Summary
Questo articolo descrive la blatta ventrale nervo dissezione spinale e registrazioni extracellulari dal nervo Cercal e connettivi. Risposte evocate sono generate dalla stimolazione elettrica del nervo cercal o stimolazione meccanica diretta della cerci.
Abstract
La preparazione cordone nervoso ventrale scarafaggio è un sistema maneggevole per esperimenti Neuroethology, modellazione di reti neurali, e verificare gli effetti fisiologici di insetticidi. Questo articolo descrive l'ambito di scarafaggi modalità sensoriali che possono essere utilizzati per eseguire il test come un sistema nervoso degli insetti risponde alle perturbazioni ambientali. Enfasi è sul comportamento di fuga mediata da Cerci al gigante di trasmissione in fibra in Periplaneta americana. Questo in preparazione situ richiede solo abilità dissezione moderato e competenze elettrofisiologico per generare le registrazioni riproducibili di attività neuronale. Peptidi o altri reagenti chimici possono essere applicati direttamente al sistema nervoso in soluzione con la soluzione fisiologica. Insetticidi potrebbero anche essere somministrate prima della dissezione e il circuito di fuga possono servire come proxy per lo stato eccitabile del sistema nervoso centrale. In questo contesto i saggi qui descritti sarebbe anche utile per researchers interessati alla rigenerazione degli arti e l'evoluzione dello sviluppo del sistema nervoso per la quale P. americana è un organismo modello stabilito.
Introduction
Ci sono più di 4.000 specie di scarafaggio, ma solo 30 sono parassiti domestici. Forse il più noto è il nome sbagliato scarafaggio americano Periplaneta americana che ha avuto origine in Africa, e ora si trova quasi ovunque sul pianeta. Oltre alla sua rapida velocità di funzionamento 1 e comportamento sfuggente, nei tropici P. americana è capace di 2,3 volo.
Le caratteristiche predominanti del sistema nervoso centrale scarafaggio (CNS) sono la sua natura segmentata e la decentralizzazione del controllo processi 4,5. Il cervello, toracica, addominale e dei gangli sono uniti da connettivi interganglionic accoppiati per formare il cordone nervoso ventrale (VNC).
Il gangli in ogni segmento stanno integrando centri. Sono composte da una, regione corticale esterna contenente cellule responsabili della emato-encefalica permeabilità della barriera appena sotto di loro, e la somata dei neuroni originarinari in quel ganglio. Questi somata possono appartenere a interneuroni, neuroni modulatori, o neuroni motori. Essi forniscono assoni che rimangono all'interno del ganglio di origine (interneurone locale), o assoni che proiettano tra i gangli del sistema nervoso centrale (interneuroni interganglionic) o che terminano sulle cellule muscolari periferiche (neuroni motori). La maggior parte dei somata sono posizionati ventrale o ventrolaterally nella corteccia gangliare 5. Le coppie, connettivi interganglionic contengono solo assoni e corpi cellulari neuronali.
Il neuropil di un ganglio contiene cellule gliali (neuroglia), tratti di assoni, fasci di assoni, dendriti e neuriti () di neuroni. Il neuropil è privo di corpi cellulari neuronali. Questa è la regione all'interno del ganglio dove la comunicazione sinaptica diretta tra cellule nervose e integrazione di ingressi verifica.
La capacità del scarafaggio americano P. americana per rilevare e improvvisamente rispondere ad un predatore si avvicina (a piedi, hand, ecc.) è stata attribuita ad un circuito riflesso che consiste nella cerci e gigante 6,7 sistema fibra. Il cerci sono una coppia di strutture vento sensibili corno come vicino all'estremità dell'addome (Figura 1). In P. americana superficie ventrale di ogni cercus contiene circa 200 filiforme (thread) peli che sono organizzati in 14 colonne. Nove di queste colonne può individuare in modo coerente in diversi animali secondo le proprietà di risposta della cellula recettore associato e assone. Ogni capello è in una presa che permette di piegare più facilmente in un piano che è specifica colonna. Movimento dei capelli in una direzione lungo il suo piano induce una depolarizzazione nella cella recettore e una raffica di potenziali di azione (AP) nel neurone sensoriale. Il movimento nella direzione opposta inibisce qualsiasi AP spontanee in corso 8. L'aereo preferito di deflessione e direzionalità della risposta è differente in ciascuna colonna. Così, il filiforcomplessi m capelli-recettore sono responsabili non solo per rilevare il movimento di aria, ma anche per 'codifica', sotto forma di punti di accesso, la direzione dalla quale la corrente d'aria origine. Trattamento di tali informazioni da parte del CNS si traduce in un 'appropriata' la risposta di fuga 6,7. Questo funzionale, specificità colonnare dei peli sensori è preservata da un animale all'altro.
La cella recettore di ogni capello filiforme è responsabile per trasdurre la deformazione meccanica dei capelli in un evento neurale (risultante in un burst o inibizione di AP nel l'assone recettore 9. L'AP viaggiano al ganglio addominale terminale (A6) tramite cercal XI nervo, dove sinapsi con assoni giganti del cordone nervoso ventrale (VNC). Gli assoni giganti sono da ritenersi responsabili per la trasmissione e la successiva eccitazione dei neuroni motori che si traduce in un comportamento di fuga 6,10,11.
Il comportamento di latenza of la risposta di fuga di P. americana è uno dei più brevi di qualsiasi animale 7. Latenza comportamentale è il tempo tra l'arrivo di uno stimolo a meccanorecettori e l'inizio della risposta di fuga. In esperimenti usando la cinematografia ad alta velocità per registrare il tentativo di fuga da un rospo attaccare, lo scarafaggio è stato osservato per iniziare il suo turno di distanza dal rospo in circa 40 msec (tempo dall'inizio della proroga lingua per scarafaggio movimento 7,12. Usando soffi di vento controllate , la latenza comportamentale potrebbe essere ridotto a 11 msec. Altri esperimenti hanno rivelato che un soffio velocità del vento minima di 12 mm / msec (con un'accelerazione pari a 600 mm / msec 2) può evocare una risposta di fuga, mentre velocità ancora più basse (3 mm / sec) causato camminando lentamente scarafaggi per fermare movimento 12.
La forte correlazione che esiste tipicamente tra sistemi a fibre giganti e comportamenti di fuga è stato ben documentato 13,14. In instrecchi dove è necessario e sufficiente per evocare un particolare comportamento una determinata cella la cella viene indicato come un comando neurone 15,16. Interneuroni giganti (IG) nel circuito fuga vento di P. americana non sono necessari per il riflesso. Gli animali che hanno sperimentalmente ablati IG ancora mostrano il comportamento di fuga, pertanto questi soldati non sono considerati i neuroni di comando 17,18. Severing connettivi cervicali che sono rostrale al circuito sensomotorio influenza anche il comportamento, indicando che discendente input dal cervello ha un effetto sulla direzione di fuga 19. Questi aspetti di un controllo preciso e ridondanza sono di primaria importanza per la sopravvivenza dell'organismo e sono completati dalla modulazione neurochimica via ammine biogene 20.
Il P. preparazione del cavo americana nervo è stato un elegante sistema modello per neuroethologists nel corso degli ultimi decenni a partire con il lavoro pionieristico di Roeder <sup> 21. Permette agli studenti di registrare, visualizzare e analizzare l'attività sensoriale primaria e quelli risultanti dagli interneuroni giganti per la loro 22,23,24 input. Oltre a trasmettere l'idea che i circuiti neurali alla base identificabili risposte comportamentali per l'ambiente, questi esercizi dovrebbero infondere un apprezzamento per i contributi biologiche fatte da questo parassita comune della famiglia.
Protocol
1. Dissezione
Soluzione salina scarafaggio utilizzata in questo protocollo ha la seguente composizione:
Cockroach soluzione salina 36: (grammi per 100 ml)
210 mM NaCl (1.227 g)
2.9 mM KCl (0,0216 g)
1.8 mM CaCl 2 (0,0265 g)
0.2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g)
1.8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g)
(PH 7.2. Regolare il pH con 1 M NaOH o 1 M HCl).
- Selezionare uno scarafaggio maschio dalla serbatoio che ha robuste Cerci (Figura 1). Gli ultimi segmenti del maschio sono strette rispetto alla femmina, e non contenenti ovaie e massa uovo, i maschi sono più facili da sezionare. I maschi di P. americana hanno un paio di short stili tra i cerci. Questi stili non sono osservati nelle femmine.
- Tagliare le ali, le gambe e la testa e il pin del corpo, ventrale rivolta verso l'alto, ad una dish allineato con elastomero di silicone.
- Con pinze raccogliere le piastre ventrali e tagliarli fuori con le forbici sottili, a partire dalla fine posteriore e di lavoro anteriormente. Tenere sempre gli organi interni umido con soluzione salina, cercando di mantenere il cerci asciutto. Si può utilizzare cera o pezzi di gomma per posizionare gli addome verso l'alto per evitare che la soluzione salina dalla bagnando il cerci. Se non si bagnano, asciugarle con un pezzo di carta velina. Premere il lato gli organi interni e la materia bianca (grasso corporeo). Il VNC è al centro del campo, corre lungo l'addome e dovrebbe essere visibile tra le trachee lucido. Il cordone nervoso è trasparente e può inizialmente essere difficile da vedere finché l'illuminazione è regolata correttamente (Figura 2). NON maneggiare il VNC con una pinza o perni di insetti, invece manipolarla con sonde di vetro.
- Sgombrare il sistema trachee dell'animale nel miglior modo possibile dal cordone nervoso con una pinza e con un paio di bisogno buon bicchiereles, con molta attenzione contempla i connettivi VNC longitudinalmente tra A6 e A5 o A5 e A4 gangli (Figura 3). Culla della cerci e l'addome verso l'alto fuori dalla vasca salina con perni di insetti accorciato e cera o un cuneo di elastomero di silicone che può essere tagliato per adattarsi alla preparazione (Figure 4A e B). Prestare la massima attenzione nel segmento addominale ultima a non danneggiare i nervi Cercal che proiettano nel ganglio (figure 2D e 5).
2. Registrazione extracellulare
- La preparazione, microscopio, e la registrazione apparecchio sezionato dovrebbe essere impostato all'interno di una gabbia di Faraday, in particolare per bloccare AC, campi elettrici esterni che potrebbero ignorare segnali dai neuroni (Figura 6).
- Posizionare il microscopio in modo che si affaccia sul palco microscopio. Una volta che il preparato viene posto sul piatto, regolare la posizione del fascio ad alta intensità illuminatoreper un'ottima visualizzazione di esso.
- Collegare l'amplificatore differenziale AC / DC per l'unità di registrazione integrata di dati (informazioni dettagliate sulle impostazioni hardware e software specifici sono stati precedentemente descritto 25). Lo stadio testa in possesso di un elettrodo di aspirazione deve essere collegato all'amplificatore. Un filo di terra argento che è stato rivestito con Cl - inserito nei risultati addome in registrazioni più stabili. La ragione è che se la soluzione nella cavità del corpo non è a contatto con il fluido di balneazione nel piatto, il fluido associato con l'elettrodo di registrazione rimane a terra.
- Impostare la frequenza di registrazione a 4 kHz. Impostare la scala di tensione (asse y) a 500 mV (questo può essere regolata per ottimizzare la visualizzazione della traccia). Eseguire il software di registrazione in modalità continua o oscilloscopio per registrare l'attività neurale in risposta agli stimoli.
- Tagliare uno dei connettivi VNC vicino alla A5 e posizionare l'estremità tagliata collegato a A6 in un elettrodo di aspirazione. Assicurati di pull salina nel elettrodo di aspirazione a coprire il filo d'argento al suo interno prima di succhiare nel nervo.
- Con una pipetta soffio d'aria secca a peli situati su ogni cercus. Vedere se stimolando i peli sul omolaterale cercus al connettivo registrato dà una risposta diversa da quella controlaterale. Prendere atto dell'ampiezza delle risposte e il numero di punte in un dato intervallo di tempo durante la stimolazione.
- Spostare l'elettrodo di aspirazione ad un nervo Cercal per la registrazione. Per ottenere una migliore vestibilità, passa a un elettrodo con una minore apertura, se necessario.
- Tagliare il nervo vicino Cercal a A6 e poi aspirare il nervo che porta alla cercus. Ci dovrebbe essere scarica spontanea dei potenziali d'azione. Ora, soffiare aria sul cercus e annotare le risposte.
3. Elettricamente Stimolare i nervi sensoriali per determinare Recruitment
- Cambiare il software di registrazione in modalità a spazzare in modo che registra le tracce (100-500 MSEc.) ogni volta che uno stimolo viene attivato.
- Collegare l'elettrodo stimolante all'uscita dello stimolatore.
- Collegare il cavo stimolatore con i due cavi mini-gancio o clip.
- Collegare l'uscita del trigger BNC dallo stimolatore per l'ingresso trigger sull'unità di registrazione.
- I seguenti parametri di stimolazione dovrebbe evocare una risposta: Durata: 0,3 sec; Delay: 10 msec; frequenza: 1 Hz; Tensione: regolare come necessario per ottenere un segnale nelle registrazioni (poco più di soglia e di essere in grado di ottenere una risposta massima). Non c'è motivo di andare a tensioni molto più alte della soglia massima per l'assunzione come alta tensione può essere dannoso per il nervo.
- Tagliare il nervo cercal come distale possibile in modo che una lunga radice nervosa può essere tirato nel elettrodo di aspirazione stimolante (Figura 7, freccia testa). Il connettivo tra A6 e A5 o altro segmento più anteriore può essere utilizzato.
- Impostare l'elettrodo di aspirazione di registrazione in modo da poter pull una connettivo tagliato l'elettrodo. Assicurati di tirare qualche soluzione salina nelle elettrodi di aspirazione per coprire il filo d'argento al suo interno prima di succhiare nei nervi. Assicurarsi che l'elettrodo stimolante è anche radicata nella salina bagno (nell'addome vicino A3 è l'ideale).
- Fornire una serie di singoli stimoli di crescente tensione finché non appare un potenziale d'azione sullo schermo. Si dovrebbe fare una registrazione della minima tensione stimolante e la durata di reclutare una risposta. Aumentare l'intensità fino a quando si osserva una risposta sinaptica nei connettivi. Il grande spike (AP extracellulari) dagli assoni giganti appare per la prima, e poi altri più piccoli AP può anche essere osservato.
Representative Results
La stimolazione dei peli sul cerci da un soffio d'aria provoca scarichi di neuroni sensoriali primari che possono essere registrate mediante elettrodi di aspirazione extracellulari attaccati sia per connessioni tra gangli addominale o il nervo Cercal stessa (Figura 8). Ampiezze picco registrate dalle due regioni sono dell'ordine di alcuni microorganismi volt a millivolt. A causa di integrazione sensoriale nel ganglio del numero di picchi osservati nel potenziale d'azione composto o come singoli picchi registrati dal nervo Cercal è notevolmente maggiore rispetto a quella osservata nelle registrazioni dei connettivi. Tuttavia anche notare che è sostanzialmente meno rumore nella registrazione al connettivo dovuta alla tenuta migliore tra l'elettrodo e il tessuto nervoso.
Con sbuffando dell'aria nelle grandi picchi Cerci può essere osservato nei connettivi (Figura 8A). Usando questo metodo stimolante, registrazioni tra A3 e A4 tipica mostra ly una grande caratteristica di punta del interneurone gigante (s). Registrazione da un nervo cercal mentre fisicamente strofinando la cerci con una pinza prodotto una forte busto di attività (Figura 8B 1). In un'altra registrazione, 2 sbuffi d'aria ogni prodotto una risposta rapida busting nel nervo Cercal (Figura 8B 2). Quando stimolando elettricamente il nervo cercal con un elettrodo di aspirazione e la registrazione nel connettivo tra A3 e A4, si può osservare una soglia nella stimolazione di risposte evocate (Figura 8C 1). La stimolazione elettrica del nervo cercal chiaramente suscita una risposta in connettivi che può essere quantificata per gli studi di manipolazione con agenti farmacologici o circonda la ambientale locale, quali la temperatura (Figura 8C 2).
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Figura 1. Americana Periplaneta con cerci intatto.
Figura 2. Vista ventrale del cordone nervoso scarafaggio come si è visto con la cuticola ventrale rimosso (A). Una vista ingrandita del segmento indicato dalle frecce è visto in (B). In (C) i connettivi si sono riversate tra A4 e A3 con una sonda di vetro. Il 6 ° ganglio addominale è mostrato in (D) con i due nervi Cercal lasciando alla fine caudale.
Figura 3. Schema vista ventrale del cordone nervoso scarafaggio.
Figura 4. L'cerci sono posizionati verso l'alto fuori dalla vasca salina. L'addome aperte possono essere inondate con soluzione salina (A) con l'estremità caudale del scarafaggio essere elevato con un piccolo pezzo di forma incuneata elastomero di silicone per mantenere la cerci out del bagno (B).
Figura 5. Il 6 ° ganglio addominale con il nervo Cercal (indicato dalle frecce).
Figura 6. L'apparecchiatura istituito. Clicca qui per vedere larger figura.
Figura 7. Stimolante ed elettrodo di registrazione impostati.
Figura 8. Registrazioni neurali dei connettivi e nervo cercal con varie procedure di stimolazione. Registrazione con un elettrodo di aspirazione dalle connessioni tra A3 e A4, mentre fumano aria alla Cerci (A). Registrazione da neuroni Cercal primarie con un elettrodo di aspirazione, mentre sia fisicamente sfregamento (B 1) o la fornitura di sbuffi d'aria (B 2) Risultati in rapide sequenze di attività nel nervo Cercal. Elettricamente stimolando il nervo Cercal produce risposte a connettivi (
Discussion
Una delle ragioni per le tecniche di esporre per questa preparazione classica è che il sistema cerci è stato ed è una zona attiva di ricerca per affrontare questioni dello sviluppo di circuiti neurali nonché le questioni riguardanti la riparazione e la rigenerazione sinaptica 26-31. Entrambi i metodi di evocare attività nel cordone nervoso ventrale scarafaggio può essere usato per esaminare gli effetti di agenti farmacologici o insetticidi in funzione del sistema nervoso. Questi esperimenti sono fatti semplicemente sciogliendo sostanze chimiche neuroattivi in salina. Dopo lo scambio di questa soluzione con il normale mezzo di balneazione, si possono osservare i cambiamenti nell'attività evocata o spontanea durante la registrazione da connettivi o un nervo motore per dare una lettura coerente dell'effetto della sostanza chimica sulla funzione del sistema nervoso centrale.
Come in tutti gli esperimenti neurofisiologici un problema comune è il rumore elettrico. Probabilmente il più grande fattore di qualità del segnale per queste preparazioni is la guarnizione elettrodo di aspirazione sul tessuto nervoso. La tenuta stagna che non completamente disegnare nel nervo Cercal o connettivo è l'ideale. Le registrazioni possono essere effettuate anche con elettrodi doppio gancio posto sotto il cordone nervoso e isolando il VNC con una miscela di olio minerale e petrolato. La miscela può essere caricato in una siringa ed espulso tutto il cordone nervoso 32. Anche una dissezione accurata è critico qui come in qualsiasi preparazione CNS. Alcuni potrebbero trovare più facile per accedere al sistema nervoso centrale sezionando la cuticola dorsale. Mentre questo riduce la possibilità di danneggiare il cordone nervoso ventrale può essere più difficile da rimuovere tutti i visceri utilizzando questo approccio.
Non è descritto qui, ma questa preparazione è suscettibile di registrazione intracellulare nelle interneuroni giganti 32,33. L'intero cordone nervoso può anche essere rimosso per accogliere vari elettrodi di registrazione e stimolante allo stesso tempo. In esplorazione fatto della Lobe antenne, funghi body, e altre strutture del sistema nervoso centrale anteriore è ancora in corso 34-35. Mentre lo scarafaggio CNS continua a far luce sulla moderna ricerca neurobiologica questa particolare preparazione è abbastanza semplice da essere utilizzato in laboratori accademici universitari.
Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi siano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Hyewon Cooper per le illustrazioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | 182 silicone elastomer kit |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| NaH2PO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Material Name | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt's brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
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