par modulation neurochimique par les amines biogènes 20.
Le P. americana nerf préparation de cordon a été un système de modèle élégant pour neuroethologists au cours des dernières décennies de nombreux commençant par le travail de pionnier de Roeder <sup> 21. Il permet aux étudiants d'enregistrer, d'afficher et d'analyser l'activité sensorielle primaire et les réponses qui en résultent par interneurones géants à leur 22,23,24 d'entrée. En plus de transmettre l'idée que les circuits neuronaux identifiables sous-tendent les réponses comportementales à l'environnement, ces exercices doivent inculquer une appréciation pour les contributions biologiques effectués par ce ravageur ménage commun.
Protocol
Une. Dissection
Solution saline cafard utilisé dans ce protocole a la composition suivante:
Solution saline cafard 36: (grammes pour 100 ml)
210 mM de NaCl (1,227 g)
MM KCl 2,9 (0,0216 g)
1,8 mM de CaCl 2 (0,0265 g)
0,2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g)
1,8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g)
(PH 7,2. Ajuster le pH avec du NaOH 1 M ou 1 M de HCl).
- Sélectionner un cafard mâle de la cuve de rétention qui a cerci robuste (figure 1). Les derniers segments de l'homme sont étroites par rapport à la femme, et ne contenant pas les ovaires et la masse des oeufs, les mâles sont plus faciles à disséquer. Les mâles de P. americana ont une paire de stylets courts entre la cerques. Ces stylets sont pas observées chez les femelles.
- Couper les ailes, les jambes et la tête et la broche du corps, face ventrale vers le haut, à une dish bordée d'élastomère de silicone.
- Avec des pinces ramasser les plaques ventrales et les couper avec des ciseaux fins, à partir de l'extrémité postérieure et antérieure de travail. Toujours garder les organes internes humide avec une solution saline, tout en essayant de garder le cerci sec. On peut utiliser de la cire ou des morceaux de caoutchouc pour positionner les haut de l'abdomen afin de prévenir la saline de mouiller le cerques. Si elles ne sont mouillées, séchez-les avec un morceau de papier de soie. Poussez sur le côté les organes internes et la substance blanche (corps gras). La VNC est au centre du champ, court le long de l'abdomen et doit être visible entre les trachées brillant. Le cordon nerveux est translucide et peut être initialement difficile de voir que l'éclairage est réglé correctement (Figure 2). NE PAS manipuler le VNC avec une pince ou des broches d'insectes, au lieu de manipuler à l'aide de sondes de verre.
- Dégagez le système de trachées de l'animal le mieux possible de la corde nerveuse avec une pince et d'une paire de nécessité de verre finles, divisé très soigneusement les connecteurs VNC longitudinalement entre A6 et A5 ou A5 et A4 ganglions (Figure 3). Cradle la cerques et l'abdomen vers le haut du bain de solution saline avec des épingles à insectes raccourcis et de la cire ou un coin de l'élastomère de silicone qui peut être coupé pour s'adapter à la préparation (figures 4A et B). Soyez très prudent dans le dernier segment abdominal de ne pas endommager les nerfs Cercal qui se projettent dans le ganglion (figures 2D et 5).
2. Enregistrement extracellulaire
- La préparation, microscope, et appareil d'enregistrement doit être disséqué installation dans une cage de Faraday pour bloquer particulier AC, les champs électriques externes, qui pourraient l'emporter sur les signaux des neurones (Figure 6).
- Placez le microscope de sorte qu'il est sur la platine du microscope. Une fois que la préparation est placée sur la scène, ajuster la position du faisceau d'éclairage de haute intensitépour une meilleure visualisation de celui-ci.
- Connectez l'amplificateur différentiel AC / DC à l'unité d'enregistrement de données intégrée (des détails sur les paramètres matériels et logiciels spécifiques ont été décrits précédemment 25). L'étape de maintien de tête d'une électrode d'aspiration doit être connecté à l'amplificateur. Un fil de masse d'argent qui a été enduit avec Cl - inséré dans les résultats de l'abdomen dans les enregistrements les plus stables. La raison en est que si la solution dans la cavité du corps n'est pas en contact avec le fluide de bain dans la cuvette, le fluide associé à l'électrode d'enregistrement qui reste reliée à la masse.
- Réglez la fréquence d'enregistrement à 4 kHz. Définir l'échelle de la tension (axe des y) à 500 mV (ce peut être ajustée pour optimiser la visualisation de la trace). Lancez le logiciel d'enregistrement en mode continu ou un oscilloscope pour enregistrer l'activité neuronale en réponse à des stimulations.
- Couper l'une des connecteurs VNC proches de A5 et placez l'extrémité de coupe attaché à A6 dans une électrode d'aspiration. Soyez sûr de pull solution saline dans l'électrode d'aspiration pour couvrir le fil d'argent à l'intérieur avant de sucer dans le nerf.
- Avec une pipette coup d'air sec sur les poils situés sur chaque Cercus. Voir si la stimulation des poils sur le ipsilatéral Cercus au conjonctif enregistrée donne une réponse différente de celle controlatéral. Prendre acte de l'amplitude des réponses reçues et du nombre de pics dans un intervalle de temps donné au cours de la stimulation.
- Déplacer l'électrode d'aspiration pour un nerf cercal pour l'enregistrement. Pour obtenir un meilleur ajustement, passer à une pointe d'électrode avec une ouverture plus petite si nécessaire.
- Couper le nerf cercal proche A6, puis aspirer le nerf menant à la Cercus. Il devrait y avoir la décharge spontanée des potentiels d'action. Maintenant, souffler de l'air sur la Cercus et noter les réponses.
3. Stimuler électriquement les nerfs sensoriels pour déterminer Recrutement
- Changer le logiciel d'enregistrement en mode balayage de sorte qu'il enregistre des traces (100-500 msec.) chaque fois qu'un stimulus est déclenchée.
- Relier l'électrode de stimulation à la sortie du stimulateur.
- Branchez le câble de stimulation avec les deux pistes ou des clips mini-crochet.
- Connecter la sortie de déclenchement BNC à partir du stimulateur à l'entrée de déclenchement de l'appareil d'enregistrement.
- Les paramètres de stimulation suivants devraient susciter une réponse: Durée: 0,3 s; Delay: 10 ms; Fréquence: 1 Hz; Tension: ajuster au besoin pour obtenir un signal dans les enregistrements (un peu plus de seuil et d'être en mesure d'obtenir une réponse maximale). Il n'y a aucune raison d'aller à des tensions beaucoup plus élevés que le seuil maximal pour le recrutement comme une tension élevée peut être dommageable pour le nerf.
- Couper le nerf cercal comme distale que possible afin que une longue racine nerveuse peut être tiré dans l'électrode de succion stimulante (figure 7, tête de flèche). Le conjonctif entre A6 et A5 ou un autre segment plus antérieure peut être utilisé.
- Réglez l'électrode d'enregistrement d'aspiration afin que vous puissiez puaurez-vous un connecteur de coupe dans l'électrode. Assurez-vous de tirer partie saline dans les électrodes d'aspiration pour couvrir le fil d'argent à l'intérieur avant de sucer dans les nerfs. Assurez-vous que l'électrode de stimulation est également fondé sur la saline de bain (dans l'abdomen près de A3 est idéal).
- Fournir une série de stimuli simples de tension croissante jusqu'à un potentiel d'action apparaît à l'écran. Il faut procéder à un enregistrement de la tension de stimulation minimale et la durée de recruter une réponse. Augmenter l'intensité jusqu'à ce qu'une réponse synaptique dans les connecteurs est observée. Le grand pic (des points d'accès extracellulaires) des axones géants apparaît d'abord, puis d'autres plus petits AP de peut aussi être observée.
Representative Results
Stimulation de poils sur le cerci par une bouffée d'air provoque des décharges des neurones sensoriels primaires qui peuvent être enregistrées en utilisant des électrodes extracellulaires d'aspiration fixés, soit de connecteurs entre ganglions abdominaux ou le nerf cercal lui-même (figure 8). amplitudes Spike enregistrées dans les deux régions sont de l'ordre de plusieurs micro-volts à millivolts. En raison de l'intégration sensorielle dans le ganglion le nombre de pics observés dans le potentiel d'action composite ou sous forme de pointes individuels enregistrés du nerf cercal est remarquablement plus grande que celle observée dans les enregistrements des connecteurs. Il faut toutefois noter également qu'il n'y a sensiblement moins de bruit dans l'enregistrement à l'conjonctif dû à la meilleure étanchéité entre l'électrode et le tissu nerveux.
En soufflant l'air dans les grandes pointes cerques peut être observé dans les connecteurs (figure 8A). En utilisant cette méthode de stimulation, les enregistrements entre A3 et A4 typique ment montrer une grande caractéristique de pic de la interneurones (s) géant. Enregistrement à partir d'un nerf cercal tout en frottant physiquement le cerci avec une pince a produit une forte buste d'activité (figure 8B 1). Dans un autre enregistrement, 2 bouffées d'air produites chaque une réponse rapide busting dans le nerf cercal (figure 8B 2). Lorsque la stimulation électrique du nerf cercal avec une électrode d'aspiration et l'enregistrement dans la conjonctif entre A3 et A4, on peut observer un certain seuil dans la stimulation de réponses évoquées (Figure 8C 1). La stimulation électrique du nerf cercal suscite manifestement une réponse dans les connecteurs qui peut être quantifiée pour les études de manipulation avec des agents pharmacologiques ou entoure la locale de l'environnement, tels que la température (figure 8C 2).
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Figure 1. Periplaneta americana avec cerci intact.
Figure 2. Vue ventrale de cafard corde nerveuse comme on le voit avec la cuticule ventrale retiré (A). Une vue agrandie du segment indiqué par les flèches est vu dans (B). En (C), les connecteurs ont été déversés entre les formats A4 et A3 avec une sonde de verre. Le 6ème ganglion abdominal est représenté en (D) avec les deux nerfs Cercal laissant à l'extrémité caudale.
Figure 3. Vue ventrale Schéma de cafard corde nerveuse.
Figure 4. L'cerques sont positionnés vers le haut hors du bain de solution saline. L'abdomen ouvert peuvent être inondées avec une solution saline (A) avec l'extrémité caudale du gardon être élevé avec une petite coincée pièce en forme d'élastomère de silicone afin de garder la cerci sur du bain (B).
Figure 5. Le 6 ème de ganglion abdominal avec le nerf cercal (indiqué par des flèches).
Figure 6. L'équipement mis en place. Cliquez ici pour voir larger figure.
Figure 7. Stimulant et l'électrode d'enregistrement mis en place.
Figure 8. Des enregistrements de neurones des connecteurs et le nerf cercal avec diverses procédures de stimulation. Enregistrement avec une électrode d'aspiration des connecteurs entre A3 et A4 en fumant à l'air cerques (A). Enregistrement des neurones Cercal primaires avec une électrode d'aspiration tout en frottant soit physiquement (B 1) ou de fournir des bouffées d'air (B 2) Résultats en rafales rapides de l'activité dans le nerf cercal. Stimulation électrique du nerf cercal produit des réponses dans les connecteurs (
Discussion
Une des raisons pour exposer les techniques de cette préparation classique est que le système de cerques a été et est un domaine de recherche actif dans le traitement des questions de développement des circuits neuronaux ainsi que des questions concernant la réparation et la régénération synaptique 26-31 encore. Soit la méthode d'évoquer l'activité dans le cafard chaîne nerveuse ventrale peut être utilisé pour examiner les effets des agents pharmacologiques ou des insecticides sur la fonction du système nerveux. Ces expériences sont effectuées par simple dissolution chimiques neuroactives dans une solution saline. Après un échange de cette solution avec le milieu de baignade normale, les changements dans l'activité évoquée ou spontanée peuvent être observés lors de l'enregistrement de connecteurs ou un nerf moteur pour donner une lecture cohérente de l'effet de la substance sur la fonction du système nerveux central.
Comme dans toutes les expériences neurophysiologiques un problème commun est le bruit électrique. Probablement le plus grand facteur de qualité de signal pour ces préparations is le joint d'étanchéité de l'électrode d'aspiration sur le tissu nerveux. Un joint d'étanchéité qui ne tire pas complètement dans le nerf cercal ou conjonctif est idéal. Les enregistrements peuvent aussi être effectuées avec des électrodes à double crochet placées sous la chaîne nerveuse et l'isolation du VNC avec un mélange d'huile minérale et de vaseline. Le mélange peut être chargé dans une seringue et expulsé autour de la chaîne nerveuse 32. Aussi une dissection minutieuse est aussi critique ici comme dans toute préparation CNS. Certains peuvent trouver plus facile d'accéder à la CNS en disséquant la cuticule dorsale. Si cela réduit le risque d'endommager le cordon nerveux ventral, il peut être plus difficile à enlever tous les viscères en utilisant cette approche.
Il n'est pas décrit ici mais cette préparation est prête à l'enregistrement intracellulaire dans les interneurones géants 32,33. L'ensemble du cordon nerveux peut également être retiré pour accueillir plusieurs électrodes d'enregistrement et stimulantes simultanément. En fait l'exploration du lobe antennaire, champignon body, et d'autres structures antérieures du système nerveux central est toujours en cours 34-35. Alors que le cafard CNS continue à faire la lumière sur la recherche neurobiologique moderne cette préparation particulière est assez simple pour être utilisé dans les laboratoires universitaires de premier cycle.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflits d'intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Hyewon Cooper pour les illustrations.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | 182 silicone elastomer kit |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| NaH2PO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Material Name | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt's brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
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